CN112481157A - 烟草化感自毒物质降解菌、复合菌剂可湿性粉剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于烟草青枯病防治技术领域，尤其涉及烟草化感自毒物质降解菌、复合菌剂可湿性粉剂及应用。本发明通过筛选能够降解化感自毒物质的降解菌，最终针对化感自毒物质邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、苯甲酸、3‑甲氧基‑4‑羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛或2,4‑二叔丁基苯酚获得六株降解菌，将其应用于烟草青枯病的防治能够避免通过物理方法和化学方法产生对环境有害的物质，同时降解菌利用化感物质作为营养成分，使得土壤中的化感自毒物质含量减少，从而减少了化感自毒物质对青枯菌的刺激生长效应，切断了化感自毒物质对青枯菌的趋化诱导效应。

Description

烟草化感自毒物质降解菌、复合菌剂可湿性粉剂及应用

技术领域

本发明属于烟草青枯病防治技术领域，尤其涉及烟草化感自毒物质降解菌、复合菌剂可湿性粉剂及应用。

背景技术

烟草青枯病在烟叶生产中备受关注，烟草青枯病的防治成为了烟叶生产相关领域研究热点之一。目前防治青枯病的策略主要包括化学防治，生物防治和农业防治，其中化学防治存在后期防效差，长期施用导致病菌产生抗药性的缺点，而品种选育成功率低是农业防治中的关键性难题。生物防治方法因其安全无公害和长效等优点成为烟草青枯病防治的热点。在烟草青枯病的研究中发现，根系分泌的化感自毒物质的积累是导致青枯病发生的原因之一。因此，减少根系分泌的化感自毒物质，筛出能够降解化感自毒物质的降解菌，从而防治青枯病的发生具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了烟草化感自毒物质降解菌、复合菌剂可湿性粉剂及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，烟草化感自毒物质降解菌，所述降解菌包括保藏编号为CCTCC M2020589的Bacillus megaterium ED2降解菌，或保藏编号为CCTCC M 2020593的Bacillus amyloliquefaciens YZ1降解菌，或保藏编号为CCTCC M 2020588的Bacillusamyloliquefaciens B4降解菌，或保藏编号为CCTCC M 2020590的Bacillus sp.N01降解菌，或保藏编号为CCTCC M 2020591的Bacillus sp.N013降解菌，或保藏编号为CCTCC M2020592的Bacillus amyloliquefaciens SD2降解菌中的至少一种。

本发明所涉及的烟草化感自毒物质降解菌均已于2020年10月16日保藏至中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心并存活，邮编：430072。

进一步地，所述化感自毒物质包括邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛或2,4-二叔丁基苯酚中的至少一种。

进一步地，所述Bacillus megaterium ED2降解菌降解邻苯二甲酸二丁酯或对羟基苯甲醛中的至少一种，所述Bacillus amyloliquefaciens YZ1降解菌降解邻苯二甲酸二异丁酯，所述Bacillus amyloliquefaciens B4降解菌降解苯甲酸或对羟基苯甲醛中的至少一种，所述Bacillus sp.N01降解菌降解3-甲氧基-4-羟基苯甲酸，所述Bacillussp.N013降解菌降解对羟基苯甲醛，所述Bacillus amyloliquefaciens SD2降解2,4-二叔丁基苯酚。

如上述的烟草化感自毒物质降解菌在降解烟草化感自毒物质中的应用。

如上述的烟草化感自毒物质降解菌在制备烟草青枯病防治试剂中的应用。

一种复合菌剂可湿性粉剂，包括如上述的烟草化感自毒物质降解菌及粉剂助剂。

进一步地，所述粉剂助剂包括载体、分散剂、润湿剂、高温稳定剂及紫外保护剂。

进一步地，所述载体为白炭黑，用量百分比为20％；所述分散剂为六偏磷酸钠，用量百分比为2％；所述润湿剂为洗衣粉，用量百分比为2％；所述高温稳定剂为甘油，用量百分比为1％；所述紫外保护剂为维生素C，用量百分比为1％。

如上述的一种复合菌剂可湿性粉剂在防治青枯病中的应用。

进一步地，所述青枯病包括烟草青枯病。

2,4-二叔丁基苯酚或邻苯二甲酸二异丁酯或邻苯二甲酸二丁酯或苯甲酸或对羟基苯甲醛或香草酸在制备促进青枯菌生长的试剂中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明通过筛选能够降解化感自毒物质的降解菌，避免通过物理方法和化学方法产生对环境有害的物质，同时降解菌利用化感物质作为营养成分，使得土壤中的化感自毒物质含量减少，从而减少了化感自毒物质对青枯菌的刺激生长效应，切断了化感自毒物质对青枯菌的趋化诱导效应。

附图说明

图1是化感自毒物质降解菌液相降解图；

图2是邻苯二甲酸二丁酯降解菌(左)、苯甲酸降解菌(右)与青枯菌的拮抗性；

图3是邻苯二甲酸二异丁酯降解菌与青枯菌的拮抗性；

图4是复合菌剂成品。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明披露了烟草化感自毒物质降解菌、复合菌剂可湿性粉剂及应用，具体如下各实施例所示。本发明所涉及的烟草化感自毒物质降解菌已保藏至湖北武汉，武汉大学中国典型培养物保藏中心，相关信息如下：保藏编号为CCTCC M 2020589的Bacillusmegaterium ED2降解菌，保藏编号为CCTCC M 2020593的Bacillus amyloliquefaciensYZ1降解菌，保藏编号为CCTCC M 2020588的Bacillus amyloliquefaciens B4降解菌，保藏编号为CCTCC M 2020590的Bacillus sp.N01降解菌，保藏编号为CCTCC M 2020591的Bacillus sp.N013降解菌，保藏编号为CCTCC M 2020592的Bacillus amyloliquefaciensSD2降解菌。

实施例1

1、化感自毒物质成分

采取连作十年的烟田土壤，土壤提取液采用80％乙醇溶液提取，按照酸性、中性、碱性成分分离后采用GC-MS检测，其中碱性组分主要为长链烷烃类物质，表1中未列出，表1中物质为酸性和中性成分中检出物质，定量方法采用相对响应因子法，按照峰面积大小与内标化合物峰面积之比进行计算。得出6种物质，化感物质含量通过连作逐年递增。

表1化感自毒物质的含量百分比(％)

2、化感自毒物质降解菌的筛选

筛菌所用土壤采集于湖北大学生命科学学院排污口、沙湖淤泥、垃圾堆泥土，置于三角瓶中运回实验室。取各处采集的土壤10g于灭菌三角瓶内，加入无菌水90mL，37℃，230rpm，4h。配置含有化感自毒物质的带药基础盐培养液，培养基中各化感自毒物质保持在100mg/L，取10ml浑浊泥液置于100mL带药培养液中，置于37℃，230rpm条件下培养5d后取菌悬液10ml再次置于100mL带药培养液中，相同条件培养5d，反复进行3次循环训化。将最后一次培养训化后的菌液涂布于含上述化感物质的基础盐培养皿中，于37℃恒温培养箱内12h，观察菌落形态大小。选择形态鲜明的菌落划线于LB培养皿中，经反复多次纯化后得到单一菌落。所得菌种即为化感自毒物质降解菌。

3、降解菌的降解效率检测

将所有初步筛出的化感自毒物质降解菌于LB培养液中活化，接种1ml菌液于含100mg/L的基础盐带药培养液中(50ml)，37℃，230rpm培养48h后，采用萃取法将培养液中剩余的化感物质萃取，将萃取后的溶液用0.22μm滤膜过滤，置于液相瓶中。而后通过高效液相色谱法检测降解菌的降解效率。通过比较降解菌菌峰面积大小，最终得出各类化感自毒物质最佳降解菌。

液相条件：

邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯：流动相为甲醇：水＝95:5，流速1mL/min,紫外波长245mm，进样量20μl，柱温30℃。

对羟基苯甲醛：流动相为甲醇：水＝50:50，流速1mL/min,紫外波长227mm，进样量20μl，柱温30℃。

3-甲氧基-4-羟基苯甲酸：流动相为甲醇：1％甲酸水溶液＝40:60，流速1mL/min,紫外波长,290mm，进样量10μl，柱温30℃。

苯甲酸：流动相为甲醇：0.02mol/L乙酸铵＝5；95,流速1mL/min,紫外波长230mm，进样量10μl，柱温25℃。

2、4-二叔丁基苯酚：流动相为甲醇，流速1mL/min,紫外波长275mm，进样量20μl，柱温30℃。

降解菌降解率计算：降解率＝(培养基中初始化感物质浓度-培养基中剩余化感物质浓度)÷培养基中初始化感物质浓度×100％

实验结果：各类物质降解菌液相图出峰如图1。其中，a：3对羟基苯甲醛降解菌降解后对羟基苯甲醛残留量；b：3-甲氧基-4-羟基苯甲酸降解菌降解后3-甲氧基-4-羟基苯甲酸残留量；c：2、4-二叔丁基苯酚降解菌降解后2、4-二叔丁基苯酚残留量；d：邻苯二甲酸二异丁酯降解菌降解后邻苯二甲酸二异丁酯残留量；e：苯甲酸降解菌降解后苯甲酸残留量；f：邻苯二甲酸二丁酯降解菌降解后邻苯二甲酸二丁酯残留量。

化感自毒物质降解菌16s rRNA经BLAST对比及发育树鉴定后得到所属菌属，如下表2。

表2降解菌及降解率表

此外，为了更进一步检测降解菌是否具有同时降解多种化感物质的能力，将所得到的表2中的降解菌分别接种1mL于各自含100mg/L的基础盐带药培养液中(50ml)，37℃，230rpm培养48h后，采用萃取法将培养液中剩余的化感物质萃取，将萃取后的溶液用0.22μm滤膜过滤，置于液相瓶中。而后通过高效液相色谱法检测降解菌对其余化感自毒物质的降解效率。

实验结果表明：苯甲酸降解菌B4能同时降解对羟基苯甲醛，其降解效率为11.13±0.25％；邻苯二甲酸二丁酯降解菌Bacillus megaterium ED2也能同时降解对羟基苯甲醛，其降解效率为33.50±1.08％。

实施例2

1、降解菌对烟草青枯菌的拮抗效果

青枯菌HF1-1于湖北大学生命科学学院微生物实验室提供。

将各类化感自毒物质的降解菌用LB培养基活化，青枯菌用NA培养液活化。平板打孔含有涂布后的青枯菌的NA平板，将降解菌液加入孔中通过平板对峙实验检测降解菌与青枯菌之间的拮抗作用。

图2为邻苯二甲酸二丁酯降解菌(左)、苯甲酸降解菌(右)与青枯菌的拮抗性。图3为邻苯二甲酸二异丁酯降解菌与青枯菌的拮抗性。

实验结果表明，邻苯二甲酸二丁酯降解菌、邻苯二甲酸二异丁酯降解菌、苯甲酸降解菌与青枯菌有明显的拮抗作用，其他菌暂未发现该性能。

2、降解菌对烟草青枯病的防治效果

将6种降解菌制备成菌悬液后浇灌于盆栽烟苗。设置3组处理，T1：添加青枯菌组；T2：添加青枯菌和化感自毒物质组；T3：添加青枯菌，化感自毒物质和降解菌组。每组浇灌的青枯菌液浓度为5×107CFU/mL，化感自毒物质浓度为100mg/L，降解菌的浓度为5×107CFU/mL。烟苗接种青枯菌和化感自毒物质48h后接种化感自毒物质降解菌。接种7天后观察烟草枯萎症状。三组为一个平行，每组处理设置12株烟苗。

实验结果具体数据如下表3，当加入化感自毒物质后，均能够提高青枯病的发病率，而加入化感自毒物质降解菌后青枯病发病率会降低。Bacillus megaterium ED2处理后比T2-邻苯二甲酸二丁酯处理组的发病率降低了43.29％；Bacillus amyloliquefaciensYZ1处理后比T2-邻苯二甲酸二异丁酯处理组的发病率降低了50.78％；Bacillusamyloliquefaciens B4处理后比T2-苯甲酸处理组的发病率降低48.41％；Bacillussp.N01处理后比T2-3-甲氧基-4-羟基苯甲酸处理组的发病率降低了25.09％；Bacillussp.N013处理后比T2-对羟基苯甲醛处理组的发病率降低了29.24％；Bacillusamyloliquefaciens SD2处理后比T2-2,4-二叔丁基苯酚处理组的发病率降低了26.45％。

说明化感自毒物质降解菌能够有效缓解化感自毒物质的积累，降低青枯病的发生，对田间防治青枯病有一定的作用。

表3化感自毒物质及降解菌对青枯病的防治

处理组	发病率
		T1	48.68％±6.5％
T2-邻苯二甲酸二丁酯	69.39％±10.9％
		T3-Bacillus megaterium ED2	39.35％±9.2％
T2-邻苯二甲酸二异丁酯	57.30％±5.9％
		T3-Bacillus amyloliquefaciens YZ1	28.20％±4.62％
T2-苯甲酸	68.91％±11.24％
		T3-Bacillus amyloliquefaciens B4	35.55％±8.69％
T2-3-甲氧基-4-羟基苯甲酸	54.33％±7.2％
		T3-Bacillus sp.N01	40.7％±6.32％
T2-对羟基苯甲醛	90.3％±3.47％
		T3-Bacillus sp.N013	63.9％±10.22％
T2-2,4-二叔丁基苯酚	50.78％±3.91％
		T3-Bacillus amyloliquefaciens SD2	37.35％±6.88％

3、化感自毒物质刺激青枯菌生长和诱导青枯菌趋化诱导实验

选用内径为1mm的灭菌毛细管，在管中吸入浓度为100μmol/L的6种化感物质溶液，并垂直浸于青枯菌培养液培养皿内，静置40min，用注射器将毛细管内的液体移出，稀释为1×10-5后涂布于含有TTC的NA固体平板上，30℃培养18h后计数。每处理3次重复，以PBS缓冲液为对照。CK、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛和2,4-二叔丁基苯酚处理下青枯菌的菌落数分别为3.63×106cfu/mL、2.03×107cfu/mL、1.0×107cfu/mL、6.2×106cfu/mL、3.63×106cfu/mL、1.1×107cfu/mL、7.6×106cfu/mL、1.93×107cfu/mL。该实验证明化感物质对青枯菌具有趋化效应。

化感物质对青枯菌的生长的影响：配制浓度不同的化感自毒物质的NA液体培养基，然后接种1mL青枯菌液(1.0×109CFU/mL)，30℃培养12h后取菌悬液稀释10倍，在波长600nm下测定青枯菌的菌液浓度(CFU/mL)。实验结果如下表4所示：2,4-二叔丁基苯酚在0.8mg/L时具有最大的促进青枯菌的生长效应；邻苯二甲酸二异丁酯在1.5mg/L时具有最大的促进青枯菌的生长效应；邻苯二甲酸二丁酯在3.5mg/L时具有最大的促进青枯菌的生长效应；苯甲酸在0.3mg/L时具有最大的促进青枯菌的生长效应；对羟基苯甲醛在0.02mg/L时具有最大的促进青枯菌的生长效应；香草酸在0.1mg/L时具有最大的促进青枯菌的生长效应。

表4化感自毒物质刺激青枯菌生长和诱导青枯菌趋化诱导实验

实施例3

1、复合菌剂可湿性粉剂的制备

在实施例1和实施例2的基础上，为了让降解菌便于运输和贮存，将各自降解菌制备成复合菌剂，观察复合菌剂对烟草青枯病的防治效果。

复合菌剂的制备：

将Bacillus megaterium ED2，Bacillus amyloliquefaciens YZ1，Bacillussp.N01，Bacillus sp.N013，Bacillus amyloliquefaciens SD2，Bacillusamyloliquefaciens B4通过豆粕培养基发酵各个菌株。

可湿性粉剂选用的各种助剂分别如下：

载体：膨润土，硅藻土，白炭黑，滑石粉。

分散剂：木质素磺酸钠，焦磷酸钠，六偏磷酸钠，PEG8000。

润湿剂：皂角粉，拉开粉，洗衣粉。

高温稳定剂：羧甲基纤维素钠，黄原胶，甘油。

紫外保护剂：维生素C，糊精。

将70mL的发酵滤液与10g载体混合干燥后粉碎得到菌剂母粉。母粉与各助剂混合检测悬浮率，悬浮时间，芽孢含量。

表5不同载体条件下的实验结果

表6不同分散剂条件下的实验结果

分散剂	润湿时间	悬浮率
			焦磷酸钠	5s	39.11％
PEG8000	6s	40.22％
			木质素磺酸钠	8s	39.77％
六偏磷酸钠	6s	68.80％

表7不同润湿剂条件下的实验结果

润湿剂	润湿时间	悬浮率
			拉开粉	3s	43.56％
皂角粉	4s	40.22％
			洗衣粉	4s	60.22％

表8不同高温稳定剂条件下的实验结果

表9不同紫外保护剂条件下的实验结果

图4为制得的复合菌剂成品。

从以上实验结果最后选择白炭黑为载体，占20％；六偏磷酸钠为分散剂，占2％；洗衣粉为润湿剂，占2％；甘油为高温稳定剂，占1％；VC为紫外保护剂，占1％。具体操作如下：

各降解菌各自发酵后，控制所有发酵液稀释涂布后菌落约为4.09×109CFU/mL左右，各取10mL发酵液混合成60mL，与12g载体混合后80℃烘干16h制备成菌剂母粉，稀释涂布检测母粉所含芽孢含量，选择出最佳载体。再以白炭黑为载体的菌剂母粉的条件下，将按照质量配比，分散剂、润湿剂各占母粉的2％，高温稳定剂和紫外保护剂各占1％，筛出最佳助剂。将所得到的各种助剂全部与母粉组合后检测芽孢含量为3.7×1010CFU/mL。

2、复合菌剂的生物防治效果

将复合菌剂粉应用于田间防治青枯病，设置3组处理。T1：添加青枯菌组；T2：添加青枯菌和化感自毒物质组；T3：添加青枯菌，化感自毒物质和复合菌剂组。每组浇灌的青枯菌液浓度为5×10⁷CFU/mL，化感自毒物质(六种物质的混合物)浓度为100mg/L，复合菌剂粉稀释1000倍后浇灌，使得其菌剂中的有效菌液约为5×10⁷CFU/mL。烟苗接种青枯菌和化感自毒物质48h后接种复合菌剂。接种7天后观察烟草枯萎症状，统计青枯病发病率。三组为一个平行，每组处理设置12株烟苗。

处理组	发病率
		T1	50.44％±7.55％
T2	80.90％±9.2％
		T3	21.46％±4.42％

从以上结果得知复合菌剂发病率为21.46％％±4.42％，比T1和T2组分别降低了57.45％和73.47％，说明复合菌剂比单独施用降解菌具有更强的生物防治效果。

综上所述，化感自毒物质降解菌可以有效缓解土壤因化感自毒物质积累导致的青枯病发病率高的影响，对青枯病的发生具有一定的降低作用。将化感自毒物质制备成复合菌剂，更加能发挥降解菌的功能，达到对青枯病的防控效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.烟草化感自毒物质降解菌，其特征在于：所述降解菌包括保藏编号为CCTCC M2020589的Bacillus megaterium ED2降解菌，或保藏编号为CCTCC M 2020593的Bacillusamyloliquefaciens YZ1降解菌，或保藏编号为CCTCC M 2020588的Bacillusamyloliquefaciens B4降解菌，或保藏编号为CCTCC M 2020590的Bacillus sp.N01降解菌，或保藏编号为CCTCC2020591的Bacillus sp.N013降解菌，或保藏编号为CCTCC M2020592的Bacillus amyloliquefaciens SD2降解菌中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的烟草化感自毒物质降解菌，其特征在于：所述化感自毒物质包括邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛或2,4-二叔丁基苯酚中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的烟草化感自毒物质降解菌，其特征在于：所述Bacillusmegaterium ED2降解菌降解邻苯二甲酸二丁酯或对羟基苯甲醛中的至少一种，所述Bacillus amyloliquefaciens YZ1降解菌降解邻苯二甲酸二异丁酯，所述Bacillusamyloliquefaciens B4降解菌降解苯甲酸或对羟基苯甲醛中的至少一种，所述Bacillussp.N01降解菌降解3-甲氧基-4-羟基苯甲酸，所述Bacillus sp.N013降解菌降解对羟基苯甲醛，所述Bacillus amyloliquefaciens SD2降解2,4-二叔丁基苯酚。

4.如权利要求1-3任一所述的烟草化感自毒物质降解菌在制备烟草青枯病防治试剂中的应用。

5.2,4-二叔丁基苯酚或邻苯二甲酸二异丁酯或邻苯二甲酸二丁酯或苯甲酸或对羟基苯甲醛或香草酸在制备促进青枯菌生长的试剂中的应用。

6.一种复合菌剂可湿性粉剂，其特征在于，包括如权利要求1中所述的烟草化感自毒物质降解菌及粉剂助剂。

7.根据权利要求6所述的一种复合菌剂可湿性粉剂，其特征在于：所述粉剂助剂包括载体、分散剂、润湿剂、高温稳定剂及紫外保护剂。

8.根据权利要求7所述的一种复合菌剂可湿性粉剂，其特征在于：所述载体为白炭黑，用量百分比为20％；所述分散剂为六偏磷酸钠，用量百分比为2％；所述润湿剂为洗衣粉，用量百分比为2％；所述高温稳定剂为甘油，用量百分比为1％；所述紫外保护剂为维生素C，用量百分比为1％。

9.如权利要求6所述的一种复合菌剂可湿性粉剂在防治青枯病中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述青枯病包括烟草青枯病。

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