CN101591199A - 微生物肥料-植物合生元组合物制剂及合生元制剂制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了微生物肥料－植物合生元组合物制剂及合生元制剂制备方法。该组合物制剂由益生菌，益生元，稳定剂组成植物合生元，芽孢杆菌组成发酵液，合生元制剂制备方法步骤：益生菌的发酵，菌量调整，配制，均质混合即得产品。制剂中的固氮菌、解磷、解钾菌能增加土壤养份，提高化肥利用率，改善土壤团粒结构，促进通气性、保水性及排水性，克服日光温室重茬连作障碍；制剂中的寡糖益生元能刺激作物提高对病原微生物的抗性，同时又促进益生菌的定植和增殖；能抑制病菌产生的毒性、启动自身免疫系统，去病除害，减少杀菌农药；抗寒、抗热、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗肥害、抗药害、抗营养失衡；能促进植物根系伸长、毛细根良好发育，促进开花结果。

Description

微生物肥料-植物合生元组合物制剂及合生元制剂制备方法

技术领域

本发明涉及微生物肥料领域，具体涉及一种应用于农业生产领域的微生物肥料-植物合生元组合物制剂及合生元制剂制备方法。

背景技术

随着农药、兽药、饲料添加剂、化肥、激素等化学合成物质使用量的不断增加，农产品数量有了较快增长，但同时也不可避免地对农业生态环境和农产品造成了严重的污染，这不仅对人们的健康存在潜在威胁，而且直接影响到农产品在国际上的竞争力和出口创汇。

世界大部分国家，特别是一些发达国家允许使用的生长素和激素逐年减少，对农作物中农药和化肥等残留的要求也越来越高，提倡无公害的天然食物(绿色食品)已成为食品安全重要内容和迫切需求。

一、益生菌的概念

益生菌又称为益生素、促生素、活菌素等，广义上讲，是指含活菌或含菌体组分及代谢产物的生物制品。常见的益生菌有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、乳酸杆菌、乳酸链球菌、酪酸菌、酵母菌、噬菌蛭弧菌等，它们即是动物益生菌，又可作为植物益生菌；另外，光合细菌、植物根际微生物，如固氮细菌、解磷细菌、转化钾化物的微生物也是重要的植物益生菌。

植物益生菌主要是指一些具有自生固氮、解磷、解钾功能，或一些产酶、产有机酸的微生物，其直接的作用主要是改良土壤性质，提高土壤肥力，节约肥料，减少化肥、农药使用量，另一方面，抑制有害微生物的生存与繁殖，减轻并逐步消除土传病虫害和连作障碍。间接的作用是增强植物的代谢功能，提高光合作用，促进种子发芽，根系发育、开花、结实，成熟期提前。

二、益生元的概念

益生元也叫“化学益生素”，是一种不易被机体消化但可选择性刺激有益菌的生长或增强有益菌的活性，而且不被有害菌利用，从而促进机体健康的益菌制品。最基本的益生元为碳水化合物，但定义并不排除被用作益生元的非碳水化合物物质。

各种益生元中，研究和应用最广泛的是寡糖，一般构成单元为五碳糖或六碳糖，主要包含壳寡糖、氨基寡糖素、果寡糖、甘露寡糖、肝素寡糖、木寡糖、褐藻寡糖和牛蒡寡糖等。

三、植物益生元的概念

应用于植物，并且对植物的生长有促进作用的寡糖，可称之为植物益生元。对应用于植物的寡糖素有系统的研究，其中应用较为成功的有氨基寡糖素(即壳寡糖)、真菌寡糖、半乳糖醛酸、卡拉胶寡糖等。另外，低分子量可溶的壳聚糖对植物生长也有一定的促进作用。

植物益生元对植物生长发育表现出特殊的调节作用，它可以促进植物生长、促进植物愈伤组织形成、使植物细胞活化，提高肥料成分的吸收率；有的可作为蛋白酶抑制剂诱导因子，在植物抵抗病虫害中起作用；有的可使植物局部细胞和组织产生过敏性死亡，使得病原物不能进一步扩散；还有的参与调控植物的形态建成等。

目前的研究结果证实，单独使用植物益生素或植物益生元，均对植物有明显的益处。因为两者单独使用时，或者促进植物对氮磷钾的吸收利用，或者诱导植物本身的免疫防御系统功能增强抗病性，同时还具有安全、高效、无残留，符合“生态文明”要求，对保障粮食及食品安全具有非常重要的意义。微生物肥料也叫菌肥，是应用于植物或土壤环境中含有生物活性、起肥料效应，或以肥料方法使用、以微生物活性生物体或其代谢产物为主要作用因子的一类益生菌，是从土壤中筛选以至驯化出能改善作物营养的微生物。凡是能直接或间接改善作物营养状况的微生物，将其制成菌剂或加入其他填充物，均可作为肥料广泛应用于农业生产。它的肥料效应一般认为是广义的，不仅仅是营养物质方面，也包括了对作物生长刺激、调控、协助作物吸收水分以及由于接种微生物在作物根际的广泛生长而降低或抑制有害微生物的存活，从而表现出减轻一些病(虫)害的效用。

微生物肥料的作用机理独具特点，不能被其他肥料代替，概括起来有以下几个方面。

一、活化并促进植物对氮、磷、钾大量元素及其他营养元素的吸收。

二、产生植物激素、酸性物质等多种生理活性物质刺激调节植物生长。

三、产生抑病作用，间接促进植物生长。

四、提高植物的抗逆性。

上述微生物肥料有单一增强某项指标的，如固氮菌，也有多种微生物组成的菌群，协调发挥作用全面提高肥效的。但从既提高肥效，又促进植物抗性的角度设计微生物肥料的尚无报导。

益生菌与益生元的复合制品，称为合生元，又称合生素或共生元，其特点是同时发挥益生菌和益生元的作用。合生元现已被广泛地用于人类和动物保健与疾病预防治疗过中，究其使用的高效性与无残留性等众多优点，今后有成为抗生素预防治疗疾病替代品的趋势。

本发明即从植物根际微生态和植物本身系统防御性的角度综合考虑，提出了植物合生元的概念，提出了增加肥效的植物合生元组合物，解决了以往微生物肥料存在的或菌种单一、功能单一，或仅利用微生物的固氮解磷解钾作用和竞争抑制作用等缺陷和不足。

目前，国内外市场上，已经有少量的寡糖益生菌组合产品出现，但研究和应用仅限于动物。本发明提出植物合生元的概念将填补寡糖益生菌组合产品在植物生产领域的空白，使寡聚糖和益生素结合起来，在植物领域的应用中发挥更大更高的效能。此类新型制剂对环境友好、无污染，同时兼有促进植物生长和提高品质的功能，是发展前景十分广阔的一类新的生物制品。

发明内容

植物合生元的概念

益生菌和寡糖两者应用在植物上，均可改善土壤结构、调节植物生长、促进营养吸收、提高植物抗逆性。两者配伍，共同作用于植物，益生菌抑制病害、促进植物生长，寡糖可改善益生菌的生长环境，促进益生菌生长，同时又调节、诱导植物抗性，改善土壤结构和水分，二者相辅相成，共同起到促进生长、抑制病害、提高产量的作用。它可使植物细胞活化，促进植物愈伤组织形成和对氮、磷、钾等营养物质的吸收，因而具有促进植物细胞生长发育的效果，可提高农作物产量和改善品质；还能激活植物酶的活性，诱导植物系统获得抗病性，从而减少农药的使用，减少环境污染。

植物益生菌和益生元的组合物即为本发明提出的“植物合生元”。其中，起益生菌作用的微生物具有固氮、解磷、解钾等功能；起益生元作用的寡聚糖为1-20个单糖组成的低聚糖，诱导植物系统抗性；真菌低聚糖可改善土壤结构。因此该合生元可作为特殊微生物肥料应用。

目前市场上已有成型的应用于动植物的益生元或益生菌制品，也有动物合生元产品；但迄今，国内外对于植物合生元的应用和研究还未有明确资料。本发明率先把植物益生元和植物益生素以一定的比例配合，共同对植物起作用，并把这种产品组合物称为植物合生元。植物合生元是“植物益生菌和植物益生元的混合制剂”。它的功能特点就是同时发挥益生菌与益生元的双重作用。其机制是，一方面通过直接增加有益菌来改善微生态的平衡，从而达到宿主保健和疾病防治的目的；另一方面通过益生元的作用特点来强化益生菌的作用效果。通过以上功效从而可促进植物生长、提高防病抗病能力和经济效益。

本发明的目的提供一种针对微生物特别种群具有自生固氮、解磷解钾等功效，寡聚糖类物质对植物有诱导抗性的功能并对益生菌生长有促进作用的微生物肥料-植物合生元组合物制剂。

为了克服现有技术的不足，本发明的技术方案是这样解决的：

一种微生物肥料-植物合生元组合物制剂，本发明的特殊之处在于按重量比，该制剂由85份～99份益生菌，0.05份～3.5份益生元，1.5份～10份稳定剂组成植物合生元，其中益生菌和益生元组成植物合生元的比例范围为30～60份∶1份。

所述的益生菌包括有枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、固氮细菌、解磷细菌、转化钾化物的微生物、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌等，由枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌组成发酵液，按体积比，枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌∶巨大芽孢杆菌∶胶质芽孢杆菌为1∶1∶1配制，其中各种菌株的芽孢数量比例为枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌∶巨大芽孢杆菌∶胶质芽孢杆菌＝5∶3∶2；所述的益生元包括由低聚糖或寡聚糖中的1种或多种复合组成，其中的低聚糖为真菌葡聚糖、酵母葡聚糖、田菁胶、瓜儿豆胶、魔芋胶；其中的寡聚糖为真菌寡糖、寡葡聚糖、氨基寡糖、木寡糖、甘露寡糖、甘露半乳寡糖；所述稳定剂包括真菌葡聚糖发酵产物，具体为真菌葡聚糖溶液，是由大型真菌发酵产生的高粘度胞外多糖所组成，其固形物含量按重量比为1.0～3.0％；

本发明的技术方案中，植物合生元组合物制剂各成分的配比进一步优选为：植物合生元组合物制剂由90份～95份益生菌发酵液，0.05份～1.5份益生元，3份～6份稳定剂组成植物合生元，其中益生菌和益生元组成植物合生元的比例范围为50～55份∶1份。

植物合生元制剂的技术原理如下：

植物益生菌为复合菌液，主要是为了发挥不同菌株的固氮解磷解钾等基本功能，促进植物对氮磷钾的吸收利用；另一方面，使植物益生菌在植物根际形成优势菌群，抑制有害菌的增殖，形成竞争性抑制；

植物益生元为不同来源的低聚糖或寡聚糖，本身可诱导植物自身防御系统的功能，提高植物的免疫能力和抗病力；另一方面，植物益生元可促进益生菌的增长，促进其形成优势菌群，二者协同作用，促进植物生长，提高产量。植物合生元制剂中所述的的低聚糖或寡聚糖含量按重量比为发酵液总量的0.05-1.5％，相当于低聚糖或寡聚糖的浓度为20-900μg/mL，此浓度范围经灌溉使用后为促进植物生长的适宜浓度。

本发明的另一目的是提供植物合生元制剂的制备方法。

一种合生元制剂制备方法，按下述步骤进行：

1)、益生菌的发酵

①、发酵方式为不同菌株分别单独培养，三级发酵，逐级放大，放大比率为1∶5～20V/V；

②、制种：将不同的菌种接入不同的灭菌平板培养基上，在温度32℃～37℃恒温培养48h，在无菌操作台上，用10～15mL无菌水将菌落上的菌体充分悬浮，转入灭菌的茄形瓶中，在温度32℃～37℃恒温培养48h，温度80℃处理10min，用于发酵罐接种；

③、发酵：各级发酵罐按照培养基配方配制发酵培养基，所用培养基原料均应充分粉碎到100目，钙盐和镁盐单独溶解后再与其它溶混合，温度121℃灭菌20min，冷却至40℃以下，接入制备好的液体菌种开始发酵；

④、一级种子罐发酵周期20～24h，二级种子罐发酵周期20～24h，种子罐的移种时间为至镜检开始产芽孢时，将种子罐中的发酵液打入下一级发酵罐，发酵罐发酵周期为36～48h，镜检芽孢率达90％以上放罐；培养条件：装料系数为70％，液体种子接种量为2～10％V/V，培养基C/N为20～40/3，PH为6.5～7.5，前期温度28℃-30℃，后期温度34℃-36℃，罐内压力0.03-0.08Mp，搅拌转速100～160r/min；

不同菌种用不同的培养基单独发酵；

发酵结束时，不同菌种的培养物中，芽孢数量为2～50×10⁹cfu/ml；

2)、菌量调整

不同菌株发酵结束时所含的芽孢数量有较大差异，而作为植物益生菌来讲，以提供氮磷钾为目的，植物对各种营养所需的量不同，因此相对应的不同种类的芽孢数量不等，需要对原料发酵液的菌量进行调整，调整方法如下：取10～50mL量的发酵液样品，温度80℃处理10min，在各自专用的培养基上，用平板稀释法进行芽孢数定量，取得基础数据，计算稀释倍率，按照不同菌种的培养基配方，只取其中的无机盐成分，配制成不同的稀释液，根据稀释倍率进行稀释；

取其培养基所含的无机盐成分和比例的目的，是维持稀释液的成分和原发酵液基本一致，避免稀释后芽孢在储藏期内萌发；

不同菌株发酵液稀释后的芽孢数量范围为：枯草芽孢杆菌3-12×10⁹cfu/ml，巨大芽孢杆菌1-6×10⁹cfu/ml，胶质芽孢杆菌0.6-4×10⁹cfu/ml；

3)、配制

将步骤2)中经过调整的发酵液，按照等比例V/V混合，搅拌均匀；加入寡聚糖，加入量按重量比为总量的0.05-1.5％，使配制液中的寡糖浓度达到20-900μg/ml；再加入葡聚糖，加入量按重量比为发酵液总量的3～10％(V/V)，搅拌，使物料充分悬浮；

4)、均质混合

将步骤3)中混合的物料用胶体磨处理，再行分装即得产品。

与现有技术相比，本发明所提供的作为植物合生元的微生物肥料使用效果：菌液与各个寡聚糖的组合有较明显的协同作用，对标志温室大棚黄瓜生长状况的节间、叶色、卷须、雌花指数均有提高，其中主要表现在对节间、叶色、卷须指数的提高上，促生作用均好于传统的施用尿素对照。综合指数增长之和达到23.7，综合指数增加60.14％。在祛病、固氮、解磷、解钾等混合菌液中加入寡聚糖对黄瓜有比较明显的增产作用，冲施本品51天后，大棚黄瓜比对照均增产29.1％。在祛病、固氮、解磷、解钾等混合菌液中加入寡聚糖能明显提高对黄瓜促生作用，使黄瓜的生长性状更加良好，即生长稳健、节间在8-10厘米、均匀一致；叶色平展、墨绿、增厚、缺刻深浅、基本没有生理病变；卷须粗壮且长、尖端翠绿、与茎夹角合理；雌花在距顶端距离50厘米左右开放、花瓣大、色鲜艳、子房较长。复合菌液加寡聚糖的促生、增产作用主要是因为其中的固氮菌、解磷、解钾菌能增加土壤养份，提高化肥利用率，改善土壤团粒结构，促进通气性、保水性及排水性，克服日光温室重茬连作障碍；寡聚糖在为固氮菌、解磷、解钾菌提供繁殖营养的同时，能抑制病菌产生的毒性、启动作物的自身免疫系统，去病除害，减少使用杀菌农药；抗寒、抗热、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗肥害、抗药害、抗营养失衡；复合功能菌分泌的大量抗生素等物质，能促进黄瓜根系伸长、毛细根良好发育，促进开花结实。

具体实施方式

下面对本发明的内容及实施例作进一步说明：

植物合生元中的主要成分为植物益生菌，由以下菌株构成：

枯草芽孢杆菌(Bacilus subtis)，菌种编号为ACCC01199，产酶微生物，分解有害菌细胞壁；

枯草芽孢杆菌(Bacilus subtis)，菌种编号为ACCC01698，固氮；

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，菌种编号为ACCC01102，产酶微生物，分解有害菌细胞壁；

巨大芽孢杆菌(Bacilus megaterium)，菌种编号为ACCC02954，解磷，同时具有固氮作用；

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，菌种编号为ACCC02983，解钾菌，同时具有固氮作用。

以上菌株均为市售菌株。

植物合生元中的另一主要成份为益生元，由以下寡糖中的1种或2种或3种构成，分别是真菌寡糖、氨基寡糖、低聚葡聚糖、甘露寡糖、半乳甘露寡糖、木寡糖、果寡糖、低聚异麦芽糖等，寡糖的形态是粉末状或糖浆，均为市售产品。各种寡糖分子量低，水溶性好，易于农作物吸收利用。

合生元中寡糖的作用主要是：

(1)抗病作用，通过诱导植物自身的免疫反应，使植物提高抵抗病原微生物的抗性；

(2)抑菌作用，通过竞争性抑制，使病原微生物和有害菌的生长受到抑制；

(3)调节植物根际微生物的有益菌群，通过寡糖本身益生元的作用，促进肥料中各种芽孢杆菌生长繁殖，发挥固氮、解磷和解钾的作用，同时促进土壤中有益微生物增殖，进而促进植物生长；

(4)改善土壤状况，在增加土壤有益微生物菌群的同时，使土壤有机质含量增加，结构疏松，保水能力增强。

合生元中的另一辅助成分为稳定剂，是一种发酵生产的高粘度葡聚糖和低聚糖的混合物制品，其作用是一方面使植物合生元中的益生菌充分悬浮，在制剂中分布均匀，保持液体制剂的稳定性；另一方面起到促进土壤团粒结构的形成并维持充足的水分。

实施例1

一种微生物肥料-植物合生元组合物制剂，按重量比，该制剂由85份～99份益生菌，0.05份～3.5份益生元，1.5份～10份稳定剂组成植物合生元，其中益生菌和益生元组成植物合生元的比例范围为30～60份∶1份(W/W)。

一种合生元制剂制备方法，按下述步骤进行：

1)、益生菌的发酵

①、制种：将不同的菌种接入不同的灭菌平板培养基上，在温度32℃～37℃恒温培养48h，在无菌操作台上，用10～15mL无菌水将菌落上的菌体充分悬浮，转入灭菌的茄形瓶中，在温度32℃～37℃恒温培养48h，温度80℃处理10min，用于发酵罐接种；

②、发酵：各级发酵罐按照培养基配方配制发酵培养基，所用培养基原料均应充分粉碎到100目，钙盐和镁盐单独溶解后再与其它溶混合，温度121℃灭菌20min，冷却至40℃以下，接入制备好的液体菌种开始发酵；

③、发酵方式为不同菌株分别单独培养，三级发酵，逐级放大，放大比率为1∶5～20V/V；一级种子罐发酵周期20～24h，二级种子罐发酵周期20～24h，种子罐的移种时间为至镜检开始产芽孢时，将种子罐中的发酵液打入下一级发酵罐，发酵罐发酵周期为36～48h，镜检芽孢率达90％以上放罐；培养条件：装料系数为70％，液体种子接种量为10％V/V，培养基C/N为20/3，PH为6.5～7.5，前期温度28℃-30℃，后期温度34℃-36℃，罐内压力0.03-0.08Mp，搅拌转速100～160r/min；

不同菌种用不同的培养基单独发酵；

发酵结束时，不同菌种的培养物中，芽孢数量为2～50×10⁹cfu/ml；

2)、菌量调整

不同菌株发酵结束时所含的芽孢数量有较大差异，而作为植物益生菌来讲，以提供氮磷钾为目的，植物对各种营养所需的量不同，因此相对应的不同种类的芽孢数量不等，需要对原料发酵液的菌量进行调整，调整方法如下：取10～50mL的发酵液样品，用80℃温度处理10min，在各自专用的培养基上，用平板稀释法进行芽孢数定量，取得基础数据，计算稀释倍率，按照不同菌种的培养基配方，只取其中的无机盐成分，配制不同的稀释液，根据稀释倍率进行稀释；

不同菌株发酵液稀释后的芽孢数量范围为：枯草芽孢杆菌3-12×10⁹cfu/ml，巨大芽孢杆菌1-6×10⁹cfu/ml，胶质芽孢杆菌0.6-4×10⁹cfu/ml；

3)、配制

将步骤2)中经过调整的发酵液，按照等比例V/V混合，搅拌均匀；加入寡聚糖，加入量按重量比为总量的0.05-1.5％，使配制液中的寡糖浓度达到20-900μg/ml；再加入葡聚糖，加入量按重量比为发酵液总量的3～10％V/V，搅拌，使物料充分悬浮；

4)、均质混合

将步骤3)中混合的物料用胶体磨处理，再行分装即得产品。

实施例2

一种微生物肥料-植物合生元组合物制剂，按重量比，该制剂由90份～95份益生菌，0.05份～2.0份益生元，3份～6份稳定剂组成植物合生元，其中益生菌和益生元组成植物合生元的比例范围为45～60份∶1份(W/W)。

一种合生元制剂制备方法，按下述步骤进行：

1)、益生菌的发酵

①、制种：将不同的菌种接入不同的灭菌平板培养基上，在温度35℃恒温培养48h，在无菌操作台上，用15mL量无菌水将菌落上的菌体充分悬浮，转入灭菌的茄形瓶中，在温度35℃恒温培养48h，温度80℃处理10min，用于发酵罐接种；

②、发酵：各级发酵罐按照培养基配方配制发酵培养基，所用培养基原料均应充分粉碎到100目，钙盐和镁盐单独溶解后再与其它溶混合；温度121℃灭菌20min，冷却至40℃以下，接入制备好的液体菌种开始发酵；

③、发酵方式为不同菌株分别单独培养，三级发酵，逐级放大，放大比率为1∶15(V/V)；一级种子罐发酵周期20～24h，二级种子罐发酵周期20～24h，种子罐的移种时间为至镜检开始产芽孢时，将种子罐中的发酵液打入下一级发酵罐，发酵罐发酵周期为36～48h，镜检芽孢率达90％以上放罐；

培养条件：装料系数为70％，液体种子接种量为5％V/V，培养基C/N为20/3，PH为6.5～7.5，前期温度28℃-30℃，后期温度34℃-36℃，罐内压力0.03-0.08Mp，搅拌转速120r/min；

不同菌种用不同的培养基单独发酵；

发酵结束时，不同菌种的培养物中，芽孢数量为2～50×10⁹cfu/ml；

2)、菌量调整

按实施例1的方法进行；

不同菌株发酵液稀释后的芽孢数量范围为：枯草芽孢杆菌8×10⁹cfu/ml，巨大芽孢杆菌4.8×10⁹cfu/ml，胶质芽孢杆菌3.2×10⁹cfu/ml；

3)、配制

将步骤2)中经过调整的发酵液，按照等比例V/V混合，搅拌均匀；加入寡糖，加入量为总量的1.5％，使配制液中的寡糖浓度达到900μg/ml；再加入葡聚糖，加入量按重量比为发酵液总量的6％(V/V)，搅拌，使物料充分悬浮；

4)、均质混合

将步骤3)中混合的物料用胶体磨处理，再行分装即得产品。

实施例3

枯草芽孢杆菌(Bacilus subtis)培养

枯草芽孢杆菌斜面培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml，pH7.2。

枯草芽孢杆菌液体培养基：豆粨1000g、白糖1000g、CaCO3 500g、NaCl 30g、kCl 30g、MgSO4 30g、(NH4)2 SO4 50g、Mn SO4 3g、Fe SO4 3g、水100L。

枯草芽孢杆菌培养特性：生长最高温度为40-50℃，生长最适温度33-37℃，发酵最适温度29-33℃，最适PH为5.5-8.5。

枯草芽孢杆菌的形态特征：

革兰氏阳性杆菌，大小约0.6-0.8×1.5-3.0微米。生长在葡萄糖琼脂培养基的细胞染色均匀，运动。芽孢呈椭圆形，芽孢中生或偏中生，不膨大或稍有膨大。菌落圆形、表面色暗、粗糙、边缘不整齐。

发酵罐液体培养条件：装料系数为70％，液体种子接种量为10％(V/V)。培养基C/N为20/3，PH为6.5～7.5，前期温度28-30℃，后期温度34-36℃，罐内压力0.03-0.08Mp，搅拌转速125r/min。

液体发酵培养特征：

发酵初期菌液为乳白色，菌数增加量很小，PH变化不大，无泡沫产生。6小时后，菌数呈对数增加，搅拌有泡沫产生。18小时后，由于营养物质消耗及PH的变化，菌数基本稳定，30小时后，温度升至35℃，此时泡沫产生越来越多，直至培养40小时以上，90％已经成芽孢，此时PH5.8-6.0，菌液颜色变深，培养完成。约两天完成一个发酵培养周期。

培养结束时，发酵液中的芽孢数量为30～50×10⁹cfu/mL。

实施例4

巨大芽孢杆菌(Bacilus megaterium)的培养

巨大芽孢杆菌斜面培养：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000ml，pH7.2。

液体培养基：豆粨700g、白糖700g、CaCO3 350g、NaCl 21g、kCl 21g、MgSO421g、(NH4)2 SO4 35g、Mn SO4 2.1g、Fe SO4 2.1g、水50L。

培养特性：好氧生长，在普通肉汤培养24小时中呈浑浊，有沉淀物，生长最高温度为45℃，最适PH为7-7.5。

巨大芽孢杆菌的形态特征：

杆菌，大小约1.2-1.5×2.0-5.0微米，革兰氏阳性反应，运动，幼龄菌用吕氏美兰染色着色不均一，苏丹黑染色菌体内有蓝黑色颗粒。芽孢呈椭圆形，中生或偏中生，胞囊不膨大。菌落扁平、内陷有光泽、润湿、边缘较整齐，乳白色不透明。

液体培养条件：装料系数为70％，液体种子接种量为10％(V/V)。培养基C/N为20/3，PH为6.5～7.5，前期温度28-30℃，后期温度34-36℃，罐内压力0.03-0.08Mp，搅拌转速120r/min。

培养结束时，发酵液中的芽孢数量为4-20×10⁹cfu/mL。

实施例5

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)的培养

斜面培养基：蔗糖10g、磷酸氢二钠2g、FeCl3，0.5％，1ml、玻璃粉1g、CaCO3 0.1g、MgSO4 0.5g、琼脂20g、水1000ml，pH7.0。

液体培养基：白糖140g、淀粉420g、CaCO3 70g、(NH4)2 SO4 70g、Mn SO470g、K₂HPO4 140g、FeCl33.5g、水50L，pH7.0。

胶质芽孢杆菌的形态特征：

粗长杆状，两端钝圆，革兰氏染色反应不定，产生聚β-羟基丁酸盐(PHB)颗粒。菌体大小为(1.0～1.2)×(2.5～7.0)μm，菌体周围有厚荚膜。芽孢：壁厚，椭圆形，中生或近端生，芽孢囊不膨大或微膨大。菌落圆形，无色，隆起，胶质粘稠，透明或半透明，边缘整齐。好氧或兼性厌氧生长，水解淀粉，接触酶反应阳性，氧化酶和卵磷脂酶反应阴性，在无氮培养基上生长良好，生长温度10℃～45℃。

液体培养条件：装料系数为70％，液体种子接种量为10％(V/V)。培养基C/N为20/3，PH为6.5～7.5，前期温度28-30℃，后期温度34-36℃，罐内压力0.03-0.08Mp，搅拌转速140r/min。

培养结束时，发酵液中的芽孢数量为2-10×10⁹cfu/ml。本实施例其他步骤同实施例1

实施例6

胶质芽孢杆菌菌量的调整

按上述实施例5所述的工艺条件发酵胶质芽孢杆菌，发酵结束时，经测定胶质芽孢杆菌的芽孢数为3.6×10⁹cfu/ml，终产品中要求胶质芽孢杆菌的量为0.6×10⁹cfu/ml，需要进行比例稀释。按下述成分比例配制稀释液，CaCO3 70g、(NH4)2SO4 70g、Mn SO4 70g、K₂HPO4 140g、FeCl₃ 3.5g、水50L，pH7.0。取1份(V/V)发酵液，加入到1份(V/V)稀释液中，再按1∶1∶1的比例与其他发酵液混合，搅拌均匀，混合液中的胶质芽孢杆菌芽孢数即为0.6×10⁹cfu/mL。

其他菌株的发酵液的芽孢数量也如法调整。

实施例7

本发明具体应用

本发明产品植物合生元在黄瓜上的使用效果见下表。

将标志黄瓜生长状况的节间、叶色、卷须、雌花等主要项目调查数据按照以下公式计算“生长综合指数”，记入表一；数值越大，表明该项状况越好。生长综合指数(％)＝[∑(级别代表值×本级株数)/(检查总株数×最高级别代表值)]×100％，式中：∑是各级乘积数值的总和。其他指标计算方法相同。

促生结果见表1、表2。促育结果见表3。增产结果见表4。

各表数据显示，植物合生元对大棚黄瓜有促进生长、促进果实发育和增产的效果。

表1冲施后20天黄瓜生长状况(三重复综合指数平均值)

表2冲施后20天黄瓜生长状况比较(三重复综合指数平均值)

表3冲施后20天黄瓜发育状况(三重复综合指数平均值)

表4冲施后51天黄瓜总产量(三重复定点55株平均值)

处理	植物合生元	单用菌液	冲施尿素0.15g/m2(CK)
				产量(公斤/55株)	10.2	9.9	7.9
增产率(％)	29.1	25.32	/

Claims (7)

1 一种微生物肥料-植物合生元组合物制剂，其特征在于按重量比，该制剂由85份～99份益生菌发酵液，0.05份～3.5份益生元，1.5份～10份稳定剂组成植物合生元，其中益生菌和益生元组成植物合生元的比例范围为30～60份：1份，所述的益生菌包括枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌、固氮细菌、解磷细菌、转化钾化物的微生物、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌，发酵液由枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌组成，按体积比，枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌∶巨大芽孢杆菌∶胶质芽孢杆菌为1∶1∶1配制，其中各种菌株的芽孢数量比例为枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌∶巨大芽孢杆菌∶胶质芽孢杆菌为5∶3∶2。

2、根据权利要求1所述的微生物肥料-植物合生元组合物制剂，其特征在于按重量比，该制剂由90份～95份益生菌发酵液，0.05份～1.5份益生元，3份～6份稳定剂组成植物合生元，其中益生菌和益生元组成植物合生元的比例范围为50～55份∶1份。

3、根据权利要求1所述的微生物肥料-植物合生元组合物制剂，其特征在于所述的益生元包括由低聚糖或寡聚糖中的1种或多种复合组成，其中的低聚糖为真菌葡聚糖、酵母葡聚糖、田菁胶、瓜儿豆胶、魔芋胶；其中的寡聚糖为真菌寡糖、寡葡聚糖、氨基寡糖、木寡糖、甘露寡糖、甘露半乳寡糖，所述的低聚糖或寡聚糖含量为发酵液总量的0.05-1.5％，最终的低聚糖或寡聚糖浓度为20-900μg/mL。

4、根据权利要求1所述的微生物肥料-植物合生元组合物制剂，其特征在于所述的稳定剂为真菌葡聚糖溶液，是由大型真菌发酵产生的高粘度胞外多糖所组成，其固形物含量按重量比为1.0～3.0％，加入量为1.5～10％(V/V)。

5、根据权利要求1所述的微生物肥料-植物合生元组合物制剂，其特征在于所述益生菌的生物活性孢子体的数量为6～16×10⁹cfu/mL。

6、一种权利要求1所述的合生元制剂制备方法，按下述步骤进行：

1)、益生菌的发酵

①、发酵方式为不同菌株分别单独培养，三级发酵，逐级放大；

②、制种：将不同的菌种接入不同的灭菌平板培养基上，再扩繁到灭菌的茄形瓶中，培养结束时，温度80℃处理10min，用于发酵罐接种；

③、发酵：各级发酵罐按照培养基配方配制发酵培养基，灭菌后接入制备好的液体菌种开始发酵；

④、经过一级种子罐发酵、二级种子罐发酵和发酵罐发酵三级发酵，发酵罐中的发酵液镜检芽孢率达90％以上时放罐；

发酵结束时，不同菌种的培养物中，芽孢数量为2～50×10⁹cfu/ml；

2)、菌量调整

不同菌株发酵液调整后的芽孢数量范围为：枯草芽孢杆菌3-12×10⁹cfu/ml，巨大芽孢杆菌1-6×10⁹cfu/ml，胶质芽孢杆菌0.6-4×10⁹cfu/ml；

3)、配制

将步骤2)中经过调整的发酵液，按照等比例V/V混合，搅拌均匀；加入寡聚糖，加入量按照重量比W/W为总量的0.05-1.5％；再加入液体葡聚糖，加入量为最终混合物总量的3～10％V/V，搅拌，使物料充分悬浮；

4)、均质混合

将步骤3)中混合的物料用胶体磨处理，再行分装即得产品。

7、根据权力要求6所述的合生元制剂制备方法，其特征在于菌量调整时取10～50mL量的发酵液样品，用80℃温度处理10min，在各自专用的培养基上，用平板稀释法进行芽孢数定量，取得基础数据，计算稀释倍率，按照不同菌种的培养基配方，只取其中的无机盐成分，配制不同的稀释液，根据稀释倍率进行稀释。