CN114685248A - 制备赤藓糖醇晶体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及赤藓糖醇结晶领域，公开了一种制备赤藓糖醇晶体的方法。该方法包括：(1)将赤藓糖醇浓缩液、赤藓糖醇晶种和乙醇混合，得到混合物料；(2)在超声波的间歇存在下使所述混合物料进行预结晶，然后进行降温结晶，得到浆液；(3)将所述浆液进行固液分离，得到赤藓糖醇晶体和母液。该方法工艺简单温和，成本低，结晶时间短，还能避免结块、形成晶垢和空腔，而且产品颗粒均匀，收率高。
Description
技术领域
本发明涉及赤藓糖醇结晶领域，具体涉及一种制备赤藓糖醇晶体的方法。
背景技术
赤藓糖醇是一种天然糖质和功能糖甜味剂，广泛应用于开发低热量保健食品、糖尿病及葡萄糖不适症等人群的功能食品或饮料等。国产赤藓糖醇生产规模已居世界前列，但产品质量，尤其是晶型、粒度分布等方面还有待提高。
工业生产主要采用发酵法，发酵液经净化处理后先蒸发浓缩，再冷却结晶制得赤藓糖醇晶体。由于发酵液中赤藓糖醇浓度较低，常压蒸馏浓缩时需要操作温度较高，水分蒸发量较大，能耗较高；而采用减压或多效蒸发虽能节能降耗，但又会增加设备和工艺的复杂性。而且，无论是采用蒸发结晶还是先蒸发浓缩再冷却结晶，在盘管和夹套等换热表面都容易形成晶垢，显著降低传热效率，使得蒸发速率或降温速率不易控制，结晶时间延长，从而导致结晶产品粒度分布不均一，结晶率较低。而且，在蒸发结晶过程中，结晶器内固体悬浮密度越来越高，晶液混合不均匀，晶体易沉底，而且晶体之间和晶体与搅拌桨之间的摩擦碰撞致使结晶过程中晶体局部过饱和现象严重，这也会加剧结晶产品粒度分布不均一的情况。此外，赤藓糖醇在水中溶解度较大(65℃时为200g/(100g水)，15℃时为40g/(100g水))，因此，无论蒸发结晶还是冷却结晶，结晶操作结束时母液中还有大量赤藓糖醇未结晶析出，导致单位体积结晶器生产能力偏低，收率偏低。
CN104086365B中，通过回收利用赤藓糖醇结晶母液中剩余的赤藓糖醇，提高了赤藓糖醇的利用率和总体收率，但是该方法结晶方式为传统的先蒸发浓缩，再冷却结晶的方式，一次的结晶收率较低，浓缩液中气泡较多，导致晶体粒度不一。
CN106831337A中，通过连续溶析膜结晶的方法，实现了赤藓糖醇溶析结晶过程的全连续化生产，避免了溶析剂直接加入结晶母液中时存在的局部高过饱和现象和过度成核现象，并且溶析剂可以回收以实现循环使用。但该方法存在气泡难以去除、膜污染和一次结晶收率低的问题，且增加的精馏塔和膜的耗损成本较大，在工业上实现难度高。
因此，需要开发一种工艺简单温和，成本低，结晶时间短，还能避免结块、形成晶垢和空腔，而且产品颗粒均匀、收率高、纯度高的制备赤藓糖醇晶体的方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种制备赤藓糖醇晶体的方法，该方法工艺简单温和，成本低，结晶时间短，还能避免结块、形成晶垢和空腔，而且产品颗粒均匀，收率高。
为了实现上述目的，本发明提供一种制备赤藓糖醇晶体的方法，该方法包括：
(1)将赤藓糖醇浓缩液、赤藓糖醇晶种和乙醇混合，得到混合物料；
(2)在超声波的间歇存在下使所述混合物料进行预结晶，然后进行降温结晶，得到浆液；
(3)将所述浆液进行固液分离，得到赤藓糖醇晶体和母液。
通过上述技术方案，本发明可以取得如下的有益效果：
1、本发明的方法，结晶时间短、收率高、纯度高。并且，能够避免结块、形成晶垢和空腔，产品粒度分布均一，品质高。
2、本发明的方法，工艺流程简单，操作条件温和，对设备要求不高，避免了换热表面易形成晶垢的问题从而降低传热效率的问题，大幅度减少了由于低传热效率导致的高能耗的问题，降低了生产成本，易工业化。
生物保藏
本发明述及的菌株的分类命名为解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)，于2021年5月28日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.22632。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种制备赤藓糖醇晶体的方法，该方法包括：
(1)将赤藓糖醇浓缩液、赤藓糖醇晶种和乙醇混合，得到混合物料；
(2)在超声波的间歇存在下使所述混合物料进行预结晶，然后进行降温结晶，得到浆液；
(3)将所述浆液进行固液分离，得到赤藓糖醇晶体和母液。
能够理解的是，可以通过将超声波的探头伸入所述混合料的液面下方，来向所述混合料提供超声波。
根据本发明，优选的，获得赤藓糖醇浓缩液的方法包括：将待纯化的赤藓糖醇溶液进行纯化，得到纯化的赤藓糖醇溶液，将纯化的赤藓糖醇溶液进行浓缩，得到赤藓糖醇浓缩液；
其中，所述纯化的赤藓糖醇溶液的纯度不低于88重量％(例如，可以为88重量％，88.5重量％，89重量％，90重量％，91重量％，92重量％)。
其中，所述待纯化的赤藓糖醇溶液可以为天然提取、生物发酵法或化学合成中的任意一种或两、三种的混合液。例如，所述待纯化的赤藓糖醇溶液可以由淀粉糖化、液化成葡萄糖，然后通过酵母菌发酵转化而来。但是，根据本发明的一种优选实施方式，所述待纯化的赤藓糖醇溶液由解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)发酵得到，更优选地，所述解脂亚罗酵母于2021年5月28日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.22632。当所述发酵采用上述解脂亚罗酵母时，能够使得发酵副产物和杂质更少，赤藓糖醇产量更高、收率更高：
将如前所述的解脂亚罗酵母接种至发酵培养基中进行发酵，得到含赤藓糖醇的发酵液。将所得发酵液进行固液分离即可获得待纯化的赤藓糖醇溶液。也即，本发明的方法还优选包括：将如前所述的解脂亚罗酵母接种至发酵培养基中进行发酵，将得到的含赤藓糖醇的发酵液进行固液分离，获得的液相作为待纯化的赤藓糖醇溶液待用。
其中，所述发酵的条件可以为本领域常用的发酵产赤藓糖醇的条件。优选的情况下，所述发酵的条件包括：发酵温度为30-35℃，发酵时间为60-120h。进一步优选的，为了进一步提高赤藓糖醇产量，所述发酵温度为30-32℃。
优选的，所述方法还包括：在发酵过程中，控制发酵液中的溶氧量为10-35vol％。对所述发酵液中的溶氧量控制的方式可以为本领域常用的方式，例如可以为控制发酵罐的通气量、发酵罐的转速，本领域技术人员可以根据实际情况调整。
其中，所述发酵培养基可以为本领域常用的用于发酵产赤藓糖醇的培养基。优选的情况下，所述发酵培养基含有碳源、氮源、可选的无机营养盐和可选的表面活性剂。优选的情况下，相对于1L所述发酵培养基，所述碳源的含量为150-350g，所述氮源的含量为5-30g，无机营养盐的含量为0-7g，表面活性剂的含量为0-2g。
优选的，所述碳源为葡萄糖。
优选的，所述氮源可以为酵母浸粉、酵母膏、玉米浆粉、柠檬酸铵、硫酸铵和硫酸氢二铵中的至少一种。
优选的，所述无机营养盐为硫酸二氢钾和/或硫酸镁。
优选的，所述表面活性剂为吐温80。
优选的，相对于1L所述发酵培养基，葡萄糖的含量为150-350g，氮源的含量为5-30g，磷酸二氢钾的含量为0-5g，硫酸镁的含量为0-2g，吐温80的含量为0-2g。优选的情况下，所述发酵培养基的初始pH值为5-6.5。其中，所述氮源可以为本领域常用的氮源，例如可以为酵母浸粉、酵母膏、玉米浆粉、柠檬酸铵、硫酸铵、磷酸氢二铵中的至少一种。
优选的，所述发酵培养基的初始pH值为5-6.5。
优选的，所述方法还可以包括：在发酵液中的葡萄糖浓度低于100g/L时，向发酵液中流加葡萄糖溶液至折算总糖达到380-450g/L停止流加，继续发酵至发酵液的葡萄糖浓度低于1g/L。其中，所述“折算总糖”指的是：发酵培养基中初始葡萄糖总量(g)及流加的葡萄糖溶液中葡萄糖的总量(g)的总和与停止流加葡萄糖溶液后的发酵液的总体积(L)之比。其中，控制流加葡萄糖溶液的流速以维持发酵液中葡萄糖浓度为100-150g/L。对所述葡萄糖溶液的浓度没有要求，可以为本领域常用的葡萄糖溶液浓度。优选的情况下，所述葡萄糖溶液的浓度可以为600-800g/L。
除非特殊说明，所述发酵培养基的溶剂为去离子水。
优选的，所述解脂亚罗酵母通过种子液的形式进行接种。
其中，所述种子液的制备方法可以为本领域常规的制备方法，例如可以为一级种子培养、二级种子培养，本领域技术人员可以根据实际情况选择培养方式。
其中，所述一级种子培养可以为本领域常规的方法，例如可以包括：取甘油菌接种于活化培养基中，28-32℃，180-240rpm培养16-30h。
其中，所述“甘油菌”指保存在甘油中的解脂亚罗酵母，活菌数一般为107cfu/mL以上。本发明中，所述“甘油菌”的接种量可以为本领域常规的接种量，例如可以为3‰(v/v)。
其中，所述二级种子培养可以为本领域常规的方法。本发明的一些实施方式中，所述二级种子培养为：先取甘油菌或斜面保藏的菌种接种于活化培养基中，28-32℃，180-240rpm培养12-24h，再按照5-15％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，28-32℃，180-350rpm培养12-24h，得到种子液。
其中，所述活化培养基可以为本领域常用的活化解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)的培养基。优选的情况下，所述活化培养基含有葡萄糖50-150g/L，酵母浸粉或酵母膏10-30g/L，磷酸二氢钾0.2-1g/L。
其中，所述种子液的OD600值可以在较宽的范围内选择，优选的情况下，所述种子液的OD600值为8-25。
其中，所述种子液的接种量可以为本领域常用的接种量。优选的，所述种子液的接种量为5-15％(v/v)。
其中，所述纯化的方法可以为依次通过阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
根据本发明，为了能够进一步提高结晶收率，进一步保证获得粒度分布更均一、纯度更高的结晶产品，优选的，所述赤藓糖醇浓缩液的浓度为450-700g/L，更优选为560g/L-680g/L，最优选为650g/L。
能够理解的是，述及的“纯度”和“浓度”为不同的概念。纯度，指的是，赤藓糖醇溶液中赤藓糖醇的重量与赤藓糖醇溶液中所有的糖醇和糖的总重量之比。而浓度为，赤藓糖醇溶液中所有的糖醇和糖的总重量与赤藓糖醇溶液的体积之比。由于在制备过程中，由于反应、发酵或提取等实际操作，得到的赤藓糖醇溶液中可能还包括除赤藓糖醇以外其他的糖或者糖醇，而在计算浓度时，这部分其他的糖或者糖醇的量也被计入。
根据本发明，所述浓缩的方法不受特别的限制，可以为本领域的常规选择。优选的，所述浓缩的方法包括：在温度不高于80℃的条件下，进行减压浓缩。能够理解的是，温度不高于80℃的条件下，能够在保证结晶效率的同时极大地降低能耗，也能够避免赤藓糖醇溶液中的杂质在浓缩过程中局部温度过高引起焦糖化反应，导致浓缩液颜色褐变使得最终得到晶体呈现黄色。
能够理解的是，在减压浓缩中，浓缩压力一般为越低越好，但兼顾成本和操作简便性，所述浓缩的压力以在较低的温度下，能够实现纯化的赤藓糖醇溶液较快的浓缩为原则。
其中，为了产业化放大过程中易于操作，并降低工艺技术放大门槛，浓缩所用的设备可以为单效、双效、三效、四效浓缩设备。
根据本发明，优选的，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述乙醇的用量为0.3-10L，更优选为0.5-5L。本发明的发明人在研究中发现，杂质在乙醇-水体系中有较高的溶解度，当乙醇用量满足如上所述的范围时，在减小用量、充分利用乙醇的同时，还能够进一步保证获得较高的结晶收率，进一步保证获得粒度分布更均一、纯度更高的结晶产品。
根据本发明，尽管采用超声波间歇存在的方式就可以达到本发明的目的，但为了能够进一步提高结晶收率，进一步保证获得粒度分布更均一、纯度更高的结晶产品，优选的，提供超声波的方法为：每隔10-120s(例如，可以为10s，20s，30s，40s，50s，60s，70s，80s，90s，100s，110s，120s)超声10-60s(例如，可以为10s，20s，30s，40s，50s，60s)，如此持续1-10min(例如，可以为1min，2min，3min，4min，5min，6min，7min，8min，9min，10min)之后，关闭超声并维持20-60min(例如，可以为20min，30min，40min，50min，60min)，重复超声和关闭超声至预结晶结束。更优选的，提供超声波的方法为：每隔15-30s超声15-30s，如此持续3-7min之后，关闭超声并维持25-40min，重复超声和关闭超声至预结晶结束。例如，可以每隔20s超声20s，如此持续5min之后，关闭超声并维持30min，重复超声和关闭超声至预结晶结束。能够理解的是，如果在关闭超声并维持关闭的时间段内，预结晶的时间已经达到设定的时间，那么直接进入降温结晶即可；如果在每隔10-120s超声10-60s，如此持续1-10min的时间段内，预结晶的时间已经达到设定的时间，那么在达到预结晶时间后，不再进行每隔10-120s超声10-60s的操作，直接关闭超声，进入降温结晶。此外，本发明的发明人进一步还发现，采用如上所述的方案，还能够有效节省能耗，并且在交替的超声和关闭超声的操作中，还有助于更好的控制温度。
根据本发明，为了能够进一步提高结晶收率，进一步保证获得粒度分布更均一、纯度更高的结晶产品，优选的，所述超声的功率为100-1000W/m3混合物料，优选为300-500W/m3混合物料，最优选为400W/m3混合物料。
根据本发明，为了能够进一步提高结晶收率，进一步保证获得粒度分布更均一、纯度更高的结晶产品，优选的，所述预结晶的条件包括：温度为30-80℃(例如，可以为30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃)，时间为1-2h(例如，可以为1h，1.5h，2h)，搅拌转速为50-350rpm(例如，可以为50rpm，100rpm，150rpm，200rpm，250rpm，300rpm，350rpm)。本发明的发明人在研究中进一步发现，当满足如上所述的范围时，能够在避免晶体破损的情况下，还能避免局部过饱和，使得晶体均匀析出。
根据本发明，为了能够进一步提高结晶收率，进一步保证获得粒度分布更均一、纯度更高的结晶产品，优选的，所述降温结晶的条件包括：以0.1-0.5℃/min的降温速率进行降温，降温至0-15℃并维持温度为0-15℃，降温结晶过程中的搅拌速率为50-350rpm(例如，可以为50rpm，100rpm，150rpm，200rpm，250rpm，300rpm，350rpm)；其中，降温结晶的时间为4-13h(例如，可以为4h，5h，6h，7h，8h，9h，10h，11h，12h，13h，该时间包括降温和维持所需的时间)。能够理解的是，在如上所述范围特别是降温速率范围内，能够避免条件变化过于剧烈，影响赤藓糖醇晶体的纯度和颗粒均匀性。其中，进行降温的过程中，降温速率可以在0.1-0.5℃/min的范围内略有变化，例如，刚开始可以以略快的，例如0.5℃/min的速率进行降温，能够获得较快的结晶生长速率，降温至22-27℃之后，可以再以略慢的，例如0.1℃/min的速率进行降温，降温至0-15℃，可以保证获得的晶体较大且均匀。
本发明的发明人在研究中发现，采用如上所述的提供超声波的方法，配合如上所述的预结晶的条件和降温结晶的条件，能够使得晶体更加均匀的、以更合适的速度析出，避免析出过快导致结块和换热表面受热不均。同时如上所述的提供超声波的方法，也避免了容器表面的溶液的过饱和度过高，减少晶体和容器壁面的作用力，避免了换热表面产生晶垢从而降低传热效率的问题。
能够理解的是，进入降温结晶后，不再对所述混合料施加超声，也就不存在重复超声和关闭超声的操作。
根据本发明，优选的，所述固液分离选自离心分离和过滤分离中的至少一种，也可以采用离心分离和过滤分离的组合。
其中，固液分离后，还可以对得到的赤藓糖醇晶体进行干燥。其中，所述干燥的方法可以为本领域的常规选择，例如，可以为选自流化床干燥和真空干燥中的至少一种。
根据本发明，为了进一步提高赤藓糖醇的结晶收率，优选的，取部分所述母液，返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行浓缩；
其中，所述部分母液的量使得，将其返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，所得物料的纯度不低于88重量％。
根据本发明，优选的，将剩余部分母液返回至与待纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行纯化。
根据本发明一种特别优选的实施方式，按照如下的方法制备赤藓糖醇晶体：
(1)将待纯化的赤藓糖醇溶液，通过依次经阳离子树脂和阴离子树脂洗脱的方法进行纯化，得到纯度不低于88重量％的纯化的赤藓糖醇溶液。
取如上所述的纯化的赤藓糖醇溶液，在不高于80℃的条件下，进行减压浓缩，浓缩至浓度为600-660g/L，得到赤藓糖醇浓缩液。
取上述赤藓糖醇浓缩液，和赤藓糖醇晶种混合(相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述赤藓糖醇晶种的用量为8-15g)，然后将物料加入到无水乙醇(相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述无水乙醇的用量为2-3L)中，搅拌均匀。
(2)采用超声循环提取机，将超声波探头伸入混合料的液面以下，调节超声波功率，使之达到350-450W/m3混合料，并设置每隔18-22s超声18-22s，如此持续4-6min后，关闭超声并维持28-33min，重复超声和关闭超声的操作至预结晶结束。其中，预结晶的条件包括：搅拌速率为180-220rpm，温度为45-55℃，时间为1.2-1.8h。
预结晶结束后，进入降温结晶。降温结晶的条件包括：以0.4-0.5℃/min降温速率进行降温，降温至23-26℃之后，再以0.1-0.2℃/min的降温速率进行降温，降温至3-7℃并维持温度为3-7℃，降温结晶过程中搅拌速率180-220rpm，降温结晶持续7-9h，结束后，得到浆液。
(3)将所述浆液进行离心分离，得到赤藓糖醇晶体和母液，并将赤藓糖醇晶体进行真空干燥，并称重。
将部分所述母液返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，并一起进行浓缩；其中，所述部分母液的量使得，将其返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，所得物料的纯度不低于88重量％。剩余母液返回至与待纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行纯化。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
超声循环提取机，型号为GCXZ-2B，购自北京弘祥隆生物技术股份有限公司；
真空干燥箱，型号为DZF-6050，购自上海博证实业有限公司；
离心过滤机，型号为SSC300，购自永乐机械设备制造有限公司。
赤藓糖醇标准品，购自伊诺凯。
实施例1
用于说明本发明提供的制备赤藓糖醇晶体的方法
(1)将待纯化的赤藓糖醇溶液，通过依次经阳离子树脂和阴离子树脂洗脱的方法进行纯化，得到纯度为89重量％的纯化的赤藓糖醇溶液。
取如上所述的纯化的赤藓糖醇溶液，在70℃的条件下，进行减压浓缩，浓缩至浓度为650g/L，得到赤藓糖醇浓缩液。
取20L上述的赤藓糖醇浓缩液，和0.2kg的赤藓糖醇晶种混合(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述赤藓糖醇晶种的用量为10g)，然后将物料加入到50L无水乙醇(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述无水乙醇的用量为2.5L)中，搅拌均匀。
(2)采用超声循环提取机，将超声波探头伸入混合料的液面以下，调节超声波功率，使之达到400W/m3混合料，并设置每隔20s超声20s，如此持续5min后，关闭超声并维持30min，重复超声和关闭超声的操作至预结晶结束。其中，预结晶的条件包括：搅拌速率为200rpm，温度为50℃，时间为1.5h。
预结晶结束后，进入降温结晶。降温结晶的条件包括：以0.4℃/min降温速率进行降温，降温至25℃之后，再以0.1℃/min的降温速率进行降温，降温至4℃并维持温度为4℃，降温结晶过程中搅拌速率200rpm，降温结晶持续8h，结束后，得到浆液。
(3)将所述浆液进行离心分离，得到赤藓糖醇晶体和母液，并将赤藓糖醇晶体进行真空干燥，并称重。
将部分所述母液返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，并一起进行浓缩；其中，所述部分母液的量使得，将其返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，所得物料的纯度不低于89重量％。剩余母液返回至与待纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行纯化。
实施例2
用于说明本发明提供的制备赤藓糖醇晶体的方法
(1)将待纯化的赤藓糖醇溶液，通过依次经阳离子树脂和阴离子树脂洗脱的方法进行纯化，得到纯度为88.5重量％的纯化的赤藓糖醇溶液。
取如上所述的纯化的赤藓糖醇溶液，在65℃的条件下，进行减压浓缩，浓缩至浓度为680g/L，得到赤藓糖醇浓缩液。
取150L上述的赤藓糖醇浓缩液，和4.5kg的赤藓糖醇晶种混合(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述赤藓糖醇晶种的用量为30g)，然后将物料加入到750L无水乙醇(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述无水乙醇的用量为5L)中，搅拌均匀。
(2)采用超声循环提取机，将超声波探头伸入混合料的液面以下，调节超声波功率，使之达到300W/m3混合料，并设置每隔15s超声15s，如此持续7min后，关闭超声并维持40min，重复超声和关闭超声的操作至预结晶结束。其中，预结晶的条件包括：搅拌速率为50rpm，温度为30℃，时间为1h。
预结晶结束后，进入降温结晶。降温结晶的条件包括：以0.4℃/min降温速率进行降温，降温至25℃之后，再以0.1℃/min的降温速率进行降温，降温至15℃并维持温度为15℃，降温结晶过程中搅拌速率50rpm，降温结晶持续4h，结束后，得到浆液。
(3)将所述浆液进行离心分离，得到赤藓糖醇晶体和母液，并将赤藓糖醇晶体进行真空干燥，并称重。
将部分所述母液返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，并一起进行浓缩；其中，所述部分母液的量使得，将其返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，所得物料的纯度不低于88.5重量％。剩余母液返回至与待纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行纯化。
实施例3
用于说明本发明提供的制备赤藓糖醇晶体的方法
(1)将待纯化的赤藓糖醇溶液，通过依次经阳离子树脂和阴离子树脂洗脱的方法进行纯化，得到纯度为88重量％的纯化的赤藓糖醇溶液。
取如上所述的纯化的赤藓糖醇溶液，在70℃的条件下，进行减压浓缩，浓缩至浓度为560g/L，得到赤藓糖醇浓缩液。
取45L上述的赤藓糖醇浓缩液，和0.225kg的赤藓糖醇晶种混合(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述赤藓糖醇晶种的用量为5g)，然后将物料加入到22.5L无水乙醇(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述无水乙醇的用量为0.5L)中，搅拌均匀。
(2)采用超声循环提取机，将超声波探头伸入混合料的液面以下，调节超声波功率，使之达到500W/m3混合料，并设置每隔30s超声30s，如此持续3min后，关闭超声并维持25min，重复超声和关闭超声的操作至预结晶结束。其中，预结晶的条件包括：搅拌速率为350rpm，温度为80℃，时间为2h。
预结晶结束后，进入降温结晶。降温结晶的条件包括：以0.4℃/min降温速率进行降温，降温至25℃之后，再以0.1℃/min的降温速率进行降温，降温至0℃并维持温度为0℃，降温结晶过程中搅拌速率350rpm，降温结晶持续13h，结束后，得到浆液。
(3)将所述浆液进行离心分离，得到赤藓糖醇晶体和母液，并将赤藓糖醇晶体进行真空干燥，并称重。
将部分所述母液返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，并一起进行浓缩；其中，所述部分母液的量使得，将其返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，所得物料的纯度不低于88重量％。剩余母液返回至与待纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行纯化。
实施例4
用于说明本发明提供的制备赤藓糖醇晶体的方法
(1)将待纯化的赤藓糖醇溶液，通过依次经阳离子树脂和阴离子树脂洗脱的方法进行纯化，得到纯度为88重量％的纯化的赤藓糖醇溶液。
取如上所述的纯化的赤藓糖醇溶液，在75℃的条件下，进行减压浓缩，浓缩至浓度为450g/L，得到赤藓糖醇浓缩液。
取20L上述的赤藓糖醇浓缩液，和0.02kg的赤藓糖醇晶种混合(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述赤藓糖醇晶种的用量为1g)，然后将物料加入到6L无水乙醇(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述无水乙醇的用量为0.3L)中，搅拌均匀。
(2)采用超声循环提取机，将超声波探头伸入混合料的液面以下，调节超声波功率，使之达到100W/m3混合料，并设置每隔10s超声10s，如此持续1min后，关闭超声并维持20min，重复超声和关闭超声的操作至预结晶结束。其中，预结晶的条件包括：搅拌速率为350rpm，温度为60℃，时间为2h。
预结晶结束后，进入降温结晶。降温结晶的条件包括：以0.4℃/min降温速率进行降温，降温至25℃之后，再以0.1℃/min的降温速率进行降温，降温至0℃并维持温度为0℃，降温结晶过程中搅拌速率350rpm，降温结晶持续10h，结束后，得到浆液。
(3)将所述浆液进行离心分离，得到赤藓糖醇晶体和母液，并将赤藓糖醇晶体进行真空干燥，并称重。
将部分所述母液返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，并一起进行浓缩；其中，所述部分母液的量使得，将其返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，所得物料的纯度不低于88重量％。剩余母液返回至与待纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行纯化。
实施例5
用于说明本发明提供的制备赤藓糖醇晶体的方法
(1)将待纯化的赤藓糖醇溶液，通过依次经阳离子树脂和阴离子树脂洗脱的方法进行纯化，得到纯度为88重量％的纯化的赤藓糖醇溶液。
取如上所述的纯化的赤藓糖醇溶液，在80℃的条件下，进行减压浓缩，浓缩至浓度为700g/L，得到赤藓糖醇浓缩液。
取20L上述的赤藓糖醇浓缩液，和1kg的赤藓糖醇晶种混合(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述赤藓糖醇晶种的用量为50g)，然后将物料加入到200L无水乙醇(即，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述无水乙醇的用量为10L)中，搅拌均匀。
(2)采用超声循环提取机，将超声波探头伸入混合料的液面以下，调节超声波功率，使之达到1000W/m3混合料，并设置每隔120s超声120s，如此持续10min后，关闭超声并维持60min，重复超声和关闭超声的操作至预结晶结束。其中，预结晶的条件包括：搅拌速率为100rpm，温度为60℃，时间为2h。
预结晶结束后，进入降温结晶。降温结晶的条件包括：以0.4℃/min降温速率进行降温，降温至25℃之后，再以0.1℃/min的降温速率进行降温，降温至7℃并维持温度为7℃，降温结晶过程中搅拌速率100rpm，降温结晶持续10h，结束后，得到浆液。
(3)将所述浆液进行离心分离，得到赤藓糖醇晶体和母液，并将赤藓糖醇晶体进行真空干燥，并称重。
将部分所述母液返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，并一起进行浓缩；其中，所述部分母液的量使得，将其返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，所得物料的纯度不低于88重量％。剩余母液返回至与待纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行纯化。
实施例6
按照实施例1的方法制备赤藓糖醇晶体，不同的是，在预结晶过程中，一直保持每隔20s超声20s，即没有关闭超声并维持的状态。
对比例1
按照实施例1的方法进行D-阿洛酮糖结晶，不同的是，在预结晶中，不提供超声波。
对比例2
取20L实施例1中获得的纯化的赤藓糖醇溶液，采用CN201210364267.X中的方法添加有机溶剂进行结晶。
测试例
对实施例1-6和对比例1-2获得的赤藓糖醇晶体，进行纯度、结晶率和颗粒均匀度的检测，观察晶体中是否存在空腔或结块现象，并观察设备换热表面是否有明显的晶垢形成。其中，所获得的晶体指的是，浆液固液分离，并对赤藓糖醇晶体进行干燥后的赤藓糖醇晶体，即此时母液还没有被返回时得到的赤藓糖醇晶体。
赤藓糖醇纯度的检测方法为：采用赤藓糖醇标准品，配制赤藓糖醇标准液(10.0mg/mL)，依次稀释成浓度为10.0mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL及0.25mg/mL的溶液。使用高效液相色谱系统测定赤藓糖醇标准溶液峰面积，以峰面积(3组平行样取平均值)为纵坐标，溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，并根据标准曲线对实施例1-6和对比例1-2的赤藓糖醇样品进行定量分析。
其中，结晶率的计算方法为：(赤藓糖醇晶体质量)/(赤藓糖醇浓缩液中赤藓糖醇的质量+晶种质量)×100％。
晶体均匀度评价方法：用40目和60目筛确定粒径在40-60目范围内的赤藓糖醇颗粒的重量占赤藓糖醇晶体总质量的比例评价赤藓糖醇晶体颗粒的均匀比例。
表1
通过表1的结果可以看出，采用本发明技术方案的实施例1-6的结晶率和纯度较高，并且获得的晶体粒度分布较为均一，并避免了晶体中空腔或者结块现象的发生，换热表面没有明显的晶垢，其中实施例1-3的效果更好。且和实施例6相比，采用实施例1中的方法，更能够节省能耗并且能够更准确的控制温度。对比例1-2的结晶率、纯度较差，晶体粒度分布不均一，晶体中存在明显的结块和空腔，换热表面有明显的晶垢。并且，从实施例1和对比例1的结果可以看出，采用本发明的技术方案，能够在较短的时间内，获得较高的结晶率，因此能够大幅缩短时间，提高效率。
此外，采用本发明的技术方案，工艺简单，操作条件温和，对设备要求较低，成本低，易于工业化，有较好的产业化前景。
以下实施例用于说明制备待纯化的赤藓糖醇溶液用的解脂亚罗酵母以及采用该解脂亚罗酵母进行发酵制备待纯化的赤藓糖醇溶液的方法。
以下实施例中，活化培养基：葡萄糖150g/L，酵母膏15g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。
甘油菌指的是保存在甘油中的解脂亚罗酵母CGMCC No.22632，活菌数为107cfu/mL。
发酵液(上清)中葡萄糖的浓度使用SBA-40E型生物传感器进行检测，D-葡萄糖酶膜，进样量25μL；
赤藓糖醇、甘露醇、阿拉伯糖醇、甘油含量(均指发酵液(上清)中的含量)的检测方法为液相色谱检测方法，使用Agilent Technologies 1260Infinity II色谱仪和RID检出器，Aminex HPX-87H Column 300×7.8mm分离柱，流动相为0.005M硫酸。
糖醇转化率为发酵产生的赤藓糖醇的质量与消耗掉的葡萄糖的质量的比值。
实施例7
将解脂亚罗酵母CGMCC No.22632接种至活化培养基，30℃200rpm培养20h，按10％(v/v)接种量接种到50ml发酵培养基(发酵培养基的成分配比为：葡萄糖325g/L，酵母浸粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸铵5g/L，pH6)中，32℃250rpm培养，每24h取样并补充挥发的水分，培养96h，赤藓糖醇产量明显提升并且副产物基本检测不到，这个菌株96h可产赤藓糖醇168.5g/L，副产物甘露醇含量低于1g/L，阿拉伯糖醇、甘油含量未检出。将该菌株命名为CoY1-M1。
取CoY1-M1甘油菌按3‰(v/v)接种量接种至活化培养基，30℃200rpm培养20h，按10％(v/v)接种量将菌液接种至含有发酵培养基的5L发酵罐，定时取样进行检测(发酵初期每隔12h取样检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度估算发酵速率，根据葡萄糖浓度和发酵速率判断发酵终点即耗尽葡萄糖，在发酵终点前12h每隔0.5h取样检测葡萄糖浓度)。接种后发酵罐的装液量为60体积％，发酵培养基的成分配比为：葡萄糖315g/L，酵母浸粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸铵5g/L，pH6。发酵温度控制32℃，转速为200-800rpm，通气量为0.5-1vvm(L/min·L)，使溶氧量控制在20-25vol％。CoY1-M1于92h耗尽葡萄糖。CoY1-M1发酵终点(耗尽葡萄糖)赤藓糖醇含量为189.3g/L，甘露醇含量为0.39g/L，阿拉伯糖醇、甘油检测不到。发酵液下罐后室温密闭放置1天后取样检测，赤藓糖醇含量无明显变化(含量上升不超过0.5g/L)，而甘露醇含量降低至0.05g/L；继续放置到7天再取样检测，赤藓糖醇仍无明显变化，甘露醇基本检测不到。这株菌有副产物少、不利用赤藓糖醇的优点。
将CoY1-M1的发酵液采用离心—微滤—纳滤工艺进行处理，即先对发酵液进行离心，离心后的发酵液上清先后经过微滤、纳滤。处理工艺的条件为：离心4000rpm，15min，25℃；微滤使用陶瓷膜，操作压力0.15MPa，温度30℃；纳滤截留分子量250-300Da，操作压力1MPa，温度30℃。CoY1-M1发酵液单位时间微滤透过截留体积比为80％，单位时间纳滤透过截留体积比为75％。CoY1-M1发酵液纳滤浓缩侧液体较少，并且浓缩后也没有白色粘稠杂质，对后续结晶分离更为友好。
实施例8
发酵培养基的成分配比为：葡萄糖325g/L，酵母浸粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，柠檬酸铵5g/L，pH5.8。
取保藏的甘油菌按3‰(v/v)接种至300mL活化培养基中，30℃200rpm培养20h(OD600＝10)，按10％(v/v)接种量接种至含有发酵培养基的5L发酵罐。接种后发酵罐的的装液量为60体积％，发酵温度控制在32℃，转速为200-1000rpm，通气量为0.5-1vvm(L/min·L)，使溶氧量控制在25-32vol％。发酵初期每隔12h取样检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度估算发酵速率，根据葡萄糖浓度和发酵速率判断发酵终点(耗尽葡萄糖)，在发酵终点前12h每隔0.5h取样检测葡萄糖浓度。
发酵至发酵液中葡萄糖浓度小于1g/L发酵结束，发酵结束后测定发酵液中赤藓糖醇的含量，并计算糖醇转化率。
97h发酵结束，赤藓糖醇含量为199.4g/L，糖醇转化率61.3％。
实施例9
发酵培养基的成分配比为：葡萄糖220g/L，酵母浸粉1g/L，玉米浆粉5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸铵5g/L，吐温80 0.25g/L，pH6。
取保藏的甘油菌按3‰(v/v)接种至100mL活化培养基，30℃200rpm过夜培养(16h)，再按10％(v/v)接种量转接至600mL发酵培养基，30℃240rpm培养16h得到种子液(OD600＝25)。
将种子液全部接入10L发酵罐，接种后发酵罐的装液量为60体积％，发酵温度控制在32℃，转速为200-900rpm，通气量为0.5-1vvm(L/min·L)，使溶氧量控制在20-25vol％。发酵初期每隔12h取样检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度估算发酵速率，根据葡萄糖浓度和发酵速率判断发酵终点(耗尽葡萄糖)，在发酵终点前12h每隔0.5h取样检测葡萄糖浓度。
发酵至发酵液中葡萄糖浓度小于1g/L发酵结束，发酵结束后测定发酵液中赤藓糖醇的含量，并计算糖醇转化率。
61h发酵结束，赤藓糖醇含量为122.7g/L，糖醇转化率55.8％。
实施例10
本实施例中，发酵培养基的成分配比为：葡萄糖280g/L，酵母浸粉8g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1g/L，柠檬酸铵5g/L，pH6。
取斜面保藏的甘油菌接种至350mL活化培养基，30℃200rpm过夜培养(16h)，再按10％(v/v)接种量转接至含有发酵培养基的5L发酵罐中，接种后发酵罐的装液量为70体积％，发酵控制30℃，恒定转速350rpm，控制通气量为0.5vvm(L/min·L)，培养12h得到种子液(OD600＝25)。
将种子液全部接入70L发酵罐，接种后发酵罐的装液量为60体积％，发酵温度控制在32℃，转速为200-800rpm，通气量为0.3-0.8vvm(L/min·L)，使溶氧量控制在20-25vol％。发酵初期每隔12h取样检测葡萄糖浓度，当发酵液中葡萄糖浓度低于100g/L时开始流加650g/L葡萄糖溶液，流加葡萄糖溶液的流速控制在维持发酵液中糖浓度在100-120g/L，补料18L后停止流加(折算总糖约为390g/L)，继续发酵。每隔12h取样检测葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度估算发酵速率，根据葡萄糖浓度和发酵速率判断发酵终点(耗尽葡萄糖)，在发酵终点前12h每隔0.5h取样检测葡萄糖浓度。
发酵至发酵液中葡萄糖浓度小于1g/L发酵结束，发酵结束后测定发酵液中赤藓糖醇的含量，并计算糖醇转化率。
98h发酵结束，发酵液中赤藓糖醇含量为225.2g/L，糖醇转化率57.6％。
根据实施例7-10可以看出，采用解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)发酵生产赤藓糖醇，赤藓糖醇产量高、收率高，发酵副产物和杂质少。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种制备赤藓糖醇晶体的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)将赤藓糖醇浓缩液、赤藓糖醇晶种和乙醇混合，得到混合物料；
(2)在超声波的间歇存在下使所述混合物料进行预结晶，然后进行降温结晶，得到浆液；
(3)将所述浆液进行固液分离，得到赤藓糖醇晶体和母液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，获得赤藓糖醇浓缩液的方法包括：将待纯化的赤藓糖醇溶液进行纯化，得到纯化的赤藓糖醇溶液，将纯化的赤藓糖醇溶液进行浓缩，得到赤藓糖醇浓缩液；
其中，所述纯化的赤藓糖醇溶液的纯度不低于88重量％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述赤藓糖醇浓缩液的浓度为450-700g/L，优选为560g/L-680g/L；
优选的，所述浓缩的方法包括：在温度不高于80℃的条件下，进行减压浓缩。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述赤藓糖醇晶种的用量为1-50g，更优选为5-30g。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于1L的赤藓糖醇浓缩液，所述乙醇的用量为0.3-10L，更优选为0.5-5L。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，提供超声波的方法为：每隔10-120s超声10-60s，如此持续1-10min之后，关闭超声并维持20-60min，重复超声和关闭超声至预结晶结束；
优选的，提供超声波的方法为：每隔15-30s超声15-30s，如此持续3-7min之后，关闭超声并维持25-40min，重复超声和关闭超声至预结晶结束。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，所述超声的功率为100-1000W/m3混合物料，优选为300-500W/m3混合物料。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预结晶的条件包括：温度为30-80℃，时间为1-2h，搅拌转速为50-350rpm。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其中，所述降温结晶的条件包括：以0.1-0.5℃/min的降温速率进行降温，降温至0-15℃并维持温度为0-15℃，降温结晶过程中的搅拌速率为50-350rpm；
其中，降温结晶的时间为4-13h。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：取部分所述母液，返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行浓缩；
其中，所述部分母液的量使得，将其返回至与纯化的赤藓糖醇溶液混合后，所得物料的纯度不低于88重量％；
优选的，将剩余部分母液返回至与待纯化的赤藓糖醇溶液混合，并一起进行纯化。
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