CN104371924A - 一种抗病增产复合微生物菌剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种抗病增产复合微生物菌剂的制备方法，涉及一种复合微生物菌剂的制备方法。是要解决现有的菌剂功能单一，保质期短的问题。方法：一、将粉煤灰和腐殖酸混合灭菌，得吸附载体；二、荧光假单胞菌接种到金氏B培养基中培养，制备荧光假单胞菌培养液；制备荧光假单胞菌种子液；发酵罐发酵得荧光假单胞菌发酵液；将荧光假单胞菌发酵液与吸附载体混合，得含荧光假单胞菌的粉剂；三、胶质芽孢杆菌接种到培养基中培养，制备胶质芽孢杆菌培养液；制备胶质芽孢杆菌种子液；发酵罐培养，得胶质芽孢杆菌发酵液；将胶质芽孢杆菌发酵液与吸附载体混合，得到含胶质芽孢杆菌的粉剂；四、菌种复配，制成微生物复合菌剂粉剂。用于作物抗病增产。

Description

一种抗病增产复合微生物菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及一种复合微生物菌剂的制备方法。
背景技术
化肥是提高粮食产量的主要因素之一，多年来过多及不合理的施用导致土壤板结、地力下降、病害严重及品质下降。另一方面，随着科技与经济的不断发展，人们对生活水平的要求也在不断提高，对农产品提出了多样化、优质化、无害化的需求，绿色安全食品已成为消费的热点和时尚。改善环境、发展生态农业，迫切需要提高种植技术，彻底改变以往依靠大量使用化肥农药提高农作物产量，生产高量低质产品的作法，严格限制农药、化肥的使用量。微生物肥料产品因其具有改良土壤、降低农作物产品的农药残留，刺激作物生长与提高作物品质等多重功能而得到越来越广泛地应用，成为发展生态农业、生产绿色食品的主要施肥品种之一，应用面积逐年扩大，显示出良好的发展前景。
此外，农业生产中病、虫、草、鼠四大威胁，尤其是病害每年对农业生产的收成造成巨大的损失，据统计病菌病害每年使农作物减产10％～20％，目前主要以化学防治为主，然而化学农药带来的环境污染，农药残留以及病菌抗药性等一系列问题日趋严重，是制约农业产业转向绿色发展之路的瓶颈，迫使人们在尽量科学应用化学农药、加强品种抗病性研究的同时，也在不断寻求新的防治措施。生物防治作为植物病害管理系统的一项重要措施有其固有的优势。生物防治环境和谐、无污染、无残留，作用机制复杂，不易产生抗药性，符合市场对绿色农产品的需求，因此开发环保、高效的生物农药具有重要意义。目前生物农药的发展已迅速崛起，成为农资产业的一支生力军。目前我国农药耗用量每年达150万吨以上，如生物农药使用量占到农药总数的30％。也就是说，生物农药使用量每年达45万吨～50万吨，而目前我国生物农药产量仅8-12万吨，市场发展潜力巨大。
发明内容
本发明是要解决现有的菌剂功能单一，保质期短的问题，提供一种抗病增产复合微生物菌剂的制备方法。
本发明抗病增产复合微生物菌剂的制备方法，按以下步骤进行：
一、将粉煤灰和腐殖酸按重量比为4:6均匀混合灭菌，得到吸附载体；
二、用接种环挑取荧光假单胞菌接种到5mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，然后将荧光假单胞菌划线接种到金氏B培养基平板上，于30℃培养箱中培养18h，挑取单菌落再次接种到装有5mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，得荧光假单胞菌培养液；将荧光假单胞菌培养液按照体积百分比5％的接种量接种到100mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，得荧光假单胞菌种子液；然后将荧光假单胞菌种子液全部接种到含有30L金氏B培养基的发酵罐中，连续培养24小时，得荧光假单胞菌发酵液；
将荧光假单胞菌发酵液与吸附载体混合，荧光假单胞菌发酵液的重量为吸附载体重量的10％，得到含荧光假单胞菌的粉剂；
三、用接种环挑取胶质芽孢杆菌接种到5mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，然后将胶质芽孢杆菌划线接种到培养基平板上，于31℃培养箱中培养18h，挑取单菌落再次接种到5mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，得胶质芽孢杆菌培养液；将胶质芽孢杆菌培养液按照体积百分比5％的接种量接种到100mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，得胶质芽孢杆菌种子液；然后将胶质芽孢杆菌种子液全部接种到含有30L培养基的发酵罐中，连续培养24小时，得胶质芽孢杆菌发酵液；
将胶质芽孢杆菌发酵液与吸附载体混合，胶质芽孢杆菌发酵液的重量为吸附载体重量的10％，得到含胶质芽孢杆菌的粉剂；
四、菌种复配：
将含荧光假单胞菌的粉剂与含胶质芽孢杆菌的粉剂复配均匀，其中荧光假单胞菌与胶质芽孢杆菌的重量比为8:2，制成微生物复合菌剂粉剂。
所述荧光假单胞菌为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，所述胶质芽孢杆菌为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)，均购买自北京双龙阿姆斯科技有限公司。
本发明采用现代生物工程技术，利用本项目的相关农用微生物农药制剂研究成果，以荧光假单胞菌(抗病菌株)和硅酸盐细菌(增产菌株)作为重点研究对象，以减少农药、化肥用量、提高作物品质与产量、改善土壤生态环境等为目标，研究建立相应的生产工艺及配方，通过多点次田间试验，形成配套应用技术，减轻因施用化肥、农药而造成的环境污染日益加重的现状。
本发明的优点：本发明所制备的复合菌剂能减少化肥用量20％；抑制土传病害的发生，防效达60％以上；改善作物品质，提高产量10％左右。本复合菌剂通过代谢产生多种次级代谢产物，对蔬菜作物常见的枯萎病、晚疫病、灰霉病，恶菌病等有良好的抑制作用，同时也可以产生多种激素类物质，刺激作物生长发育，增加作物产量，充分发挥微生物间的协同、互补、增强作用，达到既增产又抗病的双重功效。因此该复合菌剂具有安全、高效、广谱和效果稳定的优势，在田间应用可同时发挥肥和药的功能，简化使用程序。
本发明的复合菌剂能有效抑制作物根际病原真菌和细菌产生的病害，同时具有增产效果。经多地区、多种作物田间试验，土壤传播病害发病率可控制在10％以下，增产达10％左右，优于国内其他微生物制剂产品。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式抗病增产复合微生物菌剂的制备方法，按以下步骤进行：
一、将粉煤灰和腐殖酸按重量比为4:6均匀混合灭菌，得到吸附载体；
二、用接种环挑取荧光假单胞菌接种到5mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，然后将荧光假单胞菌划线接种到金氏B培养基平板上，于30℃培养箱中培养18h，挑取单菌落再次接种到装有5mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，得荧光假单胞菌培养液；将荧光假单胞菌培养液按照体积百分比5％的接种量接种到100mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，得荧光假单胞菌种子液；然后将荧光假单胞菌种子液全部接种到含有30L金氏B培养基的发酵罐中，连续培养24小时，得荧光假单胞菌发酵液；
将荧光假单胞菌发酵液与吸附载体混合，荧光假单胞菌发酵液的重量为吸附载体重量的10％，得到含荧光假单胞菌的粉剂；
三、用接种环挑取胶质芽孢杆菌接种到5mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，然后将胶质芽孢杆菌划线接种到培养基平板上，于31℃培养箱中培养18h，挑取单菌落再次接种到5mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，得胶质芽孢杆菌培养液；将胶质芽孢杆菌培养液按照体积百分比5％的接种量接种到100mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，得胶质芽孢杆菌种子液；然后将胶质芽孢杆菌种子液全部接种到含有30L培养基的发酵罐中，连续培养24小时，得胶质芽孢杆菌发酵液；
将胶质芽孢杆菌发酵液与吸附载体混合，胶质芽孢杆菌发酵液的重量为吸附载体重量的10％，得到含胶质芽孢杆菌的粉剂；
四、菌种复配：
将含荧光假单胞菌的粉剂与含胶质芽孢杆菌的粉剂复配均匀，其中荧光假单胞菌与胶质芽孢杆菌的重量比为8:2，制成微生物复合菌剂粉剂。
本实施方式制备的复合微生物菌剂，是以抗病菌株-荧光假单胞菌和增产菌株-硅酸盐细菌进行复配组合，使其发挥多重功效，提高抗病能力、促生、降解、活化功能，其对多种真菌、细菌性病害具有良好的防治作用。能减少化肥用量20％；抑制土传病害的发生，防效达60％以上；改善作物品质，提高产量10％左右。同时可使产品保质期延长到一年以上。形成适合本土的兼有“药-肥”合一功能的新型微生物制剂，减轻因施用化肥、化学农药而造成的环境污染日益加重的现状。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中金氏B培养基由20g蛋白胨、1.5g磷酸氢二钾、1.5g硫酸镁、10g琼脂和1000mL无菌水组成，pH值为7.2±0.2。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中发酵罐中培养温度为28.5℃。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三所述培养基由0.2g KH2PO4、0.8g K2HPO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.1g CaSO4·2H2O、0.01gNa2MoO4·2H2O、0.5g酵母、20g甘露醇、0.01g FeCl3和1000mL水组成，pH值为7.0～7.4。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中发酵罐中培养温度为30℃。其它与具体实施方式一至四之一相同。
实施例1：
本实施例抗病增产复合微生物菌剂的制备方法，按以下步骤进行：
一、将粉煤灰和腐殖酸按重量比为4:6均匀混合灭菌，得到吸附载体；
二、用接种环挑取荧光假单胞菌接种到装有5mL金氏B培养基的试管中，于30℃、150r/min振荡培养18h，然后将荧光假单胞菌划线接种到金氏B培养基平板上，于30℃培养箱中培养18h，挑取单菌落再次接种到装有5mL金氏B培养基的试管中，于30℃、150r/min振荡培养18h，得荧光假单胞菌培养液；将荧光假单胞菌培养液按照体积百分比5％的接种量接种到100mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，得荧光假单胞菌种子液；配制30L金氏B培养基，转入30L发酵罐中，经过121℃20分钟高温灭菌，冷却到28.5℃保持恒温，然后将荧光假单胞菌种子液全部接种到发酵罐中，连续培养24小时，得荧光假单胞菌发酵液；荧光假单胞菌发酵液中活菌数达50亿/mL以上；
将荧光假单胞菌发酵液与吸附载体混合，荧光假单胞菌发酵液的重量为吸附载体重量的10％，得到含荧光假单胞菌的粉剂；
所述金氏B培养基由20g蛋白胨、1.5g磷酸氢二钾、1.5g硫酸镁、10g琼脂和1000mL无菌水组成，pH值为7.2±0.2。
三、用接种环挑取胶质芽孢杆菌接种到装有5mL培养基的试管中，于31℃、150r/min振荡培养18h，然后将胶质芽孢杆菌划线接种到培养基平板上，于31℃培养箱中培养18h，挑取单菌落再次接种到装有5mL培养基的试管中，于31℃、150r/min振荡培养18h，得胶质芽孢杆菌培养液；将胶质芽孢杆菌培养液按照体积百分比5％的接种量接种到100mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，得胶质芽孢杆菌种子液；配制30L培养基，转入30L发酵罐中，经过121℃20分钟高温灭菌，冷却到30℃保持恒温，然后将胶质芽孢杆菌种子液全部接种到发酵罐中，连续培养24小时，得胶质芽孢杆菌发酵液；胶质芽孢杆菌发酵液中活菌数达50亿/mL以上；
将胶质芽孢杆菌发酵液与吸附载体混合，胶质芽孢杆菌发酵液的重量为吸附载体重量的10％，得到含胶质芽孢杆菌的粉剂；
步骤三所述培养基由0.2g KH2PO4、0.8g K2HPO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.1gCaSO4·2H2O、0.01g Na2MoO4·2H2O、0.5g酵母、20g甘露醇、0.01g FeCl3和1000mL水组成，pH值为7.0～7.4。
四、菌种复配：
将含荧光假单胞菌的粉剂与含胶质芽孢杆菌的粉剂复配均匀，其中荧光假单胞菌与胶质芽孢杆菌的重量比为8:2，制成微生物复合菌剂粉剂，活菌数≥5亿/克。
所述荧光假单胞菌为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，所述胶质芽孢杆菌为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)，均购买自北京双龙阿姆斯科技有限公司。
为验证本实施例的有益效果进行以下试验：
试验1：本实施例抗病增产复合微生物菌剂在青椒上的田间试验报告(时间2013.4—2013.7，地点：黑龙江省鸡西市)
一、试验方案和方法：本实验设两个处理，不设重复。
处理1试验田：常规施肥+供试菌剂；
处理2对照田：常规施肥+等量清水。
试验田面积1亩，对照田面积1亩。其它管理措施保持一致。
供试菌剂施用方法和施用时间：每亩用量5公斤，在青椒座果期开始，每隔7天随灌水冲施，共冲施2次。
二、试验结果：
试验田青椒在常规施肥的基础上喷施高技术研究院提供的生物菌剂，比对照田在常规施肥的基础上喷施等量清水亩增产437.36千克，增产率13.57％，降低发病率8.2％，投入产出比为1:48.60。
试验2：微生物复合菌剂在番茄上田间小区实验(时间：2013.2-2013.6，地点：黑龙江省哈尔滨市阿城区)
一、试验设计：试验分别设计3个处理，3次重复，共计9个试验小区，小区面积30平方米，各小区随机排列，设保护行。
二、试验处理：
K1：常规施肥+冲施菌剂；K2：常规施肥+冲施等量清水；CK：常规施肥。
施肥方法：①常规施肥：底肥为农家肥500kg/亩、尿素25kg/亩、磷二铵25kg/亩；追肥2次，每次施尿素10kg/亩；②冲施菌剂：共冲施二次，分别在苗期和采收前，每次冲施5公斤/亩(1：100稀释)③冲施等量清水：共冲施二次，时期与喷施菌剂相同。
三、试验结果：
本实施例的微生物复合菌剂对番茄进行冲施，可提高坐果率，增加产量10.3％；有效改善品质，降低发病率为6.4％。
试验3：微生物复合菌剂在黄瓜上田间小区实验(时间：2014.2-2014.7，地点：哈尔滨市阿城区)
一、试验设计：试验分别设计3个处理，3次重复，共计9个试验小区，小区面积30平方米，各小区随机排列，设保护行。
二、试验处理：K1：常规施肥+冲施复合菌剂；K2：常规施肥+冲施等量清水；CK：常规施肥。
施肥方法：①常规施肥：底肥为农家肥450kg/亩、尿素20kg/亩、磷二铵30kg/亩；追肥2次，每次施尿素10kg/亩；②冲施复合菌剂：共喷施二次，分别在苗期和采收前，每次喷施5公斤/亩(1：100稀释)③冲施等量清水：共冲施二次，时期与冲施复合菌剂相同。
三、试验结果：
本实施例的微生物复合菌剂对黄瓜进行冲施，可提高坐果率，增加产量11.9％；有效改善品质，降低发病率达9.6％。

Claims (5)

1.一种抗病增产复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于该制备方法，按以下步骤进行：
一、将粉煤灰和腐殖酸按重量比为4:6均匀混合灭菌，得到吸附载体；
二、用接种环挑取荧光假单胞菌接种到5mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，然后将荧光假单胞菌划线接种到金氏B培养基平板上，于30℃培养箱中培养18h，挑取单菌落再次接种到装有5mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，得荧光假单胞菌培养液；将荧光假单胞菌培养液按照体积百分比5％的接种量接种到100mL金氏B培养基中，于30℃、150r/min振荡培养18h，得荧光假单胞菌种子液；然后将荧光假单胞菌种子液全部接种到含有30L金氏B培养基的发酵罐中，连续培养24小时，得荧光假单胞菌发酵液；
将荧光假单胞菌发酵液与吸附载体混合，荧光假单胞菌发酵液的重量为吸附载体重量的10％，得到含荧光假单胞菌的粉剂；
三、用接种环挑取胶质芽孢杆菌接种到5mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，然后将胶质芽孢杆菌划线接种到培养基平板上，于31℃培养箱中培养18h，挑取单菌落再次接种到5mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，得胶质芽孢杆菌培养液；将胶质芽孢杆菌培养液按照体积百分比5％的接种量接种到100mL培养基中，于31℃、150r/min振荡培养18h，得胶质芽孢杆菌种子液；然后将胶质芽孢杆菌种子液全部接种到含有30L培养基的发酵罐中，连续培养24小时，得胶质芽孢杆菌发酵液；
将胶质芽孢杆菌发酵液与吸附载体混合，胶质芽孢杆菌发酵液的重量为吸附载体重量的10％，得到含胶质芽孢杆菌的粉剂；
四、菌种复配：
将含荧光假单胞菌的粉剂与含胶质芽孢杆菌的粉剂复配均匀，其中荧光假单胞菌与胶质芽孢杆菌的重量比为8:2，制成微生物复合菌剂粉剂。
2.根据权利要求1所述的一种抗病增产复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤二中金氏B培养基由20g蛋白胨、1.5g磷酸氢二钾、1.5g硫酸镁、10g琼脂和1000mL无菌水组成，pH值为7.2±0.2。
3.根据权利要求1所述的一种抗病增产复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤二中发酵罐中培养温度为28.5℃。
4.根据权利要求1所述的一种抗病增产复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤三所述培养基由0.2gKH2PO4、0.8gK2HPO4、0.2gMgSO4·7H2O、0.1gCaSO4·2H2O、0.01gNa2MoO4·2H2O、0.5g酵母、20g甘露醇、0.01gFeCl3和1000mL水组成，pH值为7.0～7.4。
5.根据权利要求1所述的一种抗病增产复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤三中发酵罐中培养温度为30℃。
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