CN114672520A - 生产赤藓糖醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品生物技术领域，公开了一种生产赤藓糖醇的方法。本发明提供的方法通过添加铜盐使得赤藓糖醇发酵生产的产率和糖醇转化率均有所提高，从而提高了赤藓糖醇的生产效率。该方法流程简单，成本低，非常适合大规模工业化生产应用。

Description

生产赤藓糖醇的方法
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种生产赤藓糖醇的方法。
背景技术
赤藓糖醇是一种热量低、口感佳、吸湿性低的天然四碳糖醇，近年来常用于新型低热量食品饮料研制，也常作为替代蔗糖和葡萄糖的甜味剂用于医药、日化等产业中。赤藓糖醇的生产方法主要为微生物发酵法和化学合成法。化学合成法的成本较高，生产效率低，难以满足工业化生产需要。而微生物发酵法虽然成本低、反应条件温和，但是现有的赤藓糖醇发酵方法仍存在产量低、产率低、糖醇转化率低等缺陷。
目前，提高发酵法生产赤藓糖醇的产量、产率和糖醇转化率的方法主要包括培养过程中补料、调节发酵液渗透压等。但是，培养过程中补料的方式不仅操作繁琐，而且补加培养基的过程中还可能会引入污染物或杂菌，对产率和糖醇转化率的提高也很有限。CN102703525A公开了一种采用含葡萄糖的培养基进行赤藓糖醇发酵生产的方法，发酵过程中加入KCl或NaCl调节发酵液渗透压。然而，该方法的产量较低，仅有12-16％(折合120-160g/L)。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的赤藓糖醇发酵生产的产率和糖醇转化率较低的问题，提供一种生产赤藓糖醇的方法。该方法能够提高赤藓糖醇的糖醇转化率，缩短发酵周期，提高发酵法生产赤藓糖醇的生产效率。
为了实现上述目的，本发明提供一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括将解脂假丝酵母接种至发酵培养基中，进行发酵培养，获得含有赤藓糖醇的发酵液，其中，在发酵培养过程中包括添加铜盐的步骤。
通过上述技术方案，本发明在赤藓糖醇发酵过程中加入铜盐，从而提高了赤藓糖醇的产量和糖醇转化率，并且同时缩短了发酵周期，使得赤藓糖醇发酵产率也有所提高。而且，本发明提供的方法流程简单，成本低，能够适应大规模工业化生产需要。
生物保藏
本发明中的解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)于2021年05月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.22632。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，在赤藓糖醇发酵生产过程中，向培养体系中添加一定量的铜盐可以提高糖醇转化率和产量，并且可以缩短发酵周期，从而使得赤藓糖醇的产率也得到提高。
本发明提供一种生产赤藓糖醇的方法，所述方法包括将酵母接种至发酵培养基中，进行发酵培养，获得含有赤藓糖醇的发酵液，其中，在发酵培养过程中包括添加铜盐的步骤。
任意本领域现有能够用于赤藓糖醇发酵的酵母均可适用于本发明提供的方法。根据本发明的优选实施方式，其中，所述酵母选自解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)。
发明人在研究的过程中发现两株解脂亚罗酵母菌株(CGMCC No.22632和CICC33063)具有较高的糖醇转化率和赤藓糖醇产量，结合本发明提供的方法，能够进一步提高赤藓糖醇整体生产效率和产量。
本发明提供的方法中，对于所述解脂亚罗酵母没有特别限制，只要是能够发酵生产赤藓糖醇的解脂亚罗酵母均可适用于本发明提供的方法。为了进一步提高糖醇转化率和产率，优选地，所述酵母选自保藏编号为CGMCC No.22632的解脂亚罗酵母和/或保藏编号为CICC33063的解脂亚罗酵母。
本发明的发明人在研究的过程中还意外地发现，在进行赤藓糖醇发酵生产时，若采用解脂亚罗酵母CGMCC No.22632作为生产菌株，不仅能够获得较高的赤藓糖醇产量和糖酸转化率，而且，副产物(甘露醇、阿拉伯糖醇、甘油等)的产量也较少。经过进一步地实验还发现，解脂亚罗酵母CGMCC No.22632本身不消耗赤藓糖醇，从而相比于其他菌株而言进一步保证了赤藓糖醇的产量。另外，该菌株在生产过程中的泡沫产生量较少，能够有效避免生产过程中的“喷罐”问题，确保了生产的顺利进行，并且还保证了生产过程的安全性和产品的品质。此外，该菌株进行赤藓糖醇发酵生产时，产生的发酵液进行浓缩后，浓缩液中的杂质含量也较少，尤其是富含脂质成分的杂质较少，不仅对后续的结晶分离等工艺较为友好，而且结晶收率和一次结晶产品的纯度也较高。
基于上述发现，根据本发明的一种特别优选的实施方式，其中，所述酵母选自保藏编号为CGMCC No.22632的解脂亚罗酵母。
任意本领域用于赤藓糖醇发酵生产的培养基均可适用于本发明提供的方法。根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基包括：葡萄糖250-350g/L，酵母膏1-6g/L，酵母浸粉2-8g/L，磷酸二氢钾0.6-1.5g/L，柠檬酸铵2-8g/L，硫酸镁0-3g/L，0.6-1.2mL/L的吐温80。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养的条件包括：温度30-35℃，酵母的接种量使得发酵培养体系中，酵母初始含量为1×106-1×107CFU/mL，(最大)通气量0.8-1.2vvm，培养体系初始溶氧量20-35％，初始搅拌转速180-220rpm。
为了满足培养过程中酵母对于氧气的需求，根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养还包括在培养过程，通过溶氧量与搅拌转速的级联，对培养体系溶氧量进行控制的操作。
优选地，所述对培养体系溶氧量进行控制的方法包括：当培养体系溶氧量自然下降，并低于设定的溶氧量水平时，开始提高搅拌转速，并不断根据实时溶氧量水平调整搅拌转速，从而使得溶氧量维持在设定的溶氧量水平，其中，设定的溶氧量水平为20-35％，更优选20-30％，搅拌转速的最大值为1000rpm，当搅拌转速达到最大值时，不再随着溶氧量降低而提高搅拌转速(即维持1000rpm的搅拌转速直至发酵结束)。因此，在本发明提供的方法中，当搅拌转速达到最大值(1000rpm)后，培养体系中的溶氧量会随着酵母的增殖而不断下降，最终稳定于或接近于0。
更优选地，所述设定的溶氧量水平为23-27％。
为了提高发酵培养过程的生产效率，根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括在进行发酵培养之前先对酵母进行种子培养，以对酵母进行活化。
所述种子培养的方法可以采用本领域常规种子培养方式进行。根据本发明的优选实施方式，其中，所述种子培养的方式包括：将酵母接种至种子培养基中，30-35℃，150-250rpm摇床培养20-30h，获得种子液。
优选地，所述种子培养基包括：葡萄糖30-80g/L，酵母膏10-30g/L，磷酸二氢钾0.1-1g/L，硫酸镁0.1-1g/L，柠檬酸铵1-10g/L。
优选地，所述酵母的接种量使得种子培养体系中初始酵母含量为1×105-4×105CFU/mL。
优选地，所述种子液中的酵母含量为5×107-1×108CFU/mL。
任意水溶性铜盐均可适用于本发明提供的方法。根据本发明的优选实施方式，其中，所述铜盐选自硫酸铜、氯化铜、硝酸铜和碱式碳酸铜中的至少一种。
本发明的发明人在研究的过程中发现，在培养体系中添加铜盐时，将不同铜盐以一定比例进行复配，能够进一步提高糖醇转化率和发酵速率。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述铜盐的(总)用量使得发酵体系中，相对于每升发酵液，硫酸铜的用量为0.05-0.18g，氯化铜的用量为0.03-0.12g，硝酸铜的用量为0.02-0.06g，碱式碳酸铜的用量为0.01-0.04g。由于碱式碳酸铜在水中的溶解度较低，因此，在使用前应对其进行预处理，例如采用少量氨水进行预处理，以提高碱式碳酸铜在发酵体系中的溶解度。
本发明提供的方法中，根据本发明的优选实施方式，其中，所述铜盐可以直接添加于发酵培养基中。即，配制发酵培养基时按照上述用量比例将铜盐加入其中，然后将酵母接种至该发酵培养基进行赤藓糖醇发酵即可。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述铜盐在发酵培养过程中添加至发酵培养体系中时，所述铜盐的添加方式为在发酵开始前一次性加入或者发酵培养过程中流加加入。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述流加加入的方式包括：
(1)恒速流加；或者
(2)变速流加，所述变速流加的方式包括：发酵开始后40h以内低速流加，发酵开始40h以后高速流加，所述高速流加时的铜盐流加速度为低速流加时的2-5倍。
对于方式(1)，本发明提供的方法对于铜盐的流加速度没有特别限制。例如，可以根据预估的发酵时间和前述铜盐用量计算获得铜盐的流加速度，使得发酵和铜盐流加同时开始和结束，或者，也可以按照一定的流加速度添加铜盐，当添加量达到前述铜盐用量时即停止加入。
方式(1)中，所述铜盐可以一起添加，也可以分组添加。例如将铜盐分为若干组(优选为2-4组，最优选为2组，以确保每组添加的铜盐中至少含有两种不同种类的铜盐)且每组中铜盐的种类不同，依次将各组铜盐在发酵过程中流加加入发酵体系中。各组铜盐的流加速度可以相同，也可以不同。
方式(2)中，可以根据前述铜盐用量、预估的发酵时间以及低速流加和高速流加阶段的流加速度之间的倍数关系计算获得铜盐的在不同阶段的流加速度。或者，也可以按照一定的速度进行低速和高速流加，当添加量达到前述铜盐用量时即停止加入。此外，方式(2)中铜盐的低速流加与高速流加的分界点实际上是根据发酵周期决定的，即，在一个完整的发酵周期中，约前50％左右进行低速流加，约后50％时间内进行高速流加。由于本发明中，按照上述方法进行赤藓糖醇发酵培养时，采用的优选菌株的发酵周期均在80h左右(80±5h)，因此，本发明优选将40h作为低速流加和高速流加的分界点。当采用的菌株发酵周期发生较大改变时，低速流加和高速流加的分界点也会相应有所变化。例如，若采用发酵周期为100h左右的菌株，则可以调整为发酵开始后50h以内低速流加，发酵开始50h以后高速流加。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，采用的解脂亚罗酵母CICC 33063购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。未进行特殊说明的情况下，采用的化学试剂均购自正规化学品供应商，纯度为分析纯。
实施例1
本实施例用于说明解脂亚罗酵母CGMCC No.22632的获得、菌株特性研究和保藏。
(一)菌株的获得
本发明的发明人在研究过程中，于我国怀涿盆地沙城产区自然发酵的酿酒葡萄醪中分离获得一株酵母菌株CoY1，经生理生化特征以及26s rDNA检测确认该菌株为解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)。经过对菌株CoY1进行常压室温等离子体诱变和紫外照射诱变，获得诱变菌株CoY1-M1。
(二)菌株特性研究
活化培养基：葡萄糖150g/L，酵母膏15g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。
发酵培养基：葡萄糖315g/L，酵母浸粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸铵5g/L，pH6。
发酵液(上清)中葡萄糖的浓度使用SBA-40E型生物传感器进行检测，D-葡萄糖酶膜，进样量25μL。
取保藏的CoY1和CoY1-M1甘油菌(保存在甘油中的解脂亚罗酵母，活菌数为107CFU/mL)按3‰(v/v)接种量分别接种至活化培养基，30℃下，200rpm培养20h，按10％(v/v)接种量将菌液接种至含有发酵培养基的5L发酵罐，定时取样进行检测(发酵初期每隔12h取样检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度估算发酵速率，根据葡萄糖浓度和发酵速率判断发酵终点即耗尽葡萄糖，在发酵终点前12h每隔0.5h取样检测葡萄糖浓度)。接种后发酵罐的装液量为60体积％，发酵温度控制32℃，转速为200-800rpm，通气量为0.5-1vvm(L/min·L)，使溶氧量控制在20-25vol％。CoY1-M1于92h耗尽葡萄糖，CoY1发酵120h后，葡萄糖浓度仍有100g/L左右，继续延长发酵时间葡萄糖浓度下降变缓慢因此终止发酵。CoY1-M1发酵终点(耗尽葡萄糖)赤藓糖醇含量189.3g/L，甘露醇含量为0.39g/L，阿拉伯糖醇、甘油未检出。CoY1-M1发酵液下罐后室温密闭放置1天后取样检测，赤藓糖醇含量无明显变化(含量上升不超过0.5g/L)，而甘露醇含量降低至0.05g/L；继续放置到7天再取样检测，赤藓糖醇仍无明显变化，甘露醇基本检测不到。该菌株具有副产物少、不利用赤藓糖醇的优点。在实验过程中还发现，CoY1-M1的泡沫产生量较少，从而不存在发酵过程中泡沫过多导致的喷罐等问题，确保了生产安全和产品质量，十分利于工业生产使用。
将CoY1-M1的发酵液采用离心—微滤—纳滤工艺进行处理，即先对发酵液进行离心，离心后的发酵液上清先后经过微滤、纳滤。处理工艺的条件为：离心4000rpm，15min，25℃；微滤使用陶瓷膜，操作压力0.15MPa，温度30℃；纳滤截留分子量250-300Da，操作压力1MPa，温度30℃。CoY1-M1发酵液单位时间微滤透过截留体积比为80％，单位时间纳滤透过截留体积比为75％。CoY1-M1发酵液纳滤浓缩侧液体较少，并且浓缩后杂质较少，尤其是没有富含脂质的白色粘稠杂质，对后续结晶分离更为友好，而且结晶收率和一次结晶产品纯度较高。经综合评估，CoY1-M1为一株适合用于生产赤藓糖醇的菌株。
(三)菌株的保藏
解脂亚罗酵母诱变菌株CoY1-M1于2021年05月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.22632。
实施例2
本实施例用于说明在培养基中添加铜盐对赤藓糖醇发酵的产量、产率和糖醇转化率的提高效果。
(一)解脂亚罗酵母CGMCC No.22632
种子培养：
按照葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，柠檬酸胺5g/L的用量称取种子培养基原料，将其溶于去离子水中，121℃高压灭菌20min，获得种子培养基。为了避免美拉德反应，培养基中的葡萄糖与其他成分分别采用一定量的去离子水溶解，并分别灭菌，而后再进行混合。
采用500mL三角瓶(每瓶中加入200mL培养基)，将实施例1中获得的解脂亚罗酵母接种至种子培养基中，32℃下，200rpm摇床培养24h，获得解脂亚罗酵母种子液(可见分光光度计检测种子液OD600值为6.0,此时解脂亚罗酵母菌含量约为9×107CFU/mL)。
发酵培养：
按照葡萄糖280g/L，酵母膏2.4g/L，酵母浸粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，柠檬酸胺5g/L，七水硫酸镁2g/L，1mL/L吐温80的用量称取发酵培养基原料，将其溶于去离子水中，并向其中添加混合铜盐(具体添加量详见表1,其中碱式碳酸铜采用少量氨水进行预处理)，121℃高压灭菌20min，获得发酵培养基。为了避免发生美拉德反应，培养基中的葡萄糖与其他成分分别采用一定量的去离子水溶解，并分别灭菌，而后再进行混合。
表1
混合铜盐 硫酸铜(g/L) 氯化铜(g/L) 硝酸铜(g/L) 碱式碳酸铜(g/L)
A 0.07 0.09 0.03 0.04
B 0.16 0.06 0.05 0.01
C 0.11 0.08 0.02 0.03
D 0.05 0.12 0.06 0.02
采用5L发酵罐进行中试水平赤藓糖醇发酵试验，向发酵罐中加入发酵培养基，将解脂亚罗酵母种子液按照8体积％的接种量接种至发酵培养基中，总体系为3L，进行发酵培养。发酵培养条件：温度32℃，培养过程中通入无菌空气，通气量1vvm，初始溶氧量25％，起始转速200rpm。培养过程中进行溶氧量与转速的级联，对溶氧量进行控制，具体方法如下：发酵培养开始后对培养体系中的溶氧量进行实时监测，当培养体系中溶氧量低于25％时，提高搅拌转速，从而使得溶氧量维持在25％水平。设置搅拌转速最大值为1000rpm，当搅拌转速达到最大值时，不再随着溶氧量的降低而提高搅拌转速，维持1000rpm的搅拌转速直至发酵结束，发酵结束时，溶氧量接近于0。当培养体系中葡萄糖含量低于1g/L时停止发酵，记录发酵周期，采用液相色谱(Agilent Technologies，1260Infinity II)检测发酵液中赤藓糖醇的含量，并计算其产率和糖醇转化率。结果详见表2。
赤藓糖醇产率＝(赤藓糖醇产量/发酵周期)×100％
糖醇转化率＝(赤藓糖醇产量/培养基初始葡萄糖含量)×100％
表2
Figure BDA0003563509110000101
(二)解脂亚罗酵母CICC 33063
按照实验(一)中的方法，在培养基中添加表1中的混合铜盐C，采用解脂亚罗酵母CICC33063进行赤藓糖醇发酵培养。发酵结果详见表3。
表3
混合铜盐 / C
发酵周期/h 84 83
产量/g·L<sup>-1</sup> 170.2 171.6
产率/g·L<sup>-1</sup>·h<sup>-1</sup> 2.026 2.067
糖醇转化率/％ 60.7 61.3
(三)铜盐添加量对赤藓糖醇发酵的影响
按照实验(一)的方法采用解脂亚罗酵母CGMCC No.22632进行赤藓糖醇发酵培养，不同的是，培养基中按照表4中的用量加入混合铜盐。发酵结果详见表5
表4
混合铜盐 硫酸铜(g/L) 氯化铜(g/L) 硝酸铜(g/L) 碱式碳酸铜(g/L)
低剂量组 0.04 0.02 0.01 0.008
高剂量组 0.20 0.15 0.08 0.05
表5
混合铜盐 高剂量组 低剂量组
发酵周期/h 82 84
产量/g·L<sup>-1</sup> 173.9 172.8
产率/g·L<sup>-1</sup>·h<sup>-1</sup> 2.121 2.057
糖醇转化率/％ 62.1 61.7
(四)铜盐种类对赤藓糖醇发酵的影响
按照实验(一)的方法采用解脂亚罗酵母CGMCC No.22632进行赤藓糖醇发酵培养，不同的是，培养基中按照表6中的用量加入混合铜盐。发酵结果详见表7。
表6
混合铜盐 硫酸铜(g/L) 氯化铜(g/L) 硝酸铜(g/L) 碱式碳酸铜(g/L)
C-1 / 0.08 0.02 0.03
C-2 0.13 0.08 / 0.03
C-3 0.13 0.08 / /
C-4 0.13 / / /
C-5 0.18 / 0.05 0.03
表7
混合铜盐 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5
发酵周期/h 82 83 82 83 82
产量/g·L<sup>-1</sup> 174.1 174.8 173.7 173.2 173.5
产率/g·L<sup>-1</sup>·h<sup>-1</sup> 2.123 2.106 2.120 2.088 2.116
糖醇转化率/％ 62.2 62.4 62.0 61.8 62.0
实施例3
本实施例用于说明在发酵过程中恒速流加加入铜盐对赤藓糖醇发酵的产量、产率和糖醇转化率的提高效果。
种子培养和发酵培养的方法和采用的培养基与实施例2中相同，不同的是，初始发酵培养基中不含铜盐，采用表8中的方式在发酵过程中进行铜盐流加。发酵结果详见表9。
表8
Figure BDA0003563509110000121
表9
流加方式 I II III IV
发酵周期/h 81 80 81 82
产量/g·L<sup>-1</sup> 176.7 178.1 175.8 176.4
产率/g·L<sup>-1</sup>·h<sup>-1</sup> 2.181 2.226 2.17 2.151
糖醇转化率/％ 63.1 63.6 62.8 63
实施例4
本实施例用于说明在发酵过程中变速流加加入铜盐对赤藓糖醇发酵的产量、产率和糖醇转化率的提高效果。
种子培养和发酵培养的方法和采用的培养基与实施例2中相同，不同的是，初始发酵培养基中不含铜盐，采用表10中的方式在发酵过程中进行铜盐流加。发酵结果详见表11。
表10
Figure BDA0003563509110000131
表11
流加方式 V VI
发酵周期/h 80 81
产量/g·L<sup>-1</sup> 178.6 177.8
产率/g·L<sup>-1</sup>·h<sup>-1</sup> 2.232 2.195
糖醇转化率/％ 63.8 63.5
对比例1
采用实施例2中实验(一)的方法进行赤藓糖醇发酵，不同之处在于，将混合铜盐替换为表12中的混合钠盐。结果详见表13。
表12
混合钠盐 硫酸钠(g/L) 氯化钠(g/L) 硝酸钠(g/L) 碳酸钠(g/L)
A 0.07 0.09 0.03 0.04
B 0.16 0.06 0.05 0.01
C 0.13 0.08 0.02 0.03
D 0.05 0.12 0.06 0.02
表13
混合钠盐 A B C D
发酵周期/h 82 84 83 82
产量/g·L<sup>-1</sup> 172.5 172.1 174.2 172.9
产率/g·L<sup>-1</sup>·h<sup>-1</sup> 2.10 2.05 2.10 2.11
糖醇转化率/％ 61.6 61.5 62.2 61.8
通过表2与表13中的结果对比可以看出，当在赤藓糖醇发酵过程中添加混合钠盐时，对赤藓糖醇的产量和糖醇转化率几乎没有提高作用，甚至有的混合钠盐(如混合钠盐B)添加后反而略微降低了赤藓糖醇的产量和糖醇转化率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种生产赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述方法包括将酵母接种至发酵培养基中，进行发酵培养，获得含有赤藓糖醇的发酵液，其中，在发酵培养过程中包括添加铜盐的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母选自解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)；
优选地，所述酵母选自保藏编号为CGMCC No.22632的解脂亚罗酵母和/或保藏编号为CICC 33063的解脂亚罗酵母。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养基包括：葡萄糖250-350g/L，酵母膏1-6g/L，酵母浸粉2-8g/L，磷酸二氢钾0.6-1.5g/L，柠檬酸铵2-8g/L，硫酸镁0-3g/L，0.6-1.2mL/L的吐温80。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵培养的条件包括：温度30-35℃，酵母的接种量使得发酵培养体系中，酵母初始含量为1×106-1×107CFU/mL，通气量0.8-1.2vvm，培养体系初始溶氧量20-35％，初始搅拌转速180-220rpm。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述发酵培养还包括在培养过程，通过溶氧量与搅拌转速的级联，对培养体系溶氧量进行控制的操作；
优选地，所述对培养体系溶氧量进行控制的方法包括：当培养体系溶氧量自然下降，并低于设定的溶氧量水平时，开始提高搅拌转速，并不断根据实时溶氧量水平调整搅拌转速，从而使得溶氧量维持在设定的溶氧量水平，其中，设定的溶氧量水平为20-35％，更优选20-30％，搅拌转速的最大值为1000rpm，当搅拌转速达到最大值时，不再随着溶氧量降低而提高搅拌转速。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述铜盐选自硫酸铜、氯化铜、硝酸铜和碱式碳酸铜中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述铜盐的用量使得发酵体系中，相对于每升发酵液，硫酸铜的用量为0.05-0.18g，氯化铜的用量为0.03-0.12g，硝酸铜的用量为0.02-0.06g，碱式碳酸铜的用量为0.01-0.04g。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述铜盐直接添加于发酵培养基中；
或者，所述铜盐在发酵培养过程中添加至发酵体系中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述铜盐在发酵培养过程中添加至发酵体系中时，所述铜盐的添加方式为在发酵开始前一次性加入或者发酵培养过程中流加加入。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述流加加入的方式包括：
(1)恒速流加；或者
(2)变速流加，所述变速流加的方式包括：发酵开始后40h以内低速流加，发酵开始40h以后高速流加，所述高速流加时的铜盐流加速度为低速流加时的2-5倍。
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