CN108070622A - 一种生物发酵法制备1,3-丙二醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物发酵法制备1,3‑丙二醇，包括以下步骤：利用耐压型酵母菌以粗淀粉为原料在1号发酵罐中先好氧再厌氧进行发酵，得到甘油发酵液，将发酵液经过过滤，菌体回收进行下一轮发酵，滤液转入克雷伯氏肺炎杆菌的2号发酵罐中进行厌氧发酵，将发酵液进行絮凝、过滤、蒸发浓缩、减压蒸馏、脱色处理后得到成品1,3‑丙二醇。本发明的应用大大提高了我国生物发酵的技术水平，能够最大限度的利用原材料，有效降低了生产成本，提高了1,3‑丙二醇的生产产率，更适合工业化生产。

Description

一种生物发酵法制备1,3-丙二醇的方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别是提供了一种由粗淀粉生产1,3-丙二醇的方法。
背景技术
1,3-丙二醇是一种无色透明粘稠状液体，是一种重要的化工原料，它可以直接用于防冻剂，也可以是增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料，广泛用于食品、化妆品和制药等行业。1,3-丙二醇是具有双官能团的有机物，可以作为单体来生产聚酯、聚醚、聚氨酯等聚合物，市场空间巨大。特别是以1,3-丙二醇为单体与对苯二甲酸合成的聚酯（PTT）是一种优良的聚酯材料，具有许多优异的性质，如良好的弹性、耐污染性、着色性及抗静电和生物降解性等，非常适宜作为纤维和纺织的材料。
目前，1,3-丙二醇的生产方法主要有化学法和生物法。已经取得工业化生产的工艺路线有三种，即丙烯醛水合法、环氧乙烷法和微生物发酵法。化学合成法消耗了人类有限的不可再生资源，而且造成环境污染，与化学合成相比，微生物发酵法生产1,3-丙二醇具有生产条件温和、选择性号、副产物少、易于分离纯化、无环境污染等显著优点。生物合成法生产1,3-丙二醇是利用微生物歧化甘油产生。自然界中克雷伯氏肺炎杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌及弗氏柠檬酸菌具有较高的1,3-丙二醇转化率，具有很好的开发价值，微生物代谢甘油产1,3-丙二醇主要由二羟丙酮操纵子调控代谢路径分为氧化支路和还原支路两条分支。
目前微生物法生产1,3-丙二醇有以下几条途径：1、采用肠道细菌厌氧条件下将甘油歧化为1,3-丙二醇（USP5254467）。2、采用克雷伯氏肺炎杆菌在微氧条件下发酵产生1,3-丙二醇（王剑锋等，克雷伯氏菌微氧发酵生产1,3-丙二醇的研究，现代化工，2001,21（5）：28-31.）3、采用克雷伯氏肺炎杆菌在厌氧条件下发酵产1,3丙二醇和2,3-丁二醇（Biel etal. Fermentation of glycerol to 1,3-propanediol and 2,3-butanediol. ApplMicrobiol Biotechnol, 1998,50:23-29）。4、微生物两段发酵法生产1,3-丙二醇的方法（修志龙等，专利号：ZL0112=38769.6）。
以上方法中1、2采用甘油为底物进行发酵，且发酵液中1,3-丙二醇的浓度比较低，因此成本很高。方法3提出了同时发酵产生1,3丙二醇和2,3-丁二醇，但工艺限制发酵水平低。方法4提出两步法发酵由淀粉等原料生产1,3-丙二醇的方法，理论上可大大降低生产成本，但是由于工艺限制，该发明中最佳实施例给出的甘油浓度仅有49.9g/L，摩尔产率仅为39.1%，1,3-丙二醇的浓度也很低，仅为13.18g/L,摩尔产率仅为22.8%。
发明内容
本发明提供的是一种生物发酵生产1,3丙二醇的方法。由粗淀粉原料糖化液化后利用耐压性酵母菌先好氧再厌氧制备甘油发酵液，再利用克雷伯氏肺炎杆菌以甘油发酵液为底物生产1,3-丙二醇。一种生物发酵生产1,3丙二醇的方法，包含以下步骤：
A：以粗淀粉为原料，利用耐压型酵母菌在1号发酵罐中先好氧再厌氧进行发酵；
B：发酵液经过过滤装置后，滤液进入克雷伯氏肺炎杆菌2号发酵罐，耐压型酵母菌体返回1号发酵罐；
C：1号发酵罐补足原料、培养基，加入生长促进剂进行发酵，发酵完成后进行B、C操作；
D：2号发酵罐中加入少量葡萄糖、添加剂进行厌氧发酵；
E：2号发酵罐中的发酵液进行絮凝、过滤、蒸发浓缩、减压蒸馏、脱色处理后得到成品1,3-丙二醇。
进一步的，步骤A中粗淀粉的前处理34%-40%的淀粉乳，加入淀粉干重1.2‰的α-淀粉酶，要求液化DE值在15%-20%之间，过程pH控制在5.0-8.0，温度控制：糊化开始温度55-62℃，糊分完成温度68-72℃，液化温度不超过115℃。
进一步的，步骤A中好氧发酵控制温度：30-40℃ pH：4.0-5.0，当残糖降至3.5%-1.8%时，停止供氧，补充营养，当残糖降至0.8%-0.3%时止发酵。
进一步的，步骤B中的过滤装置安置在1号发酵罐与2号发酵罐的连接阀门处，过滤类型为减压抽滤。耐压型酵母菌发酵时加入生长促进剂黄芪提取物，可以显著增加活性菌的数量，缩短发酵时间，且以中药黄芪为原料，具无毒、无残留等特点。
进一步的，步骤C中加入的生长促进剂为原料为中药黄芪。包括以下含量：总糖含量>15%、皂苷含量>1.8%、总黄酮含量>7%、氨基酸含量>2.5%、叶酸含量>0.8%，水分<6.0%。
进一步的，步骤D中加入与发酵液体积比为100:1的葡萄糖溶液，所加入的添加剂为延胡索提取物与稀硝酸的混合物，两者用量的体积比为5-10:1.5-2，加入的总量占发酵液总体积的0.001-0.05%
进一步的，步骤E中使用壳聚糖作为发酵液的絮凝剂。采用减压浓缩，真空度为73.3kPa-79.98kPa，蒸发温度为65℃-70℃，浓缩至45-50%。减压蒸馏压力为81.7kPa，温度为130℃-158℃，最高不得高于170℃。加入食用级粉状活性炭，其用量丙二醇重的0.5%，搅拌1h-2h，同时加入少量的硅藻土作为助滤剂，过滤，除去活性炭，即得精制1,3-丙二醇。
同底物发酵是以利用其它可发酵的有机物为辅助底物，提高转化率。在以甘油为底物发酵中，通过掺加葡萄糖作为辅助底物可以提高1,3-丙二醇的转化率，同时缩短发酵时间。通过代谢及酶学分析发现，在甘油转化为1,3-丙二醇的厌氧代谢途径中，甘油沿着氧化和还原两条平行路径代谢。在氧化途径中甘油在依赖于NAD+的甘油脱氢酶的作用下形成二羟基丙酮，再在二羟基丙酮激酶的作用下，生成二羟基丙酮磷酸，然后进入糖酵解途径，为微生物生长提供ATP和NADH。在还原途径中，甘油在维生素B12为辅酶的甘油脱水酶的作用下生成3-HPA，然后在依赖于NADH的1,3-丙二醇氧化还原酶的作用下形成1,3-丙二醇。影响1,3-丙二醇合成有两方面的关键因素，一是改善甘油歧化的还原途径，二是改造甘油歧化的氧化途径。甘油脱氢酶、甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶的活性以及菌体内NADH含量或者NAD+/NADH的比例是影响1,3-丙二醇的因素。在发酵过程中加入延胡索提取液与稀硝酸的混合物，有效的提高1,3-丙二醇合成关键酶的活性。延胡索提取物与稀硝酸混合物的加入，在酶活力测定中，甘油脱水酶酶反应过程中产物量提高25%，1,3-丙二醇氧化还原酶酶反应过程中产物量提高39%。加入延胡索提取液与稀硝酸的混合物同时作为外源电子受体降低菌体内NAD+/NADH的比例，使得1,3丙二醇浓度以及生产强度显著提高。
有益效果
本发明采用可再生资源粗淀粉为原料，经耐压性酵母菌先好氧再厌氧发酵获得甘油发酵液，可最大限度的利用原料，通过加入生长促进剂，菌体回用高达15次以上，降低了生产成本。
本发明采用的延胡索提取物与稀硝酸混合使用，提高了菌体内1,3-丙二醇合成关键酶的活性，显著提高1,3-丙二醇的浓度和生产强度。
附图说明
1,3-丙二醇制备流程如图1。
具体实施方式
实施例1
设置A、B、C、D实施组
1、粗淀粉的液化糖化
淀粉500g，加水调成质量分数为36%的淀粉乳，加入0.6 g耐高温α-淀粉酶（5U/g）液化液DE值为18%。将液化后的溶液引入糖化锅，加入5 g的葡萄糖淀粉酶（200U/g），糖化终点以测得葡萄糖值为98%。
2、糖化液发酵产甘油
配置好料液（g/L）:尿素2.5，葡萄糖浓度315，含磷为80μg/mL的玉米浆3，黄芪提取物10（A 、C组不加入黄芪提取物，B、D组加入）。将连消后的50L培养基和经扩大培养的菌种引入经严格灭菌的1号发酵罐。通入无菌空气，进行好氧发酵。控制温度35℃、pH值4.5。当残糖降至2%，停止供氧，补充营养，使耐高渗压酵母菌开始后期的厌氧发酵，当残糖浓度降低到0.5%终止发酵。
3、发酵生产1,3-丙二醇
发酵液转移至2号发酵罐，补充500 ml葡萄糖溶液，加入25 ml延胡索提取物与稀硝酸的混合物（体积比为5:1.5，其中A、D组不加延胡索提取物与稀硝酸的混合物，B 、C组加入），经过厌氧发酵后收集发酵液，发酵液采用壳聚糖进行絮凝。对经絮凝后发酵液进行过滤，对滤液进行蒸发浓缩处理，一般采用减压浓缩，真空度为75.3kPa，蒸发温度为68℃，浓缩至45%。对丙二醇进行提取，蒸馏压力为81.7kPa，温度为140℃。加入为丙二醇重的0.5%的食用级粉状活性炭，搅拌1.5h，使活性炭尽可能吸附丙二醇中的杂质和色素。过滤，除去活性炭，即得精制丙二醇。
对上述实施例结果进行测定，如下：
由实施例可知，A组为不加黄芪提取物、不加延胡索提取物与稀硝酸的混合物组，从1,3-丙二醇的摩尔得率来看，均低于B、C、D组。B组为加黄芪提取物、延胡索提取物与稀硝酸的混合物组，1,3-丙二醇的摩尔得率高于A组、C组（不加入黄芪提取物）和D组（不加入延胡索提取物与稀硝酸的混合物），由此，本发明可以显著提高1,3-丙二醇的产率，降低生产成本，更适合工业生产。

Claims (7)

1.本发明提供一种生物发酵制备1,3-丙二醇的方法，包含以下步骤：
A：以粗淀粉为原料，利用耐压型酵母菌在1号发酵罐中先好氧再厌氧进行发酵；
B：发酵液经过过滤装置后，滤液进入克雷伯氏肺炎杆菌2号发酵罐，耐压型酵母菌体返回1号发酵罐；
C：1号发酵罐补足原料、培养基，加入生长促进剂进行发酵，发酵完成后进行B、C操作；
D：2号发酵罐中加入少量葡萄糖、添加剂进行厌氧发酵；
E：2号发酵罐中的发酵液进行絮凝、过滤、蒸发浓缩、减压蒸馏、脱色处理后得到成品1,3-丙二醇。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A中粗淀粉的前处理34%-40%的淀粉乳，加入淀粉干重1.2‰的α-淀粉酶，要求液化DE值在15%-20%之间，过程pH控制在5.0-8.0，温度控制：糊化开始温度55-62℃，糊分完成温度68-72℃，液化温度不超过115℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤A中好氧发酵控制温度：30-40℃pH：4.0-5.0，当残糖降至3.5%-1.8%时，停止供氧，补充营养，当残糖降至0.8%-0.3%时止发酵。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B中的过滤装置安置在1号发酵罐与2号发酵罐的连接阀门处，过滤类型为减压抽滤。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C中加入的生长促进剂为中药黄芪提取物，包括以下含量：总糖含量>15%、皂苷含量>1.8%、总黄酮含量>7%、氨基酸含量>2.5%、叶酸含量>0.8%，水分<6.0%。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤D中加入与发酵液体积比为100:1的葡萄糖溶液，所加入的添加剂为延胡索提取物与稀硝酸的混合物，两者用量的体积比为5-10:1.5-2，加入的总量占发酵液总体积的0.001-0.05%。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤E中使用壳聚糖作为发酵液的絮凝剂，采用减压浓缩，真空度为73.3kPa-79.98kPa，蒸发温度为65℃-70℃，浓缩至45-50%，减压蒸馏压力为81.7kPa，温度为130℃-158℃，最高不得高于170℃，加入食用级粉状活性炭，其用量甘油重的0.5%，搅拌1h-2h，同时加入少量的硅藻土作为助滤剂，过滤，除去活性炭，即得精制1,3-丙二醇。
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