CN104818228A - 一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法 - Google Patents

一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法。该方法包括如下步骤：(1)制备枯草芽孢杆菌菌液；(2)制备胶冻样芽胞杆菌菌液；(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌菌液与步骤(2)制得的胶冻样芽胞杆菌菌液混合均匀，制得胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂。本发明首次通过利用胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌共存的方式保存枯草芽胞杆菌，利用胶冻样芽孢杆菌分泌的胞外多糖，降低发酵液中的水活度，减少枯草芽胞杆菌芽胞的萌发率，极大提高了枯草芽胞杆菌液体菌剂的保存期及活性。

Description

一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法
技术领域
本发明涉及一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
微生物肥料可以培肥地力、提高化肥利用率、净化和修复土壤中的有害物质及降低农作物病害发生等作用，对解决我国化肥短缺、提高作物产量和品质具有现实意义和巨大作用。近年来我国微生物肥料生产发展迅速，全国有1000多家微生物肥料企业，产业化和应用已经初具规模。
枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。因而在微生物肥料中是一个常用的优异菌种。但是因为枯草芽孢杆菌的液体剂型，保存一段时间后活菌量会急剧降低，达不到国家农业部行业标准2亿/克，因而市面上很少有合格的枯草芽胞杆菌液体菌剂，目前该类微生物肥料产品多为固体剂型。液体剂型的微生物菌剂，可以随滴灌设施使用，省时省工，使用效率高，效果好。而且液体剂型在生产环节可以减少固体吸附以及造粒等环节，保存了液体发酵液中的有效成分，提高了生产效能。但是目前还没有一种有效可靠的技术能提高液体枯草芽孢杆菌的保存活性，有些生产厂家会加入甘油等保护剂，成本高，且效果不稳定。
胶质芽孢杆菌又称硅酸盐细菌，其重要特性是能够分解出长石、云母等矿物中的钾、硅，也能分解出磷灰石中的磷，以及分泌植物生长刺激素及多种生物酶类，以增强作物对一些病害的抵抗力。因为胶质芽胞杆菌在生长过程中会分泌大量胞外多糖，使得营养基变得粘稠，培养基中的菌体溶氧受阻，会影响培养基中的菌体继续增殖。因而传统的培养基和培养方法，胶质芽胞杆菌很难达到高密度。在实验室摇瓶培养条件下一般为0.2～2亿/ml。胶质芽孢杆菌生长过程中累积的胞外多糖虽然阻碍了微生物菌体的进一步增殖，但是可以保护枯草芽孢杆菌使其减少芽孢的萌发。本发明就是利用这个特性，将枯草芽孢杆菌与胶质芽孢杆菌发酵液共存，不但增加了枯草芽胞杆菌菌液的有效成分和使用效果，最主要的功效是减少枯草芽孢杆菌芽胞的萌发，提高其液体菌剂的保存期。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法。该方法通过与一定比例的胶冻样芽胞杆菌发酵液共存来达到提高枯草芽孢杆菌液体剂型的存活期的目的。
本发明的技术方案：
一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌经活化后，接入种子液体培养基I中，经种子培养后，接种于发酵培养基I中，在温度33～37℃、通气量1.33～1.88vvm的条件下发酵培养26～36h，制得孢子浓度为20～50亿/ml的枯草芽孢杆菌菌液；
所述的发酵培养基I组分如下：
玉米粉40～60g/L，豆粕粉30～40g/L，硫酸镁10～15g/L，葡萄糖8～10g/L，K2HPO41～1.5g/L，pH7.0～7.5；
(2)将胶冻样芽胞杆菌经活化后，接入种子液体培养基II中，经种子培养后，接种于发酵培养基II中，在温度30～33℃、通气量1.60～2.00vvm、转速160～180rpm的条件下发酵培养12～14h；然后在通气量2.2～2.7vvm、转速180～220rpm的条件下，继续发酵培养12～14h，制得菌体浓度为10～20亿/ml的胶冻样芽胞杆菌菌液；
所述的发酵培养基II组分如下：
蔗糖或葡萄糖15～20g/L，K2HPO40.2～0.5g/L，MgSO40.2～0.4g/L，NaCl 0.2～0.4g/L，(NH4)2SO41.0～3.0g/L，CaCO33.0～5.0g/L，酵母粉1.0～2.0g/L，pH7.0～8.0；
(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌菌液与步骤(2)制得的胶冻样芽胞杆菌菌液混合均匀，枯草芽孢杆菌菌液占总体积的体积百分比为40～60％，胶冻样芽胞杆菌菌液占总体积的体积百分比为40～60％，制得胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化温度为：33～37℃，活化时间为22～24h，活化培养基组分如下：
牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉15g/L，水定容至1L。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，种子培养温度为：33～37℃，转速150～200rpm，培养时间为22～24h，种子液体培养基I组分如下：
牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC 04181、ACCC 06374或ACCC 06185。本领域技术人员均可以预料到，由于枯草芽孢杆菌具有共同的生物学特性，因此采用其他枯草芽孢杆菌进行替换后，也能达到相同的技术效果。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，活化温度为：30～33℃，活化时间为24～36h，活化培养基组分如下：
蔗糖或葡萄糖10～15g/L，K2HPO40.2～0.5g/L，MgSO40.1～0.2g/L，NaCl 0.1～0.2g/L，CaCO32.0～3.0g/L，酵母粉0.2～1.0g/L，琼脂粉15g/L。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，种子培养温度为：30～33℃，转速150～200rpm，培养时间为20～24h，种子液体培养基II组分如下：
蔗糖和/或葡萄糖10～15g/L，K2HPO40.2～0.5g/L，MgSO40.1～0.2g/L，NaCl 0.1～0.2g/L，CaCO32.0～3.0g/L，酵母粉0.2～1.0g/L，琼脂粉15g/L。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC10013；或者，来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC 1.153，CGMCC 1.231，CGMCC 1.232，CGMCC 1.910。本领域技术人员均可以预料到，由于胶冻样芽胞杆菌具有共同的生物学特性，因此采用其他胶冻样芽胞杆菌进行替换后，也能达到相同的技术效果。
根据本发明优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中的接种体积均为5％～10％(体积百分比)。
上述制备的胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂在制备微生物肥料中的应用。
有益效果
1、本发明首次通过利用胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌共存的方式保存枯草芽胞杆菌，利用胶冻样芽孢杆菌分泌的胞外多糖，降低发酵液中的水活度，减少枯草芽胞杆菌芽胞的萌发率，极大提高了枯草芽胞杆菌液体菌剂的保存期及活性；
2、本发明通过发酵培养将枯草芽孢杆菌调整为产芽孢状态，同时通过发酵培养使胶冻样芽孢杆菌处于高产胞外多糖的状态，按比例混合两种发酵液后，可以最大限度地延长枯草芽孢杆菌的保存期，生产过程简便、成本低，适用于在生物菌剂的工业生产，具有显著的经济效益。
具体实施方式
下面结合实施对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
实施例1中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC 04181。胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC10013；
实施例2中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC 06374。所述胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC 1.153；
实施例3中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC 06185。所述胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC 1.231；
实施例4中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC 04181。所述胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC 1.232；
实施例5中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC 06185。所述胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC 1.910。
枯草芽孢杆菌培养基：
活化培养基组分如下：
牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉15g/L。
种子液体培养基I组分如下：
牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L。
所述的发酵培养基I组分如下：
玉米粉50g/L，豆粕粉35g/L，硫酸镁15g/L，葡萄糖10g/L，K2HPO41g/L，pH7.5；
胶冻样芽胞杆菌培养基：
活化培养基组分如下：
蔗糖或葡萄糖15g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCl 0.2g/L，CaCO32.0g/L，酵母粉0.2g/L，琼脂粉15g/L。
种子液体培养基II组分如下：
蔗糖或葡萄糖10g/L，K2HPO40.2g/L，MgSO40.1g/L，NaCl 0.1g/L，CaCO33.0g/L，酵母粉1.0g/L。
发酵培养基II组分如下：
蔗糖或葡萄糖20g/L，K2HPO40.3g/L，MgSO40.3g/L，NaCl 0.3g/L，(NH4)2SO42.0g/L，CaCO34.0g/L，酵母粉1.5g/L，pH7.5。
实施例1
一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌在活化温度35℃的条件下活化24h后，接入种子液体培养基I中，在温度37℃、转速200rpm条件下培养22h，然后按照5％的体积百分比接种于发酵培养基I中，在温度35℃、通气量1.45vvm的条件下发酵培养36h，制得孢子浓度为35亿/ml的枯草芽孢杆菌菌液；
(2)将胶冻样芽胞杆菌在活化温度30℃的条件下活化36h后，接入种子液体培养基II中，在温度33℃、转速200rpm条件下培养20h，然后按照5％的体积百分比接种于发酵培养基II中，在温度33℃、通气量1.85vvm、转速150rpm的条件下发酵培养14h；然后在通气量2.25vvm、转速220rpm的条件下，继续发酵培养14h，制得菌体浓度为15亿/ml的胶冻样芽胞杆菌菌液；
(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌菌液与步骤(2)制得的胶冻样芽胞杆菌菌液混合均匀，枯草芽孢杆菌菌液占总体积的体积百分比为50％，胶冻样芽胞杆菌菌液占总体积的体积百分比为50％，制得胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂。
经检测，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为17亿/ml。取枯草芽胞杆菌活菌数相同的菌液做对比，在相同保存条件下存放3个月，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为12亿/ml，枯草芽孢杆菌菌液中的活菌数为0.05亿/ml。
实施例2
一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌在活化温度37℃的条件下活化22h后，接入种子液体培养基I中，在温度37℃、转速150rpm条件下培养22h，然后按照10％的体积百分比接种于发酵培养基I中，在温度35℃、通气量1.75vvm的条件下发酵培养26h，制得孢子浓度为38亿/ml的枯草芽孢杆菌菌液；
(2)将胶冻样芽胞杆菌在活化温度33℃的条件下活化30h后，接入种子液体培养基II中，在温度33℃、转速150rpm条件下培养20h，然后按照10％的体积百分比接种于发酵培养基II中，在温度30℃、通气量1.70vvm、转速140rpm的条件下发酵培养12h；然后在通气量2.60vvm、转速180rpm的条件下，继续发酵培养12h，制得菌体浓度为20亿/ml的胶冻样芽胞杆菌菌液；
(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌菌液与步骤(2)制得的胶冻样芽胞杆菌菌液混合均匀，枯草芽孢杆菌菌液占总体积的体积百分比为55％，胶冻样芽胞杆菌菌液占总体积的体积百分比为45％，制得胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂。
经检测，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为20亿/ml。取枯草芽胞杆菌活菌数相同的菌液做对比，在相同保存条件下存放4个月，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为15亿/ml，枯草芽孢杆菌菌液中的活菌数为0.08亿/ml。
实施例3
一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌在活化温度36℃的条件下活化23h后，接入种子液体培养基I中，在温度36℃、转速180rpm条件下培养23h，然后按照7％的体积百分比接种于发酵培养基I中，在温度30℃、通气量1.63vvm的条件下发酵培养30h，制得孢子浓度为30亿/ml的枯草芽孢杆菌菌液；
(2)将胶冻样芽胞杆菌在活化温度31℃的条件下活化35h后，接入种子液体培养基II中，在温度32℃、转速180rpm条件下培养22h，然后按照7％的体积百分比接种于发酵培养基II中，在温度32℃、通气量1.80vvm、转速145rpm的条件下发酵培养13h；然后在通气量2.20vvm、转速200rpm的条件下，继续发酵培养13h，制得菌体浓度为19亿/ml的胶冻样芽胞杆菌菌液；
(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌菌液与步骤(2)制得的胶冻样芽胞杆菌菌液混合均匀，枯草芽孢杆菌菌液占总体积的体积百分比为45％，胶冻样芽胞杆菌菌液占总体积的体积百分比为55％，制得胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂。
经检测，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为13亿/ml。取枯草芽胞杆菌活菌数相同的菌液做对比，在相同保存条件下存放6个月，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为8.9亿/ml，枯草芽孢杆菌菌液中的活菌数为0.02亿/ml。
实施例4
一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌在活化温度37℃的条件下活化24h后，接入种子液体培养基I中，在温度35℃、转速150rpm条件下培养22h，然后按照5％的体积百分比接种于发酵培养基I中，在温度28℃、通气量1.69vvm的条件下的条件下发酵培养26h，制得孢子浓度为42亿/ml的枯草芽孢杆菌菌液；
(2)将胶冻样芽胞杆菌在活化温度33℃的条件下活化32h后，接入种子液体培养基II中，在温度33℃、转速200rpm条件下培养24h，然后按照10％的体积百分比接种于发酵培养基II中，在温度33℃、通气量1.9vvm、转速150rpm的条件下发酵培养14h；然后在通气量2.25vvm、转速220rpm的条件下，继续发酵培养14h，制得菌体浓度为18亿/ml的胶冻样芽胞杆菌菌液；
(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌菌液与步骤(2)制得的胶冻样芽胞杆菌菌液混合均匀，枯草芽孢杆菌菌液占总体积的体积百分比为40％，胶冻样芽胞杆菌菌液占总体积的体积百分比为60％，制得胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂。
经检测，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为16亿/ml。取枯草芽胞杆菌活菌数相同的菌液做对比，在相同保存条件下存放3个月，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为10.5亿/ml，枯草芽孢杆菌菌液中的活菌数为0.04亿/ml。
实施例5
一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌在活化温度37℃的条件下活化22h后，接入种子液体培养基I中，在温度37℃、转速200rpm条件下培养22h，然后按照5％的体积百分比接种于发酵培养基I中，在温度36℃、通气量1.73vvm的条件下发酵培养30h，制得孢子浓度为40亿/ml的枯草芽孢杆菌菌液；
(2)将胶冻样芽胞杆菌在活化温度33℃的条件下活化24h后，接入种子液体培养基II中，在温度33℃、转速200rpm条件下培养24h，然后按10％的体积百分比接种于发酵培养基II中，在温度33℃、通气量2.23vvm的条件下、转速150rpm的条件下发酵培养14h；然后在溶氧30～45％、转速180～220rpm的条件下，继续发酵培养12～14h，制得菌体浓度为22亿/ml的胶冻样芽胞杆菌菌液；
(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌菌液与步骤(2)制得的胶冻样芽胞杆菌菌液混合均匀，枯草芽孢杆菌菌液占总体积的体积百分比为48％，胶冻样芽胞杆菌菌液占总体积的体积百分比为52％，制得胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂。
经检测，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为19.2亿/ml。取枯草芽胞杆菌活菌数相同的菌液做对比，在相同保存条件下存放3个月，胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数为13亿/ml，枯草芽孢杆菌菌液中的活菌数为0.08亿/ml。
试验例
按本发明实施案例1～5制备的枯草芽孢杆菌与胶质芽胞杆菌混合微生物菌剂，分别标记为微生物菌剂1～5进行田间试验。结果表明，在山东淄博常青树对设施黄瓜增产幅度为11.2～25.2％。
黄瓜实验：
试验材料：黄瓜，品种：京优35。种植密度：1600株/亩。
供试样品：依照本发明实施案例1～5提供的微生物菌剂1～5，均保存3个月后使用。
试验地点：淄博市高新区常青树农业生态园。
供试土壤：多年菜地，土壤类型为褐土，表层质地中壤。地势平坦，地力均匀，水浇条件良好。
试验设6个处理，对照处理和施用微生物菌剂1～5的处理。每个处理设3个重复小区，小区面积20平方米，48株苗(一垄两行，每行8株)。对照处理和微生物菌剂处理的底肥施肥量相同，如下：底肥每亩普通有机肥(干兔子粪)665kg，(14～16～15)三元复合肥50kg。起垄前条施在栽培行。后期依据长势冲施等量水溶肥料。微生物菌剂的处理是在移苗定植后使用微生物菌剂，对照处理用等量清水代替。
微生物菌剂于黄瓜定植缓苗后2个周内使用，使用量每亩5L，使用前兑100L水，用喷壶喷灌根部附近的区域，或者随滴灌设备使用。
试验结果：黄瓜每周计产，统计每个小区7～9月份的黄瓜产量进行分析。5个微生物菌剂处理较对照处理均有不同程度增产，增产效果如表1。
表1供试微生物菌剂对黄瓜的增产效果

Claims (9)

1.一种利用胶冻样芽胞杆菌共存保存枯草芽胞杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌经活化后，接入种子液体培养基I中，经种子培养后，接种于发酵培养基I中，在温度33～37℃、通气量1.33～1.88vvm的条件下发酵培养26～36h，制得孢子浓度为20～50亿/ml的枯草芽孢杆菌菌液；
所述的发酵培养基I组分如下：
玉米粉40～60g/L，豆粕粉30～40g/L，硫酸镁10～15g/L，葡萄糖8～10g/L，K2HPO41～1.5g/L，pH7.0～7.5；
(2)将胶冻样芽胞杆菌经活化后，接入种子液体培养基II中，经种子培养后，接种于发酵培养基II中，在温度30～33℃、通气量1.60～2.00vvm、转速160～180rpm的条件下发酵培养12～14h；然后在通气量2.2～2.7vvm、转速180～220rpm的条件下，继续发酵培养12～14h，制得菌体浓度为10～20亿/ml的胶冻样芽胞杆菌菌液；
所述的发酵培养基II组分如下：
蔗糖或葡萄糖15～20g/L，K2HPO40.2～0.5g/L，MgSO40.2～0.4g/L，NaCl 0.2～0.4g/L，(NH4)2SO41.0～3.0g/L，CaCO33.0～5.0g/L，酵母粉1.0～2.0g/L，pH7.0～8.0；
(3)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌菌液与步骤(2)制得的胶冻样芽胞杆菌菌液混合均匀，枯草芽孢杆菌菌液占总体积的体积百分比为40～60％，胶冻样芽胞杆菌菌液占总体积的体积百分比为40～60％，制得胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，活化温度为：33～37℃，活化时间为22～24h，活化培养基组分如下：
牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉15g/L，水定容至1L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，种子培养温度为：33～37℃，转速150～200rpm，培养时间为22～24h，种子液体培养基I组分如下：
牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC04181、ACCC 06374或ACCC 06185。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，活化温度为：30～33℃，活化时间为24～36h，活化培养基组分如下：
蔗糖或葡萄糖10～15g/L，K2HPO40.2～0.5g/L，MgSO40.1～0.2g/L，NaCl 0.1～0.2g/L，CaCO32.0～3.0g/L，酵母粉0.2～1.0g/L，琼脂粉15g/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，种子培养温度为：30～33℃，转速150～200rpm，培养时间为20～24h，种子液体培养基II组分如下：
蔗糖和/或葡萄糖10～15g/L，K2HPO40.2～0.5g/L，MgSO40.1～0.2g/L，NaCl 0.1～0.2g/L，CaCO32.0～3.0g/L，酵母粉0.2～1.0g/L，琼脂粉15g/L。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的胶冻样芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：ACCC10013；或者，来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC 1.153，CGMCC 1.231，CGMCC 1.232，CGMCC 1.910。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中的接种体积均为5％～10％(体积百分比)。
9.权利要求1制备的胶冻样芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌混合菌剂在制备微生物肥料中的应用。
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