CN115927516B - 一种基于尾气分析系统生物法生产腺苷蛋氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于腺苷蛋氨酸生产技术领域，具体涉及一种基于尾气分析系统生物法生产腺苷蛋氨酸的方法。该生产方法是基于发酵尾气分析系统，通过生理代谢参数RQ在细胞水平调控细胞代谢，促进S‑腺苷蛋氨酸产量的方法；具体方法是将酵母菌活化后，经种子培养基中培养、发酵培养基发酵，在发酵过程当发酵液DCW>80g/L时，添加粉末状L‑蛋氨酸，开始合成腺苷蛋氨酸；在发酵过程中尾气分析仪通过检测细胞CO2释放速率、O2摄取速率计算得到细胞实时呼吸熵RQ，并进一步通过RQ的变化反馈调控补料速度。该生产方法无需添加大量L‑蛋氨酸原料及发酵补加剂，生产的SAM产量高；克服了现有技术产物中含有大量副产物需再次提纯的不足；此外生产成本低，生产效益很高。
Description
技术领域
本发明属于腺苷蛋氨酸生产技术领域，具体为一种基于尾气分析系统生物法生产腺苷蛋氨酸的方法。
背景技术
S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine)，又称S-腺苷甲硫氨酸，简称为SAM，广泛存在于生物体细胞中，是参与生物体代谢的重要中间物质。SAM分子结构中含有一个活性甲基和一个高能硫原子，因此SAM具有转甲基、转氨丙基、转硫等重要生物活性，使其在医药和保健品领域有着广泛应用。SAM保肝护肝疗效显著，对抑郁症和关节炎也有不错疗效，市场前景开阔。
目前SAM的制备方法主要包括：化学合成法、酶促合成法和微生物发酵制备。其中由于化学合成产物中异构体多，分离提纯困难及SAM分子不稳定，所以工业前景不大。酶促合成法尽管产物SAM纯度高，但价格昂贵是制约其工业化的限制因素。微生物发酵制备SAM是目前工业制备SAM的主要方法，具有成本低，SAM产量和活性高的优点。
关于利用微生物发酵制备SAM主要是生物反应器水平的调控，通过增大L-蛋氨酸的添加量及优化培养基等方法来提高SAM的产量；目前的现有技术有通过向发酵培养过程中分批补加发酵补加剂：L-蛋氨酸、银耳多糖、叶酸和葛根素，促进氮源、碳源及磷元素的有效利用，提高SAM的产量；但存在以下局限性：通过加大L-蛋氨酸用量及添加发酵添加剂优化培养基等方法主要在生物反应器水平调控，一方面，大量L-蛋氨酸和添加物的使用增加了生产成本，同时为后期提取纯化带来不必要的困难；另一方面，无法从细胞水平调控代谢流的方向朝着有利于SAM合成的方向反应，以及促进培养基和L-蛋氨酸的有效利用。
在微生物发酵过程中，从微生物代谢角度了解细胞内部物质代谢流的情况，为整个发酵过程进行及时有效的工艺调控是十分重要的。因此，实时快速在线监测发酵过程是十分有必要的,它是将宏观代谢尺度与胞内微观代谢尺度相关联指导微生物发酵的重要纽带。因此，本发明想要通过尾气采集分析系统来生产SAM，利用该系统来监控发酵尾气中氮气、氧气和二氧化碳浓度，进而计算出氧气摄取速率(OUR)、CO2释放速率(CER)以及呼吸熵(RQ)来反映细胞呼吸代谢情况，其中RQ反映了菌体的生理代谢状态，揭示了发酵过程微观代谢途径通量的变化，是微生物菌体生长、能量代谢维持、产物和副产物合成代谢共同作用的结果。关于利用尾气采集分析系统生产SAM，未见有相关报道。
发明内容
针对现有技术中对L-蛋氨酸的依赖以及大量添加剂的使用导致的发酵过程原料不充分利用，代谢副产物积累、生产成本增加以及不精细细胞代谢调控的问题，本发明提供了一种基于发酵尾气分析系统生产S-腺苷蛋氨酸的方法。该方法通过实时监测发酵过程代谢尾气分析细胞代谢状况，根据呼吸熵(RQ)变化从而调控发酵过程补料速度，实现调控细胞代谢流朝着有利于腺苷蛋氨酸合成的方向进行，从而降低代谢副产物乙醇等积累，提高原料利用，增加腺苷蛋氨酸(SAM)的产量。
本发明具体的技术方案如下：
基于尾气分析系统生物法生产腺苷蛋氨酸的方法，该生产方法是一种基于发酵尾气分析系统，通过生理代谢参数RQ在细胞水平调控细胞体内代谢通路方向，促进S-腺苷蛋氨酸生产的方法。
一种基于尾气分析系统生物法生产腺苷蛋氨酸的方法，具体包括如下步骤：
(1)将微生物菌活化后，接种于种子培养基中，在27-35℃、150-450rpm条件下培养12-20h；
(2)将种子菌液接种于发酵培养基中，当发酵液DCW>80g/L时，添加粉末状L-蛋氨酸，开始合成腺苷蛋氨酸；
(3)发酵过程通过尾气分析仪，分析细胞代谢活性，根据RQ值调控补料速度；
(4)培养至腺苷蛋氨酸产量最大后停止发酵。
优选的，步骤(1)中，所述的微生物菌为工业酿酒酵母菌，接种量是种子培养基体积的3-7％；在30℃、200rpm条件下培养16h。
这是因为本发明人在实验过程中发现，当以工业酿酒酵母菌作为微生物发酵菌参与到生产S-腺苷蛋氨酸过程中时，较其它发酵菌来说，生产的S-腺苷蛋氨酸的含量更高；同时能极大地提高S-腺苷蛋氨酸得转化率；关于其具体的作用机理，本发明人尚未作出进一步研究。
优选的，步骤(1)中，种子培养基包括：葡萄糖15-25g/L、酵母浸粉3-7g/L、蛋白胨5-15g/L、K2HPO4 2-6g/L、KH2PO4 0.05-0.2g/L和余量水。
优选的，步骤(2)中，种子菌液接种量为发酵培养基体积的2-8％，L-蛋氨酸的添加量为发酵液的1-3％，w/v。
腺苷蛋氨酸作为次级代谢产物，当发酵液DCW>80g/L时，菌体生长进入对数生长期后期，此时，菌体浓度高，代谢稳定更有利于腺苷蛋氨酸的生产。
优选的，步骤(2)中，所述的发酵培养基包括：葡萄糖6-15g/L、酵母浸粉2-7g/L、(NH4)2SO4 4-6g/L、K2HPO4 0.5-5g/L、MnSO4 0.05-2g/L、ZnSO40.3-0.7g/L、MgSO4 0.5-3g/L、FeSO4 0.45-0.65g/L、CaCl2 0.2-0.8g/L、柠檬酸钠0.2-1.5g/L和余量水。
优选的，步骤(2)中，发酵培养条件为：初始搅拌速度为100-400rpm、27-35℃、通风0.5-1.5vvm、罐压0.02-0.1Mpa、氨水调控pH4.5-5.5；溶氧调控15-25％，当发酵培养基中葡萄糖耗尽且中间代谢物乙醇浓度低于2g/L时，开始流加45-55％葡萄糖补料，发酵过程调控乙醇浓度等于或低于2g/L；当发酵菌液DCW＞80g/L时，添加粉末状L-蛋氨酸。
优选的，步骤(3)中，所述尾气分析仪是通过检测细胞CO2释放速率(CER)、O2摄取速率(OUR)计算得到细胞实时呼吸熵(RQ)，并进一步通过RQ的变化反馈调控补料速度。
优选的，步骤(3)中，使用高效液相色谱仪对腺苷蛋氨酸产量进行检测。
通过本发明上述技术方案生产S-腺苷蛋氨酸，克服了现有技术中存在的保证SAM产量的同时却会伴随高成本、副产物积累，无法做到两者兼顾的问题。
本发明的有益效果在于：
1.实时检测菌体代谢活性：在细胞水平调控细胞体内代谢通路方向，减少代谢中间产物的积累，从而提高产物产量，减少生产成本；
基于尾气分析系统，通过实时RQ反馈调控补料发酵，可在不增加蛋氨酸得用量以及额外添加添加剂得情况下，从细胞水平调控代谢路径更多的流向产物合成，减少代谢中间产物的积累，提高产物产量；
2.该生产方法无需添加大量L-蛋氨酸原料及发酵补加剂，生产的SAM产量高、纯度高，产量能够达到14.67g/L，同时还提高了蛋氨酸的转化率，转化率能够达到49.51％，使得原材料利用率提高，降低生产成本；克服了现有技术产物中含有大量副产物需再次提纯的不足；
3.该生物法生产腺苷蛋氨酸的工艺，通过发酵过程尾气分析，以细胞实时代谢参数为依据，在细胞水平调控发酵过程，使得酵母细胞代谢过程中的碳通量更多流向腺苷蛋氨酸合成代谢通路，减少细胞代谢中间产物如乙醇的积累，提高了原料的利用效率以及腺苷蛋氨酸的产量，从而减少了对大量蛋氨酸的依赖和添加剂的大量使用，节约了生产成本，生产效益很高。
附图说明
图1是实施例与对比例腺苷蛋氨酸产量(a)、酵母菌生物量(b)和发酵过程乙醇浓度(c)。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1
(1)将工艺酿酒酵母菌活化后，以种子培养基体积计，接种5％工艺酿酒酵母菌于种子培养基中，置于摇床30℃、200rpm条件下培养16h；
所述种子培养基包括：葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、K2HPO4 4g/L、KH2PO4 0.1g/L和余量水，获得种子菌液；
(2)以发酵培养基体积计，将种子菌液按5％接种量接种于20L发酵培养基中，发酵条件为：初始搅拌速度为200rpm、30℃、通风1vvm、罐压0.05Mpa、氨水调控pH 5.0；溶氧调控20％，当发酵培养基中葡萄糖耗尽，中间代谢物乙醇浓度低于2g/L时，开始流加50％葡萄糖补料，发酵过程调控乙醇浓度等于或低于2g/L；当发酵菌液DCW＞80g/L时，开始添加50g粉末状L-蛋氨酸，每隔2h添加一次，共添加8次，开始合成腺苷蛋氨酸；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、(NH4)2SO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、MnSO4 0.1g/L、ZnSO4 0.5g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.55g/L、CaCl2 0.5g/L、柠檬酸钠1g/L和余量水。
(3)发酵过程使用尾气分析仪，对发酵过程中细胞的实时代谢情况进行分析，通过实时监测OUR、CER和RQ的变化，反馈调控发酵过程中的补料速度，避免细胞代谢中间产物乙醇的积累，导致代谢通路发生变化，致使腺苷蛋氨酸的合成受影响；
酵母细胞实时代谢RQ的确定：理论上以葡萄糖作为碳源发酵时，当RQ为1.0时，细胞内葡萄糖完全通过TCA循环代谢为CO2和水；当RQ在0.4-0.6之间时，意味着由于碳源缺乏，细胞利用氧化度低的碳源如乙醇、甘油代谢；当RQ大于1.0时，表明细胞处于厌氧状态，以厌氧发酵为主，不能充分来利用葡萄糖，发生溢流代谢现象，产生大量副产物如乙醇的积累等。根据腺苷蛋氨酸的代谢途径，主要考虑到细胞生长、菌体维持以及产物合成，从化学反应方程式来看，由葡萄糖合成腺苷蛋氨酸的理论RQ值为0.93。
但是本发明人在实际生产过程中根据腺苷蛋氨酸产量结果，最终将补料阶段的RQ值确定为0.9；
具体是因为考虑到实际生产中的不完全氧化以及其他碳源的利用，在实际生产中的RQ值可能会与理论值有出入，本发明人将补料阶段的RQ值分别设定为0.7、0.9和1.1三个值，分别进行补料发酵调控，从而确定最优RQ值；结果由表1可知，当RQ值为0.9时，菌体干重达到119.02g/L，腺苷蛋氨酸产量达到14.67g/L；而当RQ为1.1时，菌体干重为108.72g/L，腺苷蛋氨酸为12.91g/L，结果表明维持高RQ值时，发酵过程处于厌氧发酵阶段，细胞内代谢通路发生改变，导致细胞代谢副产物乙醇出现积累，从而对细胞生长和腺苷蛋氨酸的生产起到抑制作用；而RQ值为0.7时，酵母细胞菌体干重最低，同时腺苷蛋氨酸的产量也最低，可能是由于细胞由好氧发酵转为好氧厌氧混合发酵导致葡萄糖不完全代谢，乙醇积累。
因此，不同RQ值对发酵影响不同，根据实验结果，我们最终确定最优RQ值为0.9。
(4)添加蛋氨酸后，每隔2h，使用高效液相色谱仪测试发酵液中的腺苷蛋氨酸的浓度，当达到最大产量后，停止发酵。
实施例2
(1)将工艺酿酒酵母菌活化后，以种子培养基体积计，接种7％工业酿酒酵母于种子培养基中，置于摇床30℃、200rpm条件下培养16h，获得种子菌液；
所述种子培养基包括：葡萄糖20g/L、酵母浸粉7g/L、蛋白胨10g/L、K2HPO4 4.5g/L、KH2PO4 0.1g/L和余量水；
(2)以发酵培养基体积计，将种子菌液按5％接种量接种于20L发酵培养基中，发酵条件为：初始搅拌速度为200rpm、30℃、通风1vvm、罐压0.05Mpa、氨水调控pH 5.0；溶氧调控18％，当发酵培养基中葡萄糖耗尽，中间代谢物乙醇浓度低于2g/L时，开始流加45％葡萄糖补料，发酵过程调控乙醇浓度等于或低于2g/L；当发酵菌液DCW＞80g/L时，开始添加60g粉末状L-蛋氨酸，每隔2h添加一次，共添加8次，开始合成腺苷蛋氨酸；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖10g/L、酵母浸粉5g/L、(NH4)2SO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、MnSO4 0.1g/L、ZnSO4 0.5g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.55g/L、CaCl2 0.5g/L、柠檬酸钠1g/L和余量水。
(3)发酵过程使用尾气分析仪，对发酵过程中细胞的实时代谢情况进行分析，通过实时监测OUR、CER和RQ的变化，反馈调控发酵过程中的补料速度，避免细胞代谢中间产物乙醇的积累，导致代谢通路发生变化，致使腺苷蛋氨酸的合成受影响；
(4)添加蛋氨酸后，每隔2h，使用高效液相色谱仪测试发酵液中的腺苷蛋氨酸的浓度，当达到最大产量后，停止发酵。
实施例3
(1)将工艺酿酒酵母菌活化后，以种子培养基体积计，接种5％工业酿酒酵母于种子培养基中，置于摇床28℃、200rpm条件下培养18h，获得种子菌液；
所述种子培养基包括：葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、蛋白胨10g/L、K2HPO4 4g/L、KH2PO4 0.1g/L和余量水；
(2)以发酵培养基体积计，将种子菌液按5％接种量接种于20L发酵培养基中，发酵条件为：初始搅拌速度为200rpm、30℃、通风1vvm、罐压0.05Mpa、氨水调控pH 5.0；溶氧调控20％，当发酵培养基中葡萄糖耗尽，中间代谢物乙醇浓度低于2g/L时，开始流加52％葡萄糖补料，发酵过程调控乙醇浓度等于或低于2g/L；当发酵菌液DCW＞80g/L时，开始添加50g粉末状L-蛋氨酸，每隔2h添加一次，共添加8次，开始合成腺苷蛋氨酸；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖12g/L、酵母浸粉5g/L、(NH4)2SO4 5g/L、K2HPO4 2g/L、MnSO4 0.1g/L、ZnSO4 0.5g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.55g/L、CaCl2 0.5g/L、柠檬酸钠1.2g/L和余量水；
(3)发酵过程使用尾气分析仪，对发酵过程中细胞的实时代谢情况进行分析，通过实时监测OUR、CER和RQ的变化，反馈调控发酵过程中的补料速度，避免细胞代谢中间产物乙醇的积累，导致代谢通路发生变化，致使腺苷蛋氨酸的合成受影响；
(4)添加蛋氨酸后，每隔2h，使用高效液相色谱仪测试发酵液中的腺苷蛋氨酸的浓度，当达到最大产量后，停止发酵。
对比例1
该对比例与实施例的区别在于，发酵补料阶段，主要通过离线检测发酵液中的代谢中间产物乙醇的浓度来反馈调控补料速度，调控发酵过程乙醇浓度低于2g/L，其余与实施例1相同。
对比例2
该对比例与实施例的区别在于，采用植物乳杆菌作为微生物发酵菌，其余与实施例1相同。
对比例3
该对比例与实施例的区别在于，采用嗜酸乳杆菌作为微生物发酵菌，其余与实施例1相同。
实验例1腺苷蛋氨酸产量、生物量以及乙醇浓度检测
在发酵过程中对实施例以及对比例中腺苷蛋氨酸产量、酵母菌生物量(菌体干重)以及发酵过程乙醇浓度进行检测，结果见表1-3、图1。
表1补料分批发酵中不同RQ值对酵母菌体生长和腺苷蛋氨酸产量的影响
表2实施例1与对比例1中腺苷蛋氨酸产量
由表2、3和图1可知，实施例1中根据RQ变化反馈调控补料发酵时腺苷蛋氨酸得产量最大为14.67g/L，蛋氨酸的转化率达到了49.51％，与对比例1中乙醇反馈调控补料调控相比，单位提高了20.8％，蛋氨酸的转化率提高了20.84％。同时实施例1中的酵母菌细胞干重相比对比例1中增加了近12％。此外，实施例1中通过RQ反馈调控补料，使得发酵过程中尤其是添加蛋氨酸后，代谢中间产物乙醇浓度始终处于较低水平。以上表明，RQ反馈调控可使的发酵过程中的碳通量更平稳的流向腺苷蛋氨酸合成代谢通路，从而减少代谢中间产物如乙醇的产生积累，提高了蛋氨酸的转化率。而对比例1，在添加4-5次蛋氨酸后，乙醇浓度有明显的升高，影响腺苷蛋氨酸代谢通路，导致产物产量受到影响。因此，基于尾气分析系统，通过实时RQ反馈调控补料发酵，可在不增加蛋氨酸得用量以及额外添加添加剂得情况下，从细胞水平调控代谢路径更多的流向产物合成，提高原料利用率，提高产物产量。
表3最终产物S-腺苷蛋氨酸产量和蛋氨酸转化率
| 项目 | 产量(g/L) | 蛋氨酸转化率％ |
| 实施例1 | 14.67 | 49.51 |
| 实施例2 | 14.06 | 47.45 |
| 实施例3 | 14.42 | 48.67 |
| 对比例1 | 12.14 | 40.97 |
| 对比例2 | 5.62 | 19.00 |
| 对比例3 | 3.40 | 11.47 |
通过表3可知，不同菌种用于腺苷蛋氨酸发酵所产生的腺苷蛋氨酸产量不同。工业酿酒酵母(实施例1、2、3)发酵时，腺苷蛋氨酸平均产量为14.38g/L，而植物乳杆菌(对比例2)和嗜酸乳杆菌(对比例3)发酵时，腺苷蛋氨酸的产量分别仅为5.62g/L和3.40g/L。此外，工业酿酒酵母作为生产菌种用于腺苷蛋氨酸发酵时，蛋氨酸的转化率最高达到49.51％(实施例1)，远远大于另外两个菌种。所以，选择工业酿酒酵母用于腺苷蛋氨酸的生产不仅提高了产量，同时还提高了蛋氨酸的转化率，使得原材料利用率提高，降低生产成本。
Claims (1)
1.一种基于尾气分析系统生物法生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，所述的方法是基于发酵尾气分析系统，通过生理代谢参数RQ在细胞水平调控细胞体内代谢通路方向，促进S-腺苷蛋氨酸生产的方法；
（1）将工艺酿酒酵母菌活化后，以种子培养基体积计，接种5%工艺酿酒酵母菌于种子培养基中，置于摇床30℃、200 rpm条件下培养16 h；
所述种子培养基包括：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、K2HPO4 4 g/L、KH2PO4 0.1 g/L和余量水，获得种子菌液；
（2）以发酵培养基体积计，将种子菌液按5%接种量接种于20 L发酵培养基中，发酵条件为：初始搅拌速度为200 rpm、30℃、通风1 vvm、罐压0.05 Mpa、氨水调控pH 5.0；溶氧调控20%，当发酵培养基中葡萄糖耗尽，中间代谢物乙醇浓度低于2 g/L时，开始流加50%葡萄糖补料，发酵过程调控乙醇浓度等于或低于2 g/L；当发酵菌液DCW＞80 g/L时，开始添加50 g粉末状L-蛋氨酸，每隔2 h添加一次，共添加8次，开始合成腺苷蛋氨酸；
所述的发酵培养基包括：葡萄糖10 g/L、酵母浸粉5 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L、K2HPO4 2 g/L、MnSO4 0.1 g/L、ZnSO4 0.5 g/L、MgSO4 1.5 g/L、 FeSO4 0.55 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸钠1 g/L和余量水；
（3）发酵过程使用尾气分析仪，对发酵过程中细胞的实时代谢情况进行分析，通过实时监测CO2释放速率、O2摄取速率计算细胞实时呼吸熵RQ，并根据RQ的变化，反馈调控发酵过程中的补料速度，其中，补料阶段的RQ值为0.9；
（4）添加蛋氨酸后，每隔2 h，使用高效液相色谱仪测试发酵液中的腺苷蛋氨酸的浓度，当达到最大产量后，停止发酵。
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