CN109593681A - 一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂及其制备方法和应用，复合菌剂包括枯草芽孢杆菌MES 810的发酵菌粉和解淀粉芽孢杆菌MES 812的发酵菌粉，两者的质量比为1:1。复合菌剂由枯草芽孢杆菌的发酵菌粉、解淀粉芽孢杆菌的发酵菌粉按质量比1:1充分混合后制得，且枯草芽孢杆菌的发酵菌粉中的活菌数不少于2.0×1010cfu/g，解淀粉芽孢杆菌发酵产物中的活菌数不少于4.0×109cfu/g。本发明制得的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂仅对蓝藻门的藻类有抑制作用，对其他有益藻类没有影响，是一种环境友好型产品。

Description

一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物菌剂水质调节技术领域，具体涉及一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
颤藻(Oscillatoria)和鞘丝藻(Phormidium)、微囊藻(Microcystis)分别属于蓝藻门、颤藻科、颤藻属和鞘丝藻属，是两种对水质危害较大的藻类，一旦其成为优势藻类，极易形成蓝藻水华。导致其他藻类无法生长，水体pH值和氨氮升高；蓝藻死亡时会造成水体溶解氧急剧降低，且产生大量蓝藻毒素造成养殖动物死亡。蓝藻水华频繁暴发对水体生态环境和养殖效益造成巨大影响。蓝藻(颤藻、鞘丝藻和微囊藻)对虾类养殖的影响更为巨大，发生蓝藻的池塘几近绝收，如何有效防控蓝藻水华的暴发是当前水产业的研究热点之一。
我国是世界上水产养殖面积最大的国家，近年来北方地区蓝藻水华的爆发有逐年升高的趋势。因此控制蓝藻爆发已成为北方水产养殖生产上急需解决的问题。
蓝藻水华形成原因较复杂，调控比较困难。有人用物理(吸附、过滤等)的方法来调节蓝藻，但该方法不适合于水产养殖池塘；也有化学方法(如硫酸铜)杀灭蓝藻的报道，但化学药物也同时杀灭其他藻类，且对养殖动物也会造成危害。有人用红霉素或青霉素来防治蓝藻，但是由于其较难分解，且对环境中的微生物形成了相应的抗性，导致耐药菌株的扩大，危害生态平衡。
目前利用微生物防治蓝藻水华是最经济、最环保、最简便的方法，且该方法对除蓝藻外的其他有益藻类没有影响。经检索，目前尚未发现仅用复合菌剂(枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌)防治蓝藻水华的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂及其制备方法和应用。本发明制得的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂仅对蓝藻门的藻类有抑制作用，对其他有益藻类没有影响，是一种环境友好型产品。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂，所述复合菌剂包括枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)MES 810的发酵菌粉和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) MES812的发酵菌粉，两者的质量比为1:1。
本发明还提供了一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，所述枯草芽孢杆菌 MES 810，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏日期为2017年8月10日，保藏编号为CGMCC No.14514。该菌种已在专利号CN201710862006.3专利名称：一种防治马铃薯枯萎病的菌株及其制剂的制备方法和应用，公开。
作为上述实施例的进一步改进，所述解淀粉芽孢杆菌MES 812，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年8月 10日，保藏编号为CGMCC No.14515。该菌种已在专利号CN201710947311.2，专利名称：一种防治枸杞根腐病死树的方法，公开。
作为上述实施例的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌MES 810的发酵菌粉中的活菌数不少于2.0×1010cfu/g，解淀粉芽孢杆菌MES 812发酵菌粉中的活菌数不少于4.0×109cfu/g。
本发明还提供了防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，将制得的枯草芽孢杆菌发酵菌粉和解淀粉芽孢杆菌发酵菌粉按质量比1:1的比例混合均匀，制得所述防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂，得到的复合菌剂中，含枯草芽孢杆菌不少于1.0×1010cfu/g，解淀粉芽孢杆菌不少于2.0×109cfu/g。。
作为上述实施例的进一步改进，所述枯草芽孢杆菌的发酵菌粉制备方法为，包括以下步骤：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株在摇瓶培养基中进行种子摇瓶培养，摇瓶培养条件为：转速200-230r/min，温度32-37℃，培养10-12h；
②一级种子培养：按5％-10％的接种量，取枯草芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃-37℃培养10-12h，制得一级种子培养液；
③二级种子培养：按0.06％-0.2％的接种量将一级种子培养液接种于二级种子培养基中；在30℃-38℃培养8-12h，制得二级种子培养液；
④发酵:按3.75％-10％的接种量将二级种子培养液接种于枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa，在30℃-38℃培养24-36h；
⑤至芽胞形成率大于等于90％时，结束发酵；
⑥将发酵液经喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌的菌粉。
作为上述实施例的进一步改进，所述摇瓶培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，氯化钠0.2-1％，营养琼脂1.5％-2.0％，其余为水，培养基pH为6.0-7.5；
一级种子培养所用培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，氯化钠0.2-1％，营养琼脂1.5％-2.0％，其余为水，培养基pH为6.0-7.5；在116℃-121℃湿热灭菌20-35min后使用；
二级种子培养所用培养基，按质量百分数计，具体为：葡萄糖0.3％-2％，玉米粉1％-5％，豆粕粉1％-5％，磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰-5‰，消泡剂0.2‰-2‰，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5；在115℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用；
发酵所用培养基，按质量百分数计，具体为：葡萄糖0.3％-2％，玉米粉1％-5％，豆粕粉 1％-5％，磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰-5‰，消泡剂0.2‰-2‰，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5；在15℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用。
作为上述实施例的进一步改进，所述解淀粉芽孢杆菌的发酵菌粉的制备方法为，包括以下步骤：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株在摇瓶培养基中进行种子摇瓶培养，摇瓶培养条件为：转速200-230r/min，温度32-37℃，培养10-12h；
②一级种子培养：按5％-10％的接种量将解淀粉芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃-37℃培养10-12h，制得一级种子培养液；
③二级种子培养：按0.06％-0.2％的接种量将一级种子培养液接种于二级种子培养基中，在30℃-38℃培养8-12h，制得二级种子培养液；
④发酵：按3.75％-10％的接种量将二级种子培养液接种于解淀粉芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa，在30℃-38℃培养24-36h；
⑤至芽胞形成率大于等于90％时，结束发酵；
⑥将发酵液经喷雾干燥制成解淀粉芽孢杆菌的菌粉。
作为上述实施例的进一步改进，所述解淀粉芽孢杆菌摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.3％-3％，蛋白胨0.3％-3％，氯化钠0.2-1％，营养琼脂1.5％-2.0％，其余为水，培养基pH为6.0-7.5；
一级种子培养所用培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.3％-3％，蛋白胨0.3％-3％，氯化钠0.2-1％，营养琼脂1.5％-2.0％，其余为水，培养基pH为6.0-7.5；在116℃-121℃湿热灭菌20-35min后使用；
二级种子培养所用培养基，按质量百分数计，具体为：葡萄糖0.2％-2％，玉米粉0.5％-5％，豆粕粉1％-5％，磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰-5‰，消泡剂0.2‰-2‰，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5；在115℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用；
发酵所用培养基，按质量百分数计，具体为：葡萄糖0.2％-2％，玉米粉0.5％-5％，豆粕粉1％-5％，磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰-5‰，消泡剂0.2‰-2‰，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5；在15℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用；。
本发明还提供了一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的应用，将复合菌剂加水稀释后，按每亩地1米水深用复合菌制剂200g-350g的施加量均匀的施入池塘中。
有益效果
本发明的复合菌剂中的枯草芽孢杆菌菌体自身合成a-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对蓝藻中的颤藻、鞘丝藻和微囊藻的外胶质层具有分解作用。
解淀粉芽孢杆菌在生长代谢过程中能产生多种抗菌物质如杆菌肽、细菌素、溶菌酶、生物表面活性剂、苯乙酸等；分泌多种多糖分解酶，如a-淀粉酶、果胶裂解酶、β-1,3-1,4-葡聚糖酶、纤维素酶等。不但有助于降解颤藻、鞘丝藻和微囊藻的外角质层而且能降解蓝藻的纤维素成分。
枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌通过竞争性利用水体营养物质，主要是C、N、P的竞争，降低水体中磷含量，抑制蓝藻的生长；同时复合菌剂的分泌物作为碳源被绿藻门藻类利用，能使绿藻在通蓝藻的竞争中处于优势种群，绿藻和芽孢杆菌群体优势的建立进一步抑制蓝藻的生长和生存空间，最终达到控制蓝藻的效果。枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的协同作用，增强了其防治蓝藻水华的作用效果。
本发明的复合菌剂仅对蓝藻门的藻类有抑制作用，对其他有益藻类没有影响，是一种环境友好型产品。
本发明的复合菌剂对水产养殖中的氨氮和亚硝酸盐有一定的降解作用，而且对改善水质老化、水质浑浊有调节作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本发明提供了一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂，所述复合菌剂包括枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)MES810的发酵菌粉和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)MES 812的发酵菌粉，两者的质量比为1:1。其中，枯草芽孢杆菌MES810的发酵菌粉中的活菌数不少于2.0×1010cfu/g，解淀粉芽孢杆菌MES 812发酵产物中的活菌数不少于4.0×109cfu/g。
本发明的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂中，枯草芽孢杆菌MES 810，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017 年8月10日，保藏编号为CGMCC No.14514。该菌种已在专利号CN201710862006.3专利名称：一种防治马铃薯枯萎病的菌株及其制剂的制备方法和应用，公开。
该复合菌株中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MES 810是我公司研发人员从张家口马铃薯田地里分离的，后经平板对峙实验，发现该菌株亦能显著抑制病原菌生长，出现较宽的抑菌带。
枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧菌，单个细胞0.7-0.8×2-3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢0.6-0.9×1.0-1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MES 812，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年8月10日，保藏编号为CGMCC No.14515。该菌种已在专利号CN201710947311.2，专利名称：一种防治枸杞根腐病死树的方法，公开。
该复合菌株解淀粉芽孢杆菌MES 812是2017年2月我公司研发人员从天津市西青区水产养殖池塘中分离的。当时共分离3株芽孢杆菌，经过平板划线，在32℃培养24小时，制成斜面菌种，4℃冷藏。挑取单菌落，做切片，经结晶紫染色，镜检，确定为解淀粉芽孢杆菌。以抑制蓝藻水华为靶标，分别用3株芽孢杆菌对其进行平板对峙实验，30℃培养，4天后发现其中一株芽孢杆菌能够显著抑制病原菌生长，出现较宽的抑菌带，命名为MES 812，后经农业部菌种检测机构鉴定，MES 812为解淀粉芽孢杆菌。
解淀粉芽孢杆菌为革兰氏阳性兼性厌氧菌。菌体为杆状，大小为0.6-0.8×2.0-4.5微米，内生芽孢，芽孢椭圆形，中生，芽孢囊不膨大；菌落在PDA培养基和NA培养基上呈乳白色菌落，表面光滑无褶皱，湿润、粘稠，边缘波状不齐，不产色素。解淀粉芽孢杆菌于pH5.0-9.0 均可良好生长，最适生长温度为28～30℃。
本发明的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法为：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MES810的发酵产物、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)MES812的发酵产物分别经喷雾干燥后，将干燥的发酵菌粉按质量比1:1比例混合，制得所述防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂。
其中，(1)枯草芽孢杆菌的发酵菌粉制备方法如下：
①「揺瓶培养：将经斜面活化的菌株MES810进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基。培养条件为：转速200r/min，温度32℃，培养10h；牛肉膏蛋白胨培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.5％，蛋白胨3％，氯化钠1％，营养琼脂1.5％，其余为水，培养基pH为6.0；
②一级种子培养：500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基，121℃湿热灭菌35min，取10mL枯草芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在37℃培养12h；一级种子培养所用培养基按质量分数计，为：牛肉膏3％，蛋白胨3％，氯化钠1％，营养琼脂2.0％，培养基pH为7.5；
③二级种子培养：在300L发酵罐中装有150L二级种子培养基，115℃湿热灭菌20min，将100一级种子接种于二级种子培养基中；在30℃培养8h；二级种子培养所用培养基按质量分数计，为:葡萄糖0.3％，玉米粉1％，豆粕粉1％，磷酸氢二钠0.1‰，磷酸二氢钠0.5‰，消泡剂0.2‰，培养基pH调为6.0；
④发酵:在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000L或20m3枯草芽抱杆菌活菌发酵培养基， 122℃湿热灭菌40min，将150L或200L二级种子接种于枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.07Mpa，在38℃培养36h；发酵所用培养基按质量分数计，为：葡萄糖2％，玉米粉 5％，豆粕粉5％，磷酸氢二钠0.5‰，磷酸二氢钠5‰，消泡剂2‰，培养基pH调为7.5；
⑤至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵；
⑥将上述发酵液经喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌发酵菌粉：
⑦枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数不少于2.0×1010cfu/g。
⑧尾气处理：采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
(2)解淀粉芽孢杆菌的发酵菌粉的制备方法如下：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株MES810进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基。培养条件为：转速230r/min，温度37℃，培养12h；解淀粉芽孢杆菌摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏3％，蛋白胨0.3％，氯化钠1％，营养琼脂1.5％，其余为水，培养基pH为6.0；
②一级种子培养：500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基，116℃湿热灭菌20min，取10mL解淀粉芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃培养10h；一级种子培养所用培养基按质量分数计，为：牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.2％，营养琼脂1.5％，培养基pH为6.0；
③二级种子培养：在300L发酵罐中装有150L二级种子培养基，122℃湿热灭菌40min，将300mL一级种子接种于二级种子培养基中；在38℃培养12h；二级种子培养所用培养基按质量分数计，为:葡萄糖2％，玉米粉5％，豆粕粉5％，磷酸氢二钠0.5‰，磷酸二氢钠5‰，消泡剂2‰，培养基pH调为7.5；
④发酵:在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000L或20m3解淀粉芽孢杆菌活菌发酵培养基， 115℃湿热灭菌20min，将150L或200L二级种子接种于解淀粉芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa，在30℃培养24h；发酵所用培养基按质量分数计，为：葡萄糖0.3％，玉米粉1％，豆粕粉1％，磷酸氢二钠0.1‰，磷酸二氢钠0.5‰，消泡剂0.2‰，培养基pH调为6.0；
⑤至芽胞形成率大于等于90％时，结束发酵；
⑥将上述发酵液经喷雾干燥制成解淀粉芽孢杆菌发酵菌粉：
⑦解淀粉芽孢杆菌菌粉有效活菌数不少于4.0×109cfu/g。
⑧尾气处理：采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
(3)复合菌剂的制备方法如下：
将步骤(1)和步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌菌粉和解淀粉芽孢杆菌菌粉按质量比1:1 的比例混合均匀，得到的复合菌剂为：含枯草芽孢杆菌不少于1.0×1010cfu/g，解淀粉芽孢杆菌不少于2.0×109cfu/g。
实施例2
采用的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌与实施例1相同，区别仅在于枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的发酵菌粉的制备工艺有所不同，具体如下：
本发明的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法为：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MES810的发酵产物、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)MES812的发酵产物分别干燥后，将干燥的发酵菌粉按比例混合，制得所述防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂。
其中，(1)枯草芽孢杆菌的发酵菌粉制备方法如下：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株MES810进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基。培养条件为：转速230r/min，温度37℃，培养12h；牛肉膏3％，蛋白胨3％，氯化钠1％，营养琼脂1.8％，其余为水，培养基pH为7.5；
②一级种子培养：500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基，116℃湿热灭菌20min，取10mL枯草芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃培养10h；一级种子培养所用培养基按质量分数计，为：牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.2，营养琼脂1.5％，培养基pH为6.0；
③二级种子培养：在300L发酵罐中装有150L二级种子培养基，115℃湿热灭菌20min，将300mL一级种子接种于二级种子培养基中；在38℃培养12h；二级种子培养所用培养基按质量分数计，为:葡萄糖2％，玉米粉5％，豆粕粉5％，磷酸氢二钠0.5‰，磷酸二氢钠5‰，消泡剂2‰，培养基pH调为7.5；
④发酵:在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000L或20m3枯草芽抱杆菌活菌发酵培养基， 115℃湿热灭菌20min，将150L或200L二级种子接种于枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa，在30℃培养24h；发酵所用培养基按质量分数计，为：葡萄糖0.3％，玉米粉1％，豆粕粉1％，磷酸氢二钠0.1‰，磷酸二氢钠0.5‰，消泡剂0.2‰，培养基pH调为6.0；
⑤至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵；
⑥将上述发酵液经喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌发酵菌粉：
⑦枯草芽孢杆菌菌粉有效活菌数不少于2.0×1010cfu/g。
⑧尾气处理：采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
(2)解淀粉芽孢杆菌的发酵菌粉的制备方法如下：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株MES810进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基。培养条件为：转速200r/min，温度32℃，培养10h；解淀粉芽孢杆菌摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.3，蛋白胨3％，氯化钠0.2％，营养琼脂2.0％，其余为水，培养基pH为7.5；
②一级种子培养：500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基，121℃湿热灭菌35min，取10mL解淀粉芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在37℃培养12h；一级种子培养所用培养基按质量分数计，为：牛肉膏3％，蛋白胨3％，氯化钠1％，营养琼脂2.0％，其余为水，培养基pH为7.5；
③二级种子培养：在300L发酵罐中装有150L二级种子培养基，115℃湿热灭菌20min，将100mL一级种子接种于二级种子培养基中；在30℃培养8h；二级种子培养所用培养基按质量分数计，为:葡萄糖0.3％，玉米粉1％，豆粕粉1％，磷酸氢二钠0.1‰，磷酸二氢钠0.5 ‰，消泡剂0.2‰，培养基pH调为6.0；
④发酵:在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000L或20m3解淀粉芽孢杆菌活菌发酵培养基， 122℃湿热灭菌40min，将150L或200L二级种子接种于解淀粉芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.07Mpa，在38℃培养36h；发酵所用培养基按质量分数计，为：葡萄糖2％，玉米粉5％，豆粕粉5％，磷酸氢二钠0.5‰，磷酸二氢钠5‰，消泡剂2‰，培养基pH调为7.5；
⑤至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵；
⑥将上述发酵液经喷雾干燥制成解淀粉芽孢杆菌发酵菌粉：
⑦解淀粉芽孢杆菌菌粉有效活菌数不少于4.0×109cfu/g。
⑧尾气处理：采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
(3)复合菌剂的制备方法如下：
将步骤(1)和步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌菌粉和解淀粉芽孢杆菌菌粉按质量比1:1 的比例混合均匀，得到的复合菌剂为：含枯草芽孢杆菌不少于1.0×1010cfu/g，解淀粉芽孢杆菌不少于2.0×109cfu/g。
实施例3
采用的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌与实施例1相同，区别仅在于枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的发酵菌粉的制备工艺有所不同，具体如下：
本发明的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法为：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MES 810的发酵产物、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)MES 812的发酵产物分别干燥后，将干燥的发酵菌粉按比例混合，制得所述防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂。
其中，(1)枯草芽孢杆菌的发酵菌粉制备方法如下：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株MES 810进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基。培养条件为：转速210r/min，温度35℃，培养11h；牛肉膏2％，蛋白胨1.5％，氯化钠0.8％，营养琼脂1.8％，其余为水，培养基pH为6.8；
②一级种子培养：500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基，118℃湿热灭菌25min，取10mL枯草芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在35℃培养11h；一级种子培养所用培养基按质量分数计，为：牛肉膏0.25％，蛋白胨2％，氯化钠0.6％，营养琼脂 1.8％，培养基pH为7.0；
③二级种子培养：在300L发酵罐中装有150L二级种子培养基，120℃湿热灭菌30min，将200mL一级种子接种于二级种子培养基中；在35℃培养10h；二级种子培养所用培养基按质量分数计，为:葡萄糖1％，玉米粉4％，豆粕粉3％，磷酸氢二钠0.2‰，磷酸二氢钠4‰，消泡剂1‰，培养基pH调为6.8；
④发酵:在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000L或20m3枯草芽抱杆菌活菌发酵培养基， 120℃湿热灭菌30min，将150L或200L二级种子接种于枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.05Mpa，在36℃培养30h；发酵所用培养基按质量分数计，为：葡萄糖1.5％，玉米粉3％，豆粕粉4％，磷酸氢二钠0.3‰，磷酸二氢钠3‰，消泡剂1‰，培养基pH调为7.0；
⑤至芽孢形成率大于等于90％时，结束发酵；
⑥将上述发酵液经喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌制剂：
⑦枯草芽孢杆菌菌粉每克有效活菌数不少于2.0×1010cfu/g。
⑧尾气处理：采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
(2)解淀粉芽孢杆菌的发酵菌粉的制备方法如下：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株MES810进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基。培养条件为：转速220r/min，温度34℃，培养11h；解淀粉芽孢杆菌摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏1.5％，蛋白胨2.5％，氯化钠0.6％，营养琼脂1.9％，其余为水，培养基pH为6.6；
②一级种子培养：500mL茄子瓶中装有100mL一级种子培养基，120℃湿热灭菌28min，取10mL解淀粉芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在36℃培养11h；一级种子培养所用培养基按质量分数计，为：牛肉膏2％，蛋白胨1.5％，氯化钠0.6％，营养琼脂 1.8％，培养基pH为7.0
③二级种子培养：在300L发酵罐中装有150L二级种子培养基，119℃湿热灭菌30min，将250mL一级种子接种于二级种子培养基中；在36℃培养10h；二级种子培养所用培养基按质量分数计，为:葡萄糖1.5％，玉米粉3％，豆粕粉3％，磷酸氢二钠0.4‰，磷酸二氢钠3‰，消泡剂1‰，培养基pH调为7.0；
④发酵:在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000L或20m3解淀粉芽孢杆菌活菌发酵培养基， 118℃湿热灭菌25min，将150L或200L二级种子接种于解淀粉芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.06Mpa，在35℃培养28h；发酵所用培养基按质量分数计，为：葡萄糖1％，玉米粉3％，豆粕粉2.5％，磷酸氢二钠0.6‰，磷酸二氢钠3.‰，5消泡剂1.8‰，培养基pH调为6.9；
⑤至芽胞形成率大于等于90％时，结束发酵；
⑥将上述发酵液经喷雾干燥制成解淀粉芽孢杆菌制剂：
⑦解淀粉芽孢杆菌菌粉每克有效活菌数不少于4.0×109cfu/g。
⑧尾气处理：采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
(3)复合菌剂的制备方法如下：
将步骤(1)和步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌菌粉和解淀粉芽孢杆菌菌粉按质量比1:1 的比例混合均匀，得到的复合菌剂为：含枯草芽孢杆菌不少于1.0×1010cfu/g，解淀粉芽孢杆菌不少于2.0×109cfu/g。
功效检测
1、复合芽孢杆菌对微囊藻抑制效果验证
(一)试验地点：实验是在天津坤禾生物科技集团股份有限公司实验室中进行的。
(1)供试蓝藻(微囊藻)来源：微囊藻采自天津市西青区大寺镇的水产养殖池塘，经公司研究人员分离纯化，供研究使用。
(2)复合芽孢杆菌菌剂：按实施例1的方法取得。
(二)试验方法
(1)微囊藻的培养
取微囊藻藻液，按5％的接种量接入到预先灭菌的BG11培养液(500mL三角瓶)中。培养条件为：温度28℃，光照强度1000lx，光照循环时间为14h：10h，pH值为7.8±0.2，微囊藻培养7天后备用，期间每天定时摇瓶3次。
(2)试验方案
用不同浓度的复合芽孢杆菌菌剂来抑制微囊藻的实验，实验浓度分分别设置为0.495g/m3、0.375g/m3和0.300g/m3三个水平。
每种藻液分为4组，每组3个平行，共24个500mL三角瓶。其中每种藻液均设置对照单元(不加菌)、低剂量组单元(0.300g/m3)、中计量组单元(0.375g/m3)和高剂量组单元(0.495g/m3)。
添加菌剂后分别于第五天测试试验单元(500mL容量瓶)中单位颤藻的细胞干重，并记录。
微囊藻细胞干重的测定：每试验单元取80mL藻液，用中速定性滤纸(提前于60℃下烘箱烘干24h，并称重，记为M0)抽滤收集藻细胞体，然后将其置于60℃条件下烘干24h，之后称其干重，记为MT。
则得到微囊藻干重：M(g)＝MT－M0
单元平均增重为本单元三组微囊藻细胞增重(M)的平均值。
(三)试验结果及分析
通过对比对照组与试验组试验，结果显示，对照单元的5天平均增重最多(为0.0107g)，而实验单元的5天平均增重皆有明显下降，说明该复合芽孢杆菌对微囊藻有强烈的抑制作用，能够显著减抑制囊藻的生长；通过不同施用剂量的5天平均增重的结果(低剂量单元平均增重0.0051g；中剂量单元平均增重0.0024g；高剂量单元平均增重0.0018g)说明随着施用浓度的增加且抑制效果更明显。
2、复合芽孢杆菌对颤藻和鞘丝藻水华的抑制效果试验
(1)试验时间和地点：2018年7月24日在试验在天津市西青区王村渔场的2个露天池塘中进行,2个池塘面积分别为40亩(1#)、30亩(2#)。
(2)试验池塘条件：
2个池塘为均为精养虾池。试验开始前，2个池塘不同程度发生了颤藻和鞘丝藻，其中硅藻、隐藻、绿藻和裸藻为辅。
(3)试验方法：
1#池塘为试验池塘，2#池塘为对照池塘；试验开始前取样后，在1#池塘使用实施例1制成的复合芽孢杆菌制剂15kg(当时水体平均深度为1.5米，即每亩1米水深用成品制剂250g)。 2#池塘不使用任何产品。
样品采集：每个池塘设5个采样点，每边中间位置离岸1米处和中央，每天上午10时用500mL采水器在水深20cm处采样。
每个池塘的水样混匀，甲醛固定。在显微镜下用血球计数板计数。
连续8d每天检测池塘中藻类变化情况，并记录，结果见下表。
计算同一池塘在试验前(1d)和试验结束时(8d)的藻类数量差值N，并进行分析。
藻类数量差值：N＝N8－N1
复合芽孢杆菌对颤藻和鞘丝藻防治效果试验结果(单位：×105cfu/L)
由表中可以看到，1#池塘颤藻和鞘丝藻数量在下降，试验期间颤藻和鞘丝藻的数量由20 ×105cfu/L下降到了6×105cfu/L，而2#对照组的颤藻和鞘丝藻数量略有增加(由18×105cfu/L 增加到了20×105cfu/L)。可以看出该复合微生态制剂对微囊藻有明显抑制作用，可以防治由颤藻和鞘丝藻引起的蓝藻水华。该复合菌剂对其他的绿藻、硅藻、隐藻、裸藻没有明显的影响。
3、不同芽孢杆菌对微囊藻的抑制效果试验
(一)试验地点：实验是在天津坤禾生物科技集团股份有限公司实验室中进行的。
(1)供试微囊藻来源：微囊藻采自天津市西青区大寺镇的水产养殖池塘，经公司研究人员分离纯化，供研究使用。
(2)芽孢杆菌菌剂：枯草芽孢杆菌按实施例1步骤(1)的方法取得；解淀粉芽孢杆菌按实施例1步骤(2)的方法取得。
(二)试验方法
(1)微囊藻的培养
取微囊藻藻液，按5％的接种量接入到预先灭菌的BG11培养液(500mL三角瓶)中。培养条件为：温度28℃，光照强度1000lx，光照循环时间为14h：10h，pH值为7.8±0.2，微囊藻培养7天后备用，期间每天定时摇瓶3次。
(2)试验方案
用不同的芽孢杆菌菌剂：单一枯草芽孢杆菌菌剂(1试验单元)、单一解淀粉芽孢杆菌菌剂(2试验单元)、枯草和解淀粉芽孢杆菌混合菌剂(3试验单元)及枯草、解淀粉和地衣芽孢杆菌混合菌剂(4试验单元)来抑制微囊藻的实验，实验浓度及用量见下表。
试验分为4组，每组3个平行，共12个500mL三角瓶。试验进行8天，每天定时用血球计数板检测每组的微囊藻数量，并记录。
计数前处理微囊藻的方法为：首先定量采取含微囊藻水体的水样1mL,再将采集到的水样经孔径约为0.45微米的微孔滤膜过滤，然后将过滤后附着在微孔滤膜上的微囊藻群体样品悬浮在含有100mL 10-3mol/L EDTA溶液的250mL三角瓶中，然后向其中加入20个小玻璃珠后，置振荡器200rpm震荡20min后，计数。
最后，用初始数据减去第8d的数据得到不同组别的差值，然后平均每单元的差值得到本单元的平均差值。
试验结果见下表：(单位为：×108cfu/L)
试验结果及分析
通过不同种类芽孢杆菌对微囊藻的抑制作用试验，可以看出在相同数量的不同菌株中，无论是单一枯草芽孢杆菌(第一单元平均差值为15.32)还是解淀粉芽孢杆菌(第二单元平均差值为13.86)对微囊藻的生长都有抑制作用，但是只有枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌二者(第三单元平均差值为16.86)的组合效果最好，能够显著抑制微囊藻的生长。

Claims (10)

1.一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂，特征在于，所述复合菌剂包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）MES 810的发酵菌粉和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）MES812的发酵菌粉，两者的质量比为1:1。
2.根据权利要求1所述的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌MES 810，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年8月10日，保藏编号为CGMCC No.14514。
3.根据权利要求1所述的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌MES 812，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年8月10日，保藏编号为CGMCC No.14515。
4.根据权利要求1所述的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌MES 810的发酵菌粉中的活菌数不少于2.0×1010cfu/g，解淀粉芽孢杆菌MES812发酵菌粉中的活菌数不少于4.0×109cfu/g。
5.根据权利要求1-4任一所述的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，其特征在于，将制得的枯草芽孢杆菌发酵菌粉和解淀粉芽孢杆菌发酵菌粉按质量比1:1的比例混合均匀，制得所述防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂，得到的复合菌剂中含枯草芽孢杆菌不少于1.0×1010cfu/g，解淀粉芽孢杆菌不少于2.0×109cfu/g。
6.根据权利要求5所述的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的发酵菌粉制备方法为，包括以下步骤：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株在摇瓶培养基中进行种子摇瓶培养，摇瓶培养条件为：转速200-230r/min，温度 32-37℃，培养 10-12 h；
②一级种子培养：按5%-10%的接种量，取枯草芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃-37℃培养10-12h，制得一级种子培养液；
③二级种子培养：按0.06%-0.2%的接种量将一级种子培养液接种于二级种子培养基中；在30℃-38℃培养8-12h，制得二级种子培养液；
④发酵:按3.75%-10%的接种量将二级种子培养液接种于枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa，在30℃-38℃培养24-36h；
⑤至芽胞形成率大于等于90%时，结束发酵；
⑥将发酵液经喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌发酵菌粉。
7.根据权利要求5所述的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌摇瓶培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.5%-3%，蛋白胨0.5%-3%，氯化钠0.2-1%，营养琼脂1.5%-2.0%，其余为水，培养基pH为6.0-7.5；
一级种子培养所用培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.5%-3%，蛋白胨0.5%-3%，氯化钠0.2-1%，营养琼脂1.5%-2.0%，其余为水，培养基pH为6.0-7.5；在116℃-121℃湿热灭菌20-35min后使用；
二级种子培养所用培养基，按质量百分数计，具体为：葡萄糖0.3%-2%，玉米粉1%-5%，豆粕粉1%-5%，磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰-5‰，消泡剂0.2‰-2‰，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5；在115℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用；
发酵所用培养基，按质量百分数计，具体为：葡萄糖0.3%-2%，玉米粉1%-5%，豆粕粉1%-5%，磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰-5‰，消泡剂0.2‰-2‰，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5；在115℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用。
8.根据权利要求1-4任一所述的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的发酵菌粉的制备方法为，包括以下步骤：
①摇瓶培养：将经斜面活化的菌株在摇瓶培养基中进行种子摇瓶培养，摇瓶培养条件为：转速200-230r/min，温度 32-37℃，培养 10-12h；
②一级种子培养：按5%-10%的接种量将解淀粉芽孢杆菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃-37℃培养10-12h，制得一级种子培养液；
③二级种子培养：按0.06%-0.2%的接种量将一级种子培养液接种于二级种子培养基中，在30℃-38℃培养8-12h，制得二级种子培养液；
④发酵：按3.75%-10%的接种量将二级种子培养液接种于解淀粉芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa-0.07Mpa，在30℃-38℃培养24-36h；
⑤至芽胞形成率大于等于90%时，结束发酵；
⑥将发酵液经喷雾干燥制成解淀粉芽孢杆菌的发酵菌粉。
9.根据权利要求1-4任一所述的防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌摇瓶培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.3%-3%，蛋白胨0.3%-3%，氯化钠0.2-1%，营养琼脂1.5%-2.0%，其余为水，培养基pH为6.0-7.5；
一级种子培养所用培养基，按质量百分数计，具体为：牛肉膏0.3%-3%，蛋白胨0.3%-3%，氯化钠0.2-1%，营养琼脂1.5%-2.0%，其余为水，培养基pH为6.0-7.5；在116℃-121℃湿热灭菌20-35min后使用；
二级种子培养所用培养基，按质量百分数计，具体为：葡萄糖0.2%-2%，玉米粉0.5%-5%，豆粕粉1%-5%，磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰-5‰，消泡剂0.2‰-2‰，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5；在115℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用；
发酵所用培养基，按质量百分数计，具体为：葡萄糖0.2%-2%，玉米粉0.5%-5%，豆粕粉1%-5%，磷酸氢二钠0.1‰-0.5‰，磷酸二氢钠0.5‰-5‰，消泡剂0.2‰-2‰，其余为水，培养基pH调为6.0-7.5；在15℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用。
10.根据权利要求1-4任一所述的一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂的应用，特征在于，将复合菌剂加水稀释后，按每亩地1米水深用复合菌制剂200g-350g的施加量均匀的施入池塘中。
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