CN103352058B - 一种从L-谷氨酸钠制备α-酮戊二酸的生物催化方法 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了一种从L‑谷氨酸钠制备α‑酮戊二酸的生物催化方法，属于生物技术领域。本发明通过利用产L‑氨基酸氧化酶的菌株(Rhodococcus opacus)，在发酵48h后，收集菌体，取12g/L(以干重计算)菌体加入到含有10g/L的L‑谷氨酸钠转化液中，在温度为35℃、pH8.4条件下转化10h后，每隔6h向反应体系中加入4.3g/L的L‑谷氨酸钠，连续转化24h，最终α‑酮戊二酸的产量达到了16.8g/L，转化率高达90％以上。

Description

一种从L-谷氨酸钠制备α-酮戊二酸的生物催化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微生物催化生产α-酮戊二酸的新工艺。具体来说，本发明涉及一株产L-氨基酸氧化酶菌株(Rhodococcus opacus)催化L-谷氨酸钠为α-酮戊二酸的新方法，其特征是高效，经济，环保，低能耗。

背景技术

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，又称α-胶酮酸，2-氧代戊二酸或α-羰基戊二酸，分子式为C₅H₆O₅，相对分子量为146.1，α-酮戊二酸为白色或类白色结晶或结晶性粉末，无色，易溶于水，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，是三羧酸循环(TCA)的重要中间产物之一，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢。α-酮戊二酸在各个领域有着重要的应用前景，作为一种营养强化剂，广泛应用于食品、医药、有机合成、化妆品和饲料等工业中。

微生物催化是通过微生物细胞或酶将复杂的底物进行结构修饰，本质就是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶将一种物质(底物)转化成另一种物质(产物)的过程。微生物催化法具有如下几点优势：(1)环境友好型。由于酶催化反应条件比较温和，通常在常温、常压、pH值近中性的条件下进行，可减少或避免强酸、强碱或有毒物质的使用，从而减轻对环境的污染。(2)转化率高。通过对用于某一转化的微生物进行菌种选育和转化条件的优化，可以得到极高的转化率。(3)微生物生物量积累快，产生的酶量也相应多，转化时间短，能够提高生产效率。(4)集团专一性强，不需要对集团进行保护，所形成的副产物少，手性和旋光性好。(5)用于催化的酶和细胞在合适条件下可以反复多次利用，并且保持催化活力不衰退。

L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一种黄素蛋白酶，能立体特异性催化L-氨基酸氧化脱氨，生成相应的α-酮酸、氨和H₂O₂，并伴随着氧气的消耗。该酶最早发现于蛇毒中，随后很长一段时间人们才发现来自微生物中的LAAO，1993年，Oliver VALLON等研究了Chlamydomonas reinhardtii在形成配子过程中过量积累LAAO，并且对酶的理化特性进行了研究，该酶对L-谷氨酸的酶活力为6.0nmol H₂O₂/h·ug protein。1994年，Stumpf等第一次报道来自细菌的LAAO，之后越来越多细菌LAAO被发现。2002年，Birgit等发现一株新的产LAAO的菌株(Rhodococcus opacus DSM43250)，发现该酶为严格的胞内酶，并且对该酶进行了纯化和理化特性的测定，发现该酶具有广泛的底物特异性，对L-谷氨酸的底物亲和力为0.411mmol，最大反应速率为2.32U/mg。

由于α-酮戊二酸应用范围不断扩大，市场需求也在不断增长。直至现在国内工业化生产α-酮戊二酸主要采用的是有机合成法，该方法涉及一系列复杂的化学反应过程，但存在很多问题，例如原料来源、环境污染等方面一系列问题。所以开发一种高效、环保、经济、节约的生产方法来代替化学合成法已迫在眉睫。近年来，越来越多的人将目光转向微生物，虽然做了大量的工作与努力，然而多数研究成果只限于实验室研究，很难扩大到工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效，经济，环保，低能耗的手段来生产α-酮戊二酸。利用LAAO一步催化L-谷氨酸钠生成α-酮戊二酸，所用原料为价格便宜的L-谷氨酸钠，达到低投资高收益的目的。此外该发明的优点之一是利用产LAAO的静息细胞来直接转化，从而降低了制备纯酶的资金投入；此外，利用此发明来生产α-酮戊二酸，后提取过程简单，减少了下游操作的费用，达到经济节约的目的；再次，就是利用此发明进行转化时该静息细胞性能稳定可以进行连续或多次转化，从而达到高效的目的。

本发明采用了以下技术方案：

1、通过单因素实验与正交实验确定了有利于Rhodococcus opacus产酶的最适培养基及培养条件

本发明通过对培养基的碳源、氮源、无机盐、及诱导物等营养条件进行了优化，确定了最适碳源为麦芽糖15g/L，最适氮源为混合氮源(酵母浸膏∶大豆蛋白胨为20∶3)4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，七水硫酸镁0.05g/L，L-丙氨酸0.5g/L；并确定了有利于菌体产酶的最适培养条件为初始pH7.68、温度30℃、转速200r/m。在此优化的培养基条件下，最有利于菌体产酶，发酵32h时达到最大酶活0.22U/mL，因而获得了较高的转化能力。用4g/L的菌体加入到含10g/L的L-谷氨酸钠的转化液(含10％异丙醇的磷酸钾盐缓冲液pH8.0)中，转化12h，α-酮戊二酸的产量达到了4.9g/L。

2、通过单因素实验确定了菌体的最优转化条件

本发明对菌体的转化条件如pH、温度、底物浓度、菌体浓度等进行了最优选择。确定了最适pH为8.4，转化12h后α-酮戊二酸产量达到了5.1g/L；在最适转化温度35℃条件下时，转化12h后α-酮戊二酸产量达到了5.3g/L；确定了最适底物浓度为10g/L、最适菌体浓度为12g/L，在此条件下转化6h后α-酮戊二酸最高产量达到了6.3g/L。

3、本发明研究了菌体的补料连续转化来解决高浓度底物抑制菌体转化的影响，具体操作为：第一步，向含有10g/L的L-谷氨酸钠的转化液中加入12g/L菌体；第二步，转化10h后，每隔6h向反应体系中加入4.3g/L的L-谷氨酸钠，连续转化了24h，最终α-酮戊二酸的产量达到了16.8g/L，转化率高达90％以上。

附图说明

附图1为该发明的整个操作流程图

附图2为LAAO催化L-谷氨酸为α-酮戊二酸的反应原理

附图3为单因素实验确定最适碳源(麦芽糖)浓度

附图4为最佳培养基和培养条件下，菌体的生长和产酶过程曲线。

附图5为单因素实验确定最适菌体浓度对转化的影响

具体实施方式

实施例1、利用单因素实验来确定麦芽糖的最适浓度。

在确定了最适碳源为麦芽糖之后，选择了5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L的浓度梯度，研究了麦芽糖浓度对菌体生长及转化能力的影响。菌体摇瓶培养48h后，取30ml发酵液于50ml离心管中于8000rpm下离心5min，弃上清，用30ml转化液重悬菌体并倒入摇瓶中，于30℃、200r/m条件下转化24h每隔6h取样用HPLC测定α-KG的产量。

实施例2、在最佳培养基和培养条件下，测定菌体的生长和产酶情况。

为了进一步提高菌体的转化能力，研究了在最优营养条件和培养条件菌体的生长特性和产酶特性。选择了9个摇瓶(规格为500L)分成三组，每个摇瓶装液量为50ml，并接入5ml的种子液，于200r/m、30℃下培养48h，每隔几个小时取样并测定数据。

实施例3、不同菌体浓度对转化的影响

由于菌体转化性能比较稳定，设置了2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、12g/L的菌体浓度(干重)来研究菌体浓度对转化速率和α-KG产量的影响。分别量取发酵48h后的发酵液(细胞浓度为4g/L)15ml、30ml、45ml、60ml、90ml于8000rpm下离心5min，并用30ml转化液重悬细胞后倒入摇瓶中于30℃、200rpm条件下转化6h，6h后取样用HPLC测定α-KG的产量。

Claims (2)

1.一种从L-谷氨酸钠制备α-酮戊二酸的生物催化方法，其特征在于，用培养基培养Rhodococcus opacus并离心获取菌体，并在适当的条件下将L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸，具体条件为：

(1)培养基：麦芽糖8-15g/L、麦芽浸膏5-10g/L、酵母浸膏4-8g/L、磷酸氢二钾0.1-0.5g/L、七水硫酸镁0.03-0.05g/L、L-丙氨酸0.5-1g/L；

(2)培养条件：初始pH 7.2-8.0、培养温度30-37℃、转速200rpm/min、发酵时间控制在30-48h；

(3)转化条件：pH控制在7.5-8.5；温度控制在30-45℃；菌体量控制在8-15g/L；初始L-谷氨酸钠浓度控制在5-15g/L；转化时间控制在6-48h。

2.根据权利要求1所述的生物催化方法，其特征在于，转化条件进一步包括：利用产L-氨基酸氧化酶菌株的完整细胞进行补料连续转化。