CN114686531B - 一种生物转化制备1,3-丙二醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物转化制备1,3‑丙二醇的方法,是将发酵过程分为发酵初期、发酵调整期和发酵后期,发酵初期是指在发酵培养基中接入发酵菌种子液,在微氧条件下开始发酵培养;发酵调整期是指随着发酵进行,当1,3‑丙二醇生产速率低于1g·L‑1·h‑1时,加入酵母菌菌液,当标志性副产物浓度降至一定程度后,切换回发酵初期的培养方式,此时为发酵后期,直至发酵结束。本发明方法利用外源性底物水平调控解决了微氧模式下副产物抑制问题,延长了发酵活跃期,提高了发酵水平。

Description

一种生物转化制备1,3-丙二醇的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种生物转化制备1,3-丙二醇的方法。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-Propanediol,PDO)主要用于生产性能优异的新型聚酯PTT(Polytrimethylene Terephthalate)。1,3-丙二醇工业生产方法主要有化学法和生物法两大类。生物法是目前研究的热点,根据原料不同可分为葡萄糖一步转化法和甘油转化法。生物法虽然起步较早,但是直到二十世纪八十年代才逐渐引起人们的重视。与化学法相比,生物法具有条件温和、操作简便、选择性好、节省能源、设备投资少和环境良好等特点,是一种生产成本低、污染少的方法,符合当今“绿色化工”和“可持续性发展”的要求。
目前以甘油为底物,利用克雷伯氏菌生物转化制备1,3-丙二醇的技术路线,由于其代谢途径简单、发酵菌种易于改造,所以该路线被广泛采用。克雷伯氏菌是一类典型的兼性厌氧微生物,在厌氧、微氧以及好氧条件下均能生长,因此甘油经生物转化制备1,3-丙二醇工艺主要分为好氧模式、微氧模式以及厌氧模式。从代谢途径机理研究发现:(1)厌氧条件下甘油的选择性最高,但过程中需要通入高通量的氮气以维持厌氧条件,能耗较高;(2)微氧、好氧条件下,发酵副产物较多,目前多采用基因工程菌,但是发酵水平不高。
针对好氧模式、微氧模式以及厌氧模式的技术问题,近年来从克雷伯氏菌代谢途径入手,进行了深入研究,形成了多种技术方案。
CN1348007A公开了一种微生物微氧发酵生产1,3-丙二醇的方法,是在温度、pH和搅拌转速恒定的条件下,进行间歇、批式流加或连续发酵将甘油生物转化为1,3-丙二醇,发酵液中1,3-丙二醇的最终浓度可达到5~70g/L。该发明方法的特征在于:a)发酵过程可以在微氧条件下进行,空气通入量为0~2vvm;b)间歇发酵时培养基中甘油的质量百分比浓度为2%~20%,批式流加发酵时补加的甘油浓度为10%~100%,连续发酵培养基中甘油浓度为2%~20%;c)连续发酵是以1%~6%的初始甘油浓度进行菌体予培养至菌体浓度达到每升发酵液中含0.2~2.0g干细胞后,再以0.1~0.5h-1的稀释率连续流加发酵培养基的恒化培养过程。该专利所使用的微生物细胞不仅在厌氧条件下,而且在微氧条件下都能将甘油转化为1,3-丙二醇,而且微氧条件下发酵液中1,3-丙二醇的浓度与厌氧发酵相当或略高一些,为微生物发酵法生产1,3-丙二醇的工业化提供了简单经济的发酵工艺。
CN1434122A公开了一种采用两段双底物集成发酵生产1,3-丙二醇的方法,包括以下步骤:(1)兼性厌氧菌的种子活化;(2)以葡萄糖为碳源,在好氧条件下进行一级种子培养;(3)将含有葡萄糖和甘油的集成发酵培养基装入发酵罐中,将经过上述一级种子培养的兼性厌氧菌的种子接入发酵罐中,形成集成发酵液;在35℃~38℃温度下,通入空气,进行搅拌,开始进行以葡萄糖为主要碳源的菌体好氧培养;(4)当上述集成发酵液中的葡萄糖消耗完时,停止通入空气,加入甘油和硫酸铵;在 35℃~38℃温度下,通入氮气,进行搅拌,转入厌氧条件下的将甘油转换为1,3 -丙二醇的阶段;在该过程中需要补加甘油以保持甘油的浓度,保证有足够的甘油进行转换;该过程伴随有副产物乙醇、乙酸和乳酸生成;(5)当菌体不再生长时,工艺过程结束。该专利二级种子培养是以葡萄糖和甘油为混合双底物,将好氧条件下的二级种子培养和厌氧条件下的甘油厌氧转化集成在同一个发酵罐中进行,并以葡萄糖是否消耗完为好氧到厌氧转换的条件。
CN101307335A公开了一种甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的改进方法,首先制备用于培养克雷伯氏杆菌的发酵培养基,往上述培养基中接入克雷伯氏杆菌种子培养液,以甘油为底物进行厌氧发酵以合成1,3-丙二醇,发酵液经脱盐、蒸馏和真空精馏,制得1,3-丙二醇产品。该发明在发酵过程中加入碱性钙盐对体系进行在线pH值控制,改善了甘油在还原与氧化两个支路之间的代谢,从而有利于菌体的生长和产物的生产。
CN102864177A公开一种促进微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法,包括种子液培养过程和发酵过程,所述发酵过程使用的发酵培养基中含有浓度为0.1g/L~0.4g/L丙酮酸和/或α-酮戊二酸,发酵过程依次分为微氧发酵和厌氧发酵,当OD值大于7时由微氧发酵转变为厌氧发酵。该方法能够有效促进甘油的转化,大幅提高最终产物中1,3-丙二醇的浓度。
上述方法虽然都从克雷伯氏菌兼性厌氧这一特征入手,通过阶段调控、补加外源物质等方法,取得了一定的效果,但是从技术应用角度看,微氧发酵模式具有显著的经济性,如果可以解决微氧模式下副产物多、发酵活跃期短等技术问题,将具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种生物转化制备1,3-丙二醇的方法。本发明方法利用外源性底物水平调控解决了微氧模式下副产物抑制问题,延长了发酵活跃期,提高了发酵水平。
本发明提供的生物转化制备1,3-丙二醇的方法,包括如下内容:
将发酵过程分为发酵初期、发酵调整期和发酵后期,发酵初期是指在发酵培养基中接入发酵菌种子液,在微氧条件下开始发酵培养;发酵调整期是指随着发酵进行,当1,3-丙二醇生产速率低于1g·L-1·h-1时,加入酵母菌菌液,当标志性副产物浓度降至一定程度后,切换回发酵初期的培养方式,此时为发酵后期,直至发酵结束。
本发明中,所述的发酵菌为能够利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的微生物,一般为兼性厌氧菌,具体如克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)等中的任意一种,优选克雷伯杆菌。
本发明中,所述的发酵菌种子液是将发酵菌接种至种子培养基,在微氧条件下进行培养获得。具体是将活化的发酵菌接种至种子培养基中,培养温度为25~40℃,优选35~40℃;搅拌转速为100~500rpm,优选200~400rpm;pH控制为6.0~7.5,优选6.5~7.2;培养时间为12~36h,优选18~24h。所述的种子培养基的组成为:甘油 20~40g/L,NH4Cl 4~6g/L,KCl 0.4~0.6g/L,NaH2PO4·H2O 0.8~1.1g/L,Na2SO4 0.1~0.3g/L,MgCl2·6H2O0.1~0.2g/L,柠檬酸0.2~0.4g/L,酵母膏 0.5~1.0g/L,Vc 0.05~0.15g/L。
本发明中,所述的发酵培养基的组成为:甘油 30~50g/L,NH4Cl 5~7g/L,KCl0.5~0.7g/L,NaH2PO4·H2O 1~1.2g/L,Na2SO4 0.2~0.4g/L,MgCl2·6H2O 0.2~0.4g/L,柠檬酸 0.2~0.4g/L,酵母膏 1~1.5g/L,Vc 0.1~0.2g/L。
本发明中,发酵菌种子液的接种体积比为2%~20%,优选10%~15%。发酵条件为:发酵温度为30~42℃,优选为35~40℃;搅拌转速为100~500rpm,优选200~400rpm;pH控制为6.0~7.5,优选6.8~7.2。
本发明中,所述的微氧条件是在培养体系中不通空气或通空气量小于0.1VVM。
本发明中,所述的酵母菌为具有较强有机酸代谢能力的真核微生物,如可以是假丝酵母菌、酿酒酵母菌等,优选热带假丝酵母菌。
本发明中,所述的酵母菌菌液的制备是本领域熟知的培养方法,具体是将活化的酵母菌接种至培养基中培养获得种子液,培养温度为25~35℃,优选28~32℃,搅拌转速为100~500rpm,优选200~400rpm;pH控制为6.0~7.5,优选6.8~7.2;培养时间为15~48h。
本发明中,酵母菌菌液的加入体积比为2%~15%,优选2%~5%。
本发明中,加入酵母菌菌液后,不进行pH控制,最好进行温度调控,调控温度为25~35℃,优选28~32℃。
本发明中,所述的标志性副产物为糖代谢途径中的短链有机酸,如琥珀酸、乳酸、乙酸等中的任意一种,优选乙酸。若以乙酸作为标志性副产物,当乙酸浓度低于2g/L时,作为切换点;若以乳酸作为标志性副产物,当乳酸浓度低于3g/L时,作为切换点;若以琥珀酸作为标志性副产物,当琥珀酸浓度低于4g/L时,作为切换点。
本发明中,所述的发酵调整期不进行甘油补加;发酵初期和发酵末期流加甘油使发酵体系中甘油浓度为20~40g/L。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本申请发明人在研究过程中发现,微氧模式下存在副产物多、发酵活跃期短等不足,导致发酵水平不高,其中副产物主要是短链有机酸。针对这一问题发明人将发酵过程分解为发酵初期、发酵调整期和发酵末期,并在发酵调整期加入酵母菌菌液,通过内源性代谢以消耗体系中副产物浓度,降低了发酵体系中离子浓度,利于延长发酵周期,提高发酵水平。
(2)本发明利用两种微生物的最适温度和耐受温度的重合性,通过温度调节使两种微生物在发酵周期的不同阶段发挥作用,比如在发酵调整期将温度调节至酵母菌消耗副产物的适宜温度,限制克雷伯氏菌的反应活性,又不影响其生长活性;当副产物消耗后,再调节温度使酵母菌代谢受到抑制,克雷伯氏菌活性提升,从而解决了发酵过程副产物多和1,3-丙二醇产出的阶段性控制,提高了发酵水平。
(3)本发明选择具有一定甘油产出途径的酵母菌,其在代谢副产物的同时能产生甘油作为1,3-丙二醇的转化底物,减少甘油流加量,从而提高了发酵过程的经济性。
(4)本发明方法生产效率高,能耗低,具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料,如无特殊说明,均从常规生化试剂商店购买得到。
发明实施例中,以Waters 2695分离系统与Waters 2414示差检测器构成液相分析系统,其中分离柱选用Aminex HPX-87H有机酸和醇分析柱用于酸类和醇类的分离。以琥珀酸、乳酸、甘油、乙酸、1,3-丙二醇、乙醇标准样品建立标准图谱,反应过程中进行产物分析。
本发明实施例中,采用CN1955304A公开的克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号:CGMCCNo.0798;所用的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)PF-UV-56 已经于CN1611608A公开,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号:CGMCC No.0356。
本发明实施例中,克雷伯杆菌种子培养基与发酵培养基的基本组成见表1。
表1 克雷伯杆菌种子培养基及发酵培养基
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本发明酵母菌培养基组成如表2所示。
表2 酵母菌培养基
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实施例1
取活化的克雷伯杆菌菌液70mL,与630mL种子培养基混合,进行微氧培养,不通空气。培养条件为:培养温度为 37℃,搅拌转速为300rpm,pH控制在7.0,培养20h后获得发酵菌种子液。
将活化的假丝酵母菌液60mL与540mL酵母培养基混合,进行培养。培养条件为:培养温度为30℃,搅拌转速为300rpm,pH控制在7.0,培养24h后获得的酵母菌种子液。
发酵初期:发酵罐体积选择15L,取600mL发酵菌种子液接入到5.4L发酵培养基中,发酵菌种子液的接种体积比为10%,发酵过程中流加甘油,以维持发酵体系中甘油浓度在30g/L。发酵条件为:微氧条件,即不通空气,发酵温度为37℃,搅拌转速为400rpm, pH控制为7.0。
发酵调整期:随着发酵过程的进行,当1,3-丙二醇的生产速率低于0.9g·L-1·h-1时,加入酵母菌种子液,加入体积比为3%,并降低发酵温度至29℃,通气量调整至0.1VVM,调整期内不进行pH控制,不进行甘油补加;继续发酵同时监测发酵体系中的乙酸浓度的变化。
发酵后期:当乙酸浓度低于2g/L时,切换回发酵初期的培养方式及培养条件,即不通空气,发酵温度为37℃,搅拌转速为400rpm, pH控制为7.0,流加甘油使发酵体系中甘油浓度控制在30g/L,直至发酵结束。
发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为89.6g/L,生产速率为2.24 g·L-1·h-1
实施例2
取活化的克雷伯杆菌菌液70mL,与630mL种子培养基混合,进行微氧培养,不通空气。培养条件为:培养温度为 35℃,搅拌转速为200rpm,pH控制在6.5,培养18h后获得发酵菌种子液。
将活化的假丝酵母菌液60mL与540mL酵母培养基混合,进行培养。培养条件为:培养温度为 28℃,搅拌转速为200rpm,pH控制在6.8,培养15h后获得的酵母菌种子液。
发酵初期:发酵罐体积选择15L,取600mL发酵菌种子液接入到5.4L发酵培养基中,发酵菌种子液的接种体积比为10%,发酵过程中流加甘油,以维持发酵体系中甘油浓度在30g/L。发酵条件为:微氧条件,即不通空气,发酵温度为35℃,搅拌转速为200rpm, pH控制为6.8。
发酵调整期:随着发酵过程的进行,当1,3-丙二醇的生产速率为0.85 g·L-1·h-1时,加入酵母菌种子液,加入体积比为2%,并降低发酵温度至28℃,通气量调整至0.05VVM,调整期内不进行pH控制,不进行甘油补加;继续发酵同时监测发酵体系中的乙酸浓度的变化。
发酵后期:当乙酸浓度低于2g/L时,切换回发酵初期的培养方式及培养条件,即不通空气,发酵温度为35℃,搅拌转速为200rpm, pH控制为6.8,流加甘油使发酵体系中甘油浓度控制在30g/L,直至发酵结束。
发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为84.2g/L,生产速率2.105 g·L-1·h-1
实施例3
取活化的克雷伯杆菌菌液70mL,与630mL种子培养基混合,进行微氧培养,通气量0.1VVM。培养条件为:培养温度为 40℃,搅拌转速为200rpm,pH控制在7.2,培养24h后获得发酵菌种子液。
将活化的假丝酵母菌液60mL与540mL酵母培养基混合,进行培养。培养条件为:培养温度为 32℃,搅拌转速为400rpm,pH控制在7.2,培养48h后获得的酵母菌种子液。
发酵初期:发酵罐体积选择15L,取400mL发酵菌种子液接入到5.6L发酵培养基中,发酵菌种子液的接种体积比为15%,发酵过程中流加甘油,以维持发酵体系中甘油浓度在40g/L。发酵条件为:微氧条件,通气量0.1VVM,发酵温度为40℃,搅拌转速为400rpm, pH控制为7.2。
发酵调整期:随着发酵过程的进行,当1,3-丙二醇的生产速率为0.87 g·L-1·h-1时,加入酵母菌种子液,加入体积比为5%,并降低发酵温度至30℃,通气量调整至0.1VVM,调整期内不进行pH控制,不进行甘油补加;继续发酵同时监测发酵体系中的乙酸浓度的变化。
发酵后期:当乙酸浓度低于2g/L时,切换回发酵初期的培养方式及培养条件,即通气量0.1VVM,发酵温度为40℃,搅拌转速为400rpm, pH控制为7.2,流加甘油使发酵体系中甘油浓度控制在40g/L,直至发酵结束。
发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为86.6g/L,生产速率2.165 g·L-1·h-1
实施例4
同实施例1,不同在于:发酵调整期监测体系中乳酸浓度的变化,当乳酸浓度低于3g/L时,切换回发酵初期的培养方式及条件。发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为81.8g/L,生产速率2.045 g·L-1·h-1
实施例5
同实施例1,不同在于:发酵调整期监测体系中琥珀酸浓度的变化,当琥珀酸浓度低于4g/L时,切换回发酵初期的培养方式及条件。发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为80.2g/L,生产速率2.005 g·L-1·h-1
实施例6
同实施例1,不同在于:发酵调整期加入酵母菌菌液为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FE-B,保藏号为CGMCC No.2735。按照实施例1的相关步骤,发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为82.2g/L,生产速率2.055 g·L-1·h-1
比较例1
取活化的克雷伯杆菌菌液70mL,与630mL种子培养基混合,进行微氧培养,不通空气。培养条件为:培养温度为 37℃,搅拌转速为300rpm,pH控制在7,培养20h后获得发酵菌种子液。
发酵罐体积选择15L,取600mL发酵菌种子液接入到5.4L发酵培养基中,发酵菌种子液的接种体积比为10%,发酵过程中流加甘油,以维持发酵体系中甘油浓度在30g/L。发酵条件为:微氧条件,即不通空气,发酵温度为37℃,搅拌转速为400rpm, pH控制为7.0。
发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为72.0g/L,生产速率1.8 g·L-1·h-1
比较例2
取活化的克雷伯杆菌菌液70mL,与630mL种子培养基混合,进行微氧培养,不通空气。培养条件为:培养温度为 37℃,搅拌转速为300rpm,pH控制在7,培养20h后获得发酵菌种子液。
发酵初期:发酵罐体积选择15L,取600mL发酵菌种子液接入到5.4L发酵培养基中,发酵菌种子液的接种体积比为10%,发酵过程中流加甘油,以维持发酵体系中甘油浓度在30g/L。发酵条件为:微氧条件,即不通空气,发酵温度为37℃,搅拌转速为400rpm, pH控制为7.0。
发酵调整期:随着发酵过程的进行,当1,3-丙二醇的生产速率为0.9g·L-1·h-1时,未加入酵母菌种子液,降低发酵温度至29℃,通气量调整至0.1VVM,调整期内不进行pH控制,不进行甘油补加。
发酵后期:按照实施例1中发酵调整期的控制时间,切换回发酵初期的培养方式及培养条件,流加甘油使发酵体系中甘油浓度控制在30g/L,直至发酵结束。
发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为65.8g/L,生产速率1.645 g·L-1·h-1
比较例3
取活化的克雷伯杆菌菌液70mL,与630mL种子培养基混合,进行微氧培养,不通空气。培养条件为:培养温度为 37℃,搅拌转速为300rpm,pH控制在7,培养20h后获得发酵菌种子液。
将活化的假丝酵母菌液60mL与540mL酵母培养基混合,进行微氧培养。培养条件为:培养温度为 30℃,搅拌转速为300rpm,pH控制在7.0,培养24h后获得的酵母菌种子液。
发酵初期:发酵罐体积选择15L,取600mL发酵菌种子液接入到5.4L发酵培养基中,发酵菌种子液的接种体积比为10%,发酵过程中流加甘油,以维持发酵体系中甘油浓度在30g/L。发酵条件为:微氧条件,即不通空气,发酵温度为37℃,搅拌转速为400rpm,pH控制为7.0。
发酵调整期:随着发酵过程的进行,当1,3-丙二醇的生产速率为0.9 g·L-1·h-1时,加入酵母菌种子液,以发酵初期的培养条件进行双菌种共发酵,直至发酵结束。
发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为68.6g/L,生产速率1.715 g·L-1·h-1
比较例4
取活化的克雷伯杆菌菌液70mL,与630mL种子培养基混合,进行微氧培养,不通空气。培养条件为:培养温度为 37℃,搅拌转速为300rpm,pH控制在7,培养20h后获得发酵菌种子液。
将活化的假丝酵母菌液60mL与540mL酵母培养基混合,进行微氧培养。培养条件为:培养温度为 30℃,搅拌转速为300rpm,pH控制在7.0,培养24h后获得的酵母菌种子液。
发酵初期:发酵罐体积选择15L,取600mL发酵菌种子液接入到5.4L发酵培养基中,发酵菌种子液的接种体积比为10%,发酵过程中流加甘油,以维持发酵体系中甘油浓度在30g/L。发酵条件为:微氧条件,即不通空气,发酵温度为37℃,搅拌转速为400rpm, pH控制为7.0。
发酵调整期:随着发酵过程的进行,当1,3-丙二醇的生产速率为0.9 g·L-1·h-1时,加入酵母菌种子液,加入体积比为3%,并降低发酵温度至29℃,通气量调整至0.1VVM,调整期内不进行pH控制,不进行甘油补加,未切换回发酵初期的培养方式,直至发酵结束。
发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为64.2g/L,生产速率1.605 g·L-1·h-1
比较例5
同实施例1,不同在于:当乙酸浓度降至4g/L时,切换回发酵初期的培养方式及培养条件,流加甘油使发酵体系中甘油浓度控制在30g/L,发酵温度为37℃,pH为7.0,直至发酵结束。
发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为70.6g/L,生产速率1.765 g·L-1·h-1
比较例6
同实施例1,不同在于:发酵调整期加入CN105647813A所述的绿色木霉(Trichoderma viride)F4代替酵母菌,保藏号为CGMCC NO. 2736。按照实施例1的相关步骤,发酵40h后,经检测1,3-丙二醇浓度为63.2g/L,生产强度1.58gL-1h-1

Claims (14)

1.一种生物转化制备1,3-丙二醇的方法,其特征在于包括如下内容:将发酵过程分为发酵初期、发酵调整期和发酵后期,发酵初期是指在发酵培养基中接入发酵菌种子液,在微氧条件下开始发酵培养;发酵调整期是指随着发酵进行,当1,3-丙二醇生产速率低于1g·L-1·h-1时,加入酵母菌菌液,当标志性副产物浓度降至一定程度后,切换回发酵初期的培养方式,此时为发酵后期,直至发酵结束;
所述的发酵菌为克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae),保藏编号为CGMCCNo.0798;
所述的酵母菌为保藏编号CGMCC No.0356的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)PF-UV-56或保藏号为CGMCC No.2735的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FE-B;
发酵初期的发酵温度为35~40℃,加入酵母菌菌液后,调控温度为28~32℃;
所述的标志性副产物为琥珀酸、乳酸、乙酸中的任意一种;以乙酸作为标志性副产物,当乙酸浓度低于2g/L时,作为切换点;或者以乳酸作为标志性副产物,当乳酸浓度低于3g/L时,作为切换点;或者以琥珀酸作为标志性副产物,当琥珀酸浓度低于4g/L时,作为切换点。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的发酵菌种子液是将发酵菌接种至种子培养基,在微氧条件下进行培养获得。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:发酵菌种子液的制备是将活化的发酵菌接种至种子培养基中,培养温度为25~40℃,搅拌转速为100~500rpm,pH控制为6.0~7.5,培养时间为12~36h。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:培养温度为35~40℃;搅拌转速为200~400rpm;pH控制为6.5~7.2;培养时间为18~24h。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:发酵菌种子液的接种体积比为2%~20%。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:发酵菌种子液的接种体积比为10%~15%。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:发酵条件为:搅拌转速为100~500rpm,pH控制为6.0~7.5。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:搅拌转速为200~400rpm,pH控制为6.8~7.2。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述的微氧条件是在培养体系中不通空气或通空气量小于0.1VVM。
10. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的酵母菌菌液的制备具体是将活化的酵母菌接种至培养基中培养获得,培养温度为25~35℃,搅拌转速为100~500rpm, pH控制为6.0~7.5,培养时间为15~48h。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于:培养温度为28~32℃,搅拌转速为200~400rpm,pH控制为6.8~7.2。
12.根据权利要求1或10或11所述的方法,其特征在于:酵母菌菌液的加入体积比为2%~15%。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于:酵母菌菌液的加入体积比为2%~5%。
14.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的发酵调整期不进行甘油补加;发酵初期和发酵末期流加甘油使发酵体系中甘油浓度为20~40g/L。
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