CN103045506A

CN103045506A - 一种连作障碍自毒物质降解菌及其制备的复合微生物肥料

Info

Publication number: CN103045506A
Application number: CN2012105325585A
Authority: CN
Inventors: 何志刚; 娄春荣; 安景文
Original assignee: Liaoning Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Liaoning Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2032-12-11
Also published as: CN103045506B

Abstract

本发明涉及一种连作障碍自毒物质降解菌及其制备的复合微生物肥料。自毒物质降解菌其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6896，保藏日期为2012年11月28日，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。一种复合微生物肥料由重量比为2～3∶7～8的复合微生物菌剂和腐植酸氨组成。本发明通过降解土壤中自毒物质，改善土壤团粒结构，营造有益菌群优势，促进了土壤团粒结构的形成，极大地改善了土壤的微生态系统，增强了土壤透气性，提高了土壤保水保肥能力。本发明使土壤有了可持续增产增收的发展潜力。并且有效转化底肥，释出小分子养份与活性因子，改良土壤肥力，解除化肥、农药及有害因子对土壤的破坏，克服连作障碍。

Description

一种连作障碍自毒物质降解菌及其制备的复合微生物肥料

技术领域

本发明涉及一种连作障碍土壤中自毒物质降解菌改良作物品质的应用，属于微生物肥料，更具体的说，是涉及一种连作障碍自毒物质降解菌及其制备的复合微生物肥料。

背景技术

随着栽培年限的增加，土壤自毒物质累计、次生盐渍化现象不断出现并日益加重，严重影响了作物的产量和品质，阻碍作物生产的可持续发展。此外，土壤中自毒物质的连年累计使得土壤微生态环境趋于恶性循环。

总之，一种可以改善土壤团粒结构，营造有益菌群的连作障碍自毒物质降解菌及其制备的复合微生物肥料尚未见报道。

发明内容

本发明就是针对上述问题，提供了一种连作障碍自毒物质降解菌及其制备的复合微生物肥料。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种自毒物质降解菌的保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.6896，保藏日期为2012年11月28日，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，

所述自毒物质降解菌的分离方法包括如下步骤：

（1）菌株的分离

采用逐渐提高苯甲酸浓度的驯化方法，将连作10年的番茄根系土壤悬液按10%的接种量接种于含有100mg／L苯甲酸的无机盐培养基中，30℃下摇床150r／min，培养3天后，以10％接种量转至苯甲酸浓度为300mg／L的无机盐培养基中，继续培养。按此方式连续循环3次，三次所用的无机盐培养基，苯甲酸的浓度依次为300mg／L、600mg／L、1000mg／L，然后进行平板涂布，将培养皿放于30℃恒温培养箱中培养72h，挑取单菌落，转接入苯甲酸浓度为1000mg／L的无机盐培养基中，反复涂布，得到苯甲酸降解菌菌悬液；

所述的无机盐培养基的组成为（NH₄）₂SO₄ 2g／L，KH₂PO₄ 2g／L，Na₂HPO₄ 1.3g／L，苯甲酸100～1000mg／L，NaCl 5g／L，余量为水；培养基的PH=6.8～7.2；

（2）菌株的筛选与鉴定

a.初筛：将5ml步骤（1）所述的无机盐培养基加到15mm×150mm试管中，121℃下灭菌30min后冷却，接着将1ml步骤（1）得到的苯甲酸降解菌菌悬液加入到试管中，每株菌重复2管，28℃下避光培养5天，每24h观察记录1次生长情况；

b、复筛：将50ml步骤（1）所述的无机盐培养基加到250ml三角瓶中,121℃下灭菌30min后冷却，接着将1ml初筛得到的苯甲酸降解菌菌悬液加入到三角瓶中，加入1ml无菌水，每处理重复3次，28℃下避光培养10天，检测苯甲酸残留量，同时设立空白对照组，空白对照组中用水代替无菌水，计算降解率。

c．鉴定：对复筛获得的菌株进行16SrDNA序列测定，

采用通用引物进行PCR扩增，反应总体系为，取PCR产物1ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测．用琼脂糖凝胶纯化试剂盒（购自大连宝生物公司）切胶回收PCR产物进行测序分析，

菌株的16SrDNA序列测序结果登录GenBank，并用BLAST与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比较，将得到的相似菌株的16SrDNA，利MEGA4.0软件,构建系统发育树,分析各分离菌株的进化地位。

复合微生物肥料由重量比为2～3：7～8的复合微生物菌剂和腐植酸氨组成。

所述的复合微生物菌剂的制备方法为，将自毒物质降解菌、固氮菌、硅酸盐细菌按照1:1:2的菌株比例置于培养基中，在pH=7.0～7.2,温度为35～39℃的条件下培养12-18小时，得到的产物复合微生物菌剂。

所述肥料的制备方法为，

（1）将自毒物质降解菌、固氮菌、硅酸盐细菌按照1:1:2的菌株比例置于培养基中，在pH=7.0～7.2,温度为35～39℃的条件下培养12-18小时，得到的复合微生物菌剂；

（2）将有机质大于45wt%的煤炭腐殖酸、硫酸铵、水按重量比为4～6：0.8～1.2：0.4～0.6混拌均匀后封闭起来，在25℃下进行氨化螯合反应，反应5～10天得到腐植酸氨；

（3）将复合微生物菌剂和腐植酸氨按照2～3：7～8的重量比混合后得到终产物复合微生物肥料。

步骤（1）中培养基的组成及重量配比为，豆饼粉2～3%，麦麸0.5～1%,(NH₄)₂SO₄ 0.5～1%，K₂HPO₄ 0.07～0.1%，KH₂PO₄ 0.03～0.5%，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.05%，余量为水；

步骤（1）中培养基的组成及重量配比为，豆饼粉2%，麦麸0.5%,(NH₄)₂SO₄ 0.5%，K₂HPO₄ 0.07%，KH₂PO₄ 0.03%，MgSO₄·7H₂O0.01%，余量为水。

步骤（2）中煤炭腐殖酸、硫酸铵、水的重量比为5：1：0.5。

步骤（2）中煤炭腐殖酸的细度为100～120目。

步骤（3）中，复合微生物菌剂和腐植酸氨的重量比为3:7。

本发明的优点是：

1、本发明通过降解土壤中自毒物质，改善土壤团粒结构，营造有益菌群优势，促进了土壤团粒结构的形成，极大地改善了土壤的微生态系统，增强了土壤透气性，提高了土壤保水保肥能力。

2、本发明使土壤有了可持续增产增收的发展潜力。并且有效转化底肥，释出小分子养份与活性因子，改良土壤肥力，解除化肥、农药及有害因子对土壤的破坏，克服连作障碍。

3、本发明生产的肥料产品离子活性较强，具有调酸碱能力、缓释、长效的特点，成本低廉，施用后可以有效改善改良土壤理化性状，提高种子出苗率，增强秧苗的抗旱、抗寒、病虫害的能力，可以显著提高农产品中微量元素的含量，满足人们对农产品品质的需求。

4、本发明可单独使用，也可按照一定的比例加入到单元素和多元素的大量肥料中。加入到复合肥料中制成高端多元素复合肥料；加入到单元素的肥料中，能提高单元素的利用率和有效性。

5、本发明以豆饼粉、麦麸等有机物料为培养基主要成分，以分离筛选到的自毒物质降解菌、PGPR菌株为原始菌种，发酵培养后形成具有调节作物营养平衡及生长态势，增强抗病性，降低病虫害的发生率，减少农药用量的作用。促进有益菌大量繁殖，有效抑制土壤传染性病害的发生，增强植株抗病能力，延缓植株老化多种天然抑菌酵素强效防治土壤传染性病虫害的发生。

6、本发明将微生物和腐殖酸熬合剂相结合。本发明生产的复合微生物肥料，适用于各种农作物，提高肥料利用率15%以上，增产 10%。可作为底肥一次性施入，省工省时省力省钱。

7、本发明生产工艺极其简单。本发明所提到的粒状肥料，生产工艺极易于现代的复合肥生产工艺相结合，在原有的复合肥生产设备基础上进行生产造粒。工艺方法简单，有利于在肥料工业生产中推广使用。

8、本发明制得的产物可提高作物的营养成分如氨基酸、维生素C、糖类等成分的含量，促进植株根系旺盛，降低硝酸盐含量，改善农产品品质。

9、本发明制得的产物可调节作物营养平衡及生长态势，增强抗病性，降低病虫害的发生率，减少农药用量。促进有益菌大量繁殖，有效抑制土壤传染性病害的发生，增强植株抗病能力，延缓植株老化多种天然抑菌酵素强效防治土壤传染性病虫害的发生，如猝倒病、枯萎病、青枯病、线虫、根腐病等。

具体实施方式

一种自毒物质降解菌的保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6896，保藏日期为2012年11月28日，

所述自毒物质降解菌的分离方法包括如下步骤：

（1）菌株的分离

（2）菌株的筛选与鉴定

c．鉴定：对复筛获得的菌株进行16SrDNA序列测定，

实施例1

将自毒物质降解菌、固氮菌、硅酸盐细菌按照1:1:2的菌株比例置于培养基中，在pH=7.0,温度为39℃的条件下培养16小时，得到的复合微生物菌剂；培养基的组成及重量配比为，豆饼粉2%，麦麸0.5%,(NH₄)₂SO₄ 0.5%，K₂HPO₄ 0.07%，KH₂PO₄ 0.03%，MgSO₄·7H₂O 0.01%，余量为水。

接着将有机质大于45wt%的煤炭腐殖酸、硫酸铵、水按重量比为5：1：0.5混拌均匀后封闭起来，在25℃下进行氨化螯合反应，反应10天得到腐植酸氨。

最后，将复合微生物菌剂和腐植酸氨按照3：7的重量比混合后得到终产物复合微生物肥料。

肥料的PH=1～3、腐殖酸含量为5-10wt%，有效活菌数达到108。

实施例2

将10公斤实施例1制得的复合微生物肥料加入到40公斤的复合肥15-15-15（即氮、磷和钾的质量含量各为15%）中，混均并基施到1亩番茄大棚中，对照组为复合肥15-15-15，同样的施用量、培养条件和培养时间，本发明产品的番茄总产量比对照组增产17.8%，经济效益也相应提高了，详见表1。

表1不同处理对番茄产量的影响

其他农作物同样适用该肥料。

Claims

1.一种自毒物质降解菌，其特征在于，其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6896，保藏日期为2012年11月30日。

2.一种自毒物质降解菌的分离筛选方法，其特征在于，

所述自毒物质降解菌的分离方法包括如下步骤，

（1）菌株的分离

采用逐渐提高苯甲酸浓度的驯化方法，将连作10年的番茄根系土壤悬液按10%的接种量接种于含有100mg／L苯甲酸的无机盐培养基中，30℃下摇床150r／min，培养3天后，以10％接种量转至苯甲酸浓度为300mg／L的无机盐培养基中，继续培养；

按此方式连续循环3次，三次所用的无机盐培养基，苯甲酸的浓度依次为300mg／L、600mg／L、1000mg／L，然后进行平板涂布，将培养皿放于30℃恒温培养箱中培养72h，挑取单菌落，转接入苯甲酸浓度为1000mg／L的无机盐培养基中，反复涂布，得到苯甲酸降解菌菌悬液；

所述的无机盐培养基的组成为（NH_４）_２SO_４2g／L，KH_２PO_４2g／L，Na_２HPO_４1.3 g／L，苯甲酸100～1000m g／L，NaCl 5 g／L，余量为水；培养基的PH=6.8～7.2；

（2）菌株的筛选与鉴定

a.初筛：将5ml步骤（1）所述的无机盐培养基加到15mm×150mm试管中，121℃下灭菌30min后冷却，接着将1 ml步骤（1）得到的苯甲酸降解菌菌悬液加入到试管中，每株菌重复2管，28℃下避光培养5天，每24h观察记录1次生长情况；

b、复筛：将50ml步骤（1）所述的无机盐培养基加到250ml三角瓶中, 121℃下灭菌30min后冷却，接着将1ml初筛得到的苯甲酸降解菌菌悬液加入到三角瓶中，加入1ml无菌水，每处理重复3次，28℃下避光培养10天，检测苯甲酸残留量，同时设立空白对照组，空白对照组中用水代替无菌水，计算降解率；

c．鉴定：对复筛获得的菌株进行16SrDNA序列测定，

采用通用引物进行PCR扩增，反应总体系为，取PCR产物1ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测．用琼脂糖凝胶纯化试剂盒切胶回收PCR产物进行测序分析；

菌株的16SrDNA序列测序结果登录GenBank，并用BLAST与GenBank中的16SrDNA序列进行同源性比较，将得到的相似菌株的16SrDNA，利MEGA4.0软件，构建系统发育树，分析各分离菌株的进化地位。

3.一种复合微生物肥料，其特征在于，其由重量比为2～3：7～8的复合微生物菌剂和腐植酸氨组成。

4.根据权利要求3所述的复合微生物肥料，其特征在于，所述的复合微生物菌剂的制备方法为，将自毒物质降解菌、固氮菌、硅酸盐细菌按照1:1:2的菌株比例置于培养基中，在pH=7.0～7.2,温度为35～39℃的条件下培养12-18小时，得到的产物复合微生物菌剂。

5.一种复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述肥料的制备方法为，

6.根据权利要求5所述的复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤（1）中培养基的组成及重量配比为，豆饼粉2～3%，麦麸0.5～1%, (NH₄)₂SO₄ 0.5～1%，K₂HPO₄ 0.07～0.1%，KH₂PO₄ 0.03～0.5%，MgSO₄·7H₂O 0.01～0.05%，余量为水。

7.根据权利要求6所述的复合微生物肥料的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中，培养基的组成及重量配比为，豆饼粉2%，麦麸0.5%, (NH₄)₂SO₄ 0.5%，K₂HPO₄ 0.07%，KH₂PO₄ 0.03%，MgSO₄·7H₂O 0.01%，余量为水。

8.根据权利要求5所述的复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，煤炭腐殖酸、硫酸铵、水的重量比为5：1：0.5。

9.根据权利要求5所述的复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，煤炭腐殖酸的细度为100～120目。

10.根据权利要求5所述的复合微生物肥料的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，复合微生物菌剂和腐植酸氨的重量比为3:7。