CN114317319A - 一株铜绿假单胞菌及其代谢产物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株铜绿假单胞菌及其代谢产物和应用。属于植保微生物应用技术领域。具体为一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)TS‑1保藏编号为GDMCC NO.61944，及其代谢产物和应用。本发明提供的铜绿假单胞菌TS‑1能够有效抑制青枯菌生长，可以用来防治和治疗由青枯菌引起的植物病害，从而达到减少农药施用的目的，确保农业可持续性发展，具有广阔的应用前景；本发明铜绿假单胞菌能够代谢分泌大量的2,4‑二叔丁基苯酚，具有良好的抑制青枯菌的作用。

Description

一株铜绿假单胞菌及其代谢产物和应用

技术领域

本发明涉及植保微生物应用技术领域，更具体的说是涉及一株铜绿假单胞菌及其代谢产物和应用。

背景技术

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是一种重要的土传病原菌，具有广泛的寄主范围，可侵染50多科450余种植物。其引起的烟草青枯病是限制我国烟草生产的主要病害之一。青枯雷尔氏菌通过根部伤口、根尖或次生根进入烟草根部，最终定殖于木质部，继而产生大量的胞外多糖堵塞维管束组织，造成叶片萎蔫、发黄坏死，最终导致烟株死亡，直接影响着我国烟叶的品质和产量，也造成了巨大的经济损失。目前，防治青枯病多采用化学防治、土壤添加剂防治和传统综合防治。传统综合防治法受耕作方式和品种的限制，目前甚少高抗品种。化学药剂防治常用广谱杀菌剂，包括百菌清、多菌灵、可杀得等，虽能延缓发病，但防控效果不甚理想，并且长期使用化学药剂会使病菌产生耐药性，污染土壤及水资源，给人畜带来危害。目前市场上尚未有针对青枯病的高效低毒和无环境污染的化学药剂。

鉴于化学防治和传统综合防治存在的不足，国内外利用有益微生物防治病虫害逐渐成为研究热点。生防细菌具有生长繁殖快、数量大，种类多，获取途径简单，作用方式多样等特点，在植物病害生物防治的研究和实践中作用显著。然而，综合考虑生产成本、防控性能和安全性等因素，该研究的推广应用前景尚不明确。因此，寻找有效防治青枯病的技术与方法，仍是当今植物病理学研究的重要课题之一。

此外，天然次生代谢产物是研发新药或者先导化合物一种重要来源。例如，目前市场上抗癌药物中63％抗癌药物都是直接或者间接从天然产物中获得，特别是抗感染药物，约占70％。许多生防菌都能在代谢过程中代谢出一些抑制病原菌生长的物质，如一些特殊蛋白细菌毒素、抗生素、几丁质等一些酶类等，直接抑制了病原菌的生长和代谢活动，在效果极强的抗菌物质作用下，甚至能使病原菌失活。

因此，如何筛选出具有广谱抑菌活性的高效生防细菌及其次生代谢产物是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株铜绿假单胞菌及其代谢产物和应用。根据其所分泌产物的特性，提出了应用途径，以期实现作物青枯病的生物防治，或提取到效果良好的抑菌活性物质，在作物生长过程中，植物内生菌是长期共生或寄生在宿主内部组织中，而不对植物引发致病反应的微生物。自然界中，植物和内生菌落的相互作用具有高度动态性和复杂性。有益的内生菌能够维持植物的生长健康和产生理想的次生代谢产物。内生菌通过与植物共生诱导产生与植物体相类似的次生代谢产物，具有重要的药用和经济价值。

基于此，本发明人对茄科青枯病发生部位内生微生物进行分离筛选，并从中筛选得到一株能够抑制青枯菌生长的铜绿假单胞菌TS-1，该菌株于2021年9月23日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC，地址:广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼)，其保藏编号为GDMCC NO.61944。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)TS-1，其保藏编号为GDMCCNO.61944。

本发明还提供了一种生防制剂，含铜绿假单胞菌TS-1保藏编号GDMCC NO.61944、及其代谢产物、液体发酵物中的至少一种。

优选的：代谢产物含2,4-二叔丁基苯酚。

本发明还提供了上述生防制剂的制备方法，包括如下步骤:

1)将铜绿假单胞菌TS-1在LB固体培养基上划线，30～32℃、避光培养24-48h；2)挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30～32℃，150～180rpm/min避光培养70～72h，得液体发酵物；

3)将液体发酵物按常规工艺制得生防制剂。

本发明还提供了上述铜绿假单胞菌TS-1，保藏编号为GDMCC NO.61944在防治作物青枯病中的应用。

本发明还提供了上述铜绿假单胞菌TS-1，保藏编号为GDMCC NO.61944或/和其代谢产物在制备2,4-二叔丁基苯酚中的应用。

本发明还提供了上述生防制剂在防治作物青枯病中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株铜绿假单胞菌及其代谢产物和应用，取得的技术效果：

本发明铜绿假单胞菌TS-1能够特异的抑制青枯菌，可以用来防治和治疗由青枯菌引起的植物病害，从而达到减少农药施用的目的，以确保农业健康可持续性发展，具有广阔的应用前景；

本发明铜绿假单胞菌TS-1能够代谢分泌大量的挥发性物质2,4-二叔丁基苯酚；具有良好的抑制青枯菌的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的铜绿假单胞菌TS-1菌落形态图。

图2附图为本发明提供的铜绿假单胞菌TS-1系统发育树示意图。

图3附图为本发明提供的铜绿假单胞菌TS-1发酵液氯仿萃取上层抑菌效果图。

图4附图为本发明提供的气质鉴定分析质谱图。

图5附图为本发明提供的气质鉴定分析质谱图。

图6附图为本发明提供的2,4-二叔丁基苯酚抑制青枯菌电镜图。

图7附图为本发明提供的2,4-二叔丁基苯酚抑制青枯菌电镜图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一株铜绿假单胞菌及其代谢产物和应用。

实施例1

菌株的筛选及鉴定：

将从青枯病发病部分分离纯化到的多株细菌菌株进行青枯菌拮抗实验，通过拮抗实验成功筛选到一株细菌菌株，命名为菌株TS-1，菌落形态如图1所示。

该菌在LB普通琼脂上培养后形成大而扁平菌落，能产生蓝绿色色素，且扩散于培养基中。菌株经16s、GyrPA、OprI测序及比对分析鉴定为一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)菌株，系统发育树如图2所示。

实施例2

拮抗试验：

将青枯(雷尔氏)菌菌株RS91和铜绿假单胞菌TS-1接种到LB培养基平板上，30～32℃恒温培养，待菌落长出后接种到LB液体培养中，150～180rpm，30～32℃恒温培养24h，备用。

LB培养基采用北京索莱宝科技有限公司生产的LB肉汤，称取32克，溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，备用。

以青枯病菌为受试菌，平板对峙法对TS-1进行多次重复筛选。将60～100μL培养1d的青枯病菌悬液涂布均匀在平板上，静置30min后，将直径6mm的无菌滤纸片贴至涂菌后的平板，滴加5～10μL的TS-1于无菌滤纸片，于30～32℃培养2d，设置两个平行实验，观察和测量抑菌圈大小。

实施例3

次级代谢产物的分离及鉴定：

将铜绿假单胞菌在固体培养基上划线，30～32℃、避光培养70～72h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30～32℃，150～180rpm/min、避光培养70～72h。TS-1菌体发酵液经8000rpm离心10min后得到上清液，用等体积氯仿反复萃取发酵上清液3次，然后用真空旋转蒸发仪对有机相进行40℃浓缩干燥，用适量氯仿溶解沉淀并进行生物活性测定(图3，正常情况下是红色，加了氯仿上层就是无色，说明菌没长出来)后，对产物进行气质鉴定分析(图4、5)。

结果表明：产物主要为2,4-二叔丁基苯酚。

实施例4

2,4-二叔丁基苯酚抑青枯菌生长分析：

将2,4-二叔丁基苯酚配置成1M的母液，过滤备用(直径13mm，孔径0.22um)：在无菌操作台中用移液枪吸取2,4-二叔丁基苯酚备用母液0.5、1、2、5、10μL分别加入到10mL LB培养液中，以甲醇对照(CK)，设置三个重复；取备用青枯菌(青枯雷尔氏菌)菌液100μL(OD值＝1.0)接种于10mL带药培养液中，在摇床30～32℃，150～180rpm下震荡培养；培养过程中每3、6、9、12h取样一次，在紫外分光光度计600nm下测定样品的吸光度并记录。结果如下表1所示，2,4-二叔丁基苯酚不同浓度处理后对青枯菌的生长均有影响。

表1

实施例5

扫描电镜观察青枯菌细胞形态变化：

在30mL带药LB培养液中加入OD₆₀₀＝1.0的青枯菌液100μL，使其所含2,4-二叔丁基苯酚终浓度均为1μL/10mL，于摇床内180rpm/min，30～32℃下震荡培养24h；吸取1.0mLOD₆₀₀＝1.6的青枯菌液于高速离心机中5000r/min下离心10min。舍弃上清液，加入0.1M PBS缓冲液漂洗，离心后弃去上清液，重复三次；移液管吸取5001μL 2.5％(v/v)戊二醛并吹打沉淀至菌液均一，吸取少量菌液滴于盖玻片上，快速轻轻涂匀，放入4℃冰箱中固定12h；0.1M PBS缓冲液漂洗3次，每次10min；1％(w/v)锇酸在通风橱内固定30min；0.1M PBS缓冲液漂洗3次，每次10min；30％，50％，70％，80％，90％，100％(v/v)乙醇梯度脱水，每个梯度脱水10min；放入烘箱干燥过夜；扫描电镜观察青枯菌形态变化并拍照记录。细菌菌态如图6所示，细胞形态严重破损，细胞液体外漏。

实施例6

2,4-二叔丁基苯酚抑青枯菌膜形成

取3支1.5mL无菌离心管，标号1，2，3，在所有离心管中加入793.8μL LB培养液，再在1号管中加入42μL DMSO，2，3号管中分别加入1，2μL 2,4-二叔丁基苯酚母液，最后在所有离心管中加入4.2μL青枯菌液(OD₆₀₀＝1.0)，混匀后在96孔板中每孔加入200μL上述混合培养液(为了消除边缘效应，培养板的边缘孔不加培养物)，每个孔一次重复，每个处理六个重复；在30～32℃下静置培养48h；小心吸取培养物，加入无菌蒸馏水轻轻洗涤2次后弃去蒸馏水；加入220μL浓度为0.1％结晶紫染色液对生物膜染色，室温静置染色30min；染色后，去除结晶紫并用200μL蒸馏水清洗两次，去除浮色后室温干燥30min；加入200μL 95％(v/v)的乙醇溶解吸附于生物膜上的结晶紫30min，利用酶标仪测定其在490nm下的吸光值。实验通过酶标仪在OD₄₉₀nm下测定生物膜的形成情况，研究2,4-二叔丁基苯酚对茄科劳尔氏菌生物膜形成能力的影响。

结果显示，处理青枯菌24h后，0.05μL/mL下菌株的生物膜形成量较对照组显著性减少；在0.1μL/mL的高浓度下菌株生物膜形成量的减少较对照组与低浓度处理组呈显著性。48h后，低浓度处理下的菌株生物膜形成量较对照组显著性减少，高浓度下菌株生物膜形成量较对照组与低浓度处理组仍呈显著性减少。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)TS-1，其保藏编号为GDMCCNO.61944。

2.一种生防制剂，其特征在于，含铜绿假单胞菌TS-1保藏编号GDMCC NO.61944、及其代谢产物、液体发酵物中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的水生防制剂，其特征在于，所述代谢产物含2,4-二叔丁基苯酚。

4.权利要求2或3所述生防制剂的制备方法，包括如下步骤:

1)将铜绿假单胞菌TS-1在LB固体培养基上划线，30～32℃、避光培养24-48h；2)挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30～32℃，150～180rpm/min避光培养70～72h，得液体发酵物；

3)将液体发酵物按常规工艺制得生防制剂。

5.权利要求1所述铜绿假单胞菌TS-1，保藏编号为GDMCC NO.61944在防治作物青枯病中的应用。

6.权利要求1所述铜绿假单胞菌TS-1，保藏编号为GDMCC NO.61944或/和其代谢产物在制备2,4-二叔丁基苯酚中的应用。

7.权利要求2或3所述生防制剂在防治作物青枯病中的应用。

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