CN101230373B

CN101230373B - 一种s-腺苷蛋氨酸的制备方法

Info

Publication number: CN101230373B
Application number: CN2008100202154A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 周雪文; 张磊; 柏建新; 李振江; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2028-02-27
Also published as: CN101230373A

Abstract

本发明公开了一种S-腺苷蛋氨酸的制备方法，以多羟基有机试剂保护酶的活性，以腺苷三磷酸前体、L-蛋氨酸和磷酸根离子为底物，以葡萄糖或/和麦芽糖为能量供体，加入金属离子的组合物，利用有透性的生产菌株全细胞催化生产S-腺苷蛋氨酸。本发明使用金属离子的组合物调控代谢流量从而提高能量自偶联效率，加入有机试剂对菌体和酶的活性进行保护，利用有透性的生产菌株来制备S-腺苷蛋氨酸，缩短了合成时间，并使得产物积累到胞外，从而可以节省后续分离的成本和简化操作步骤。

Description

一种S-腺苷蛋氨酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种S-腺苷蛋氨酸(SAM)的制备方法，更具体地，特别涉及一种采用偶联酶促转化法制备S-腺苷蛋氨酸的方法。

背景技术

众所周知，S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)是广泛存在于动物、植物和微生物体内的重要代谢中间物质，也是人体内一种重要的生理活性物质，在体内主要起着转甲基、转硫和转氨丙基的作用，对关节炎、抑郁症、肝功能紊乱、胰腺炎等均有较好的疗效。SAM还是预防癌症，心血管疾病和抗衰老的高级保健药物。1999年，美国FDA批准SAM作为保健品上市，迅速在美国成为最畅销的营养品之一。随着人们的生活质量的提高，健康概念的更新，对SAM的需求也将会越来越多。

SAM的制备方法主要有化学合成法、发酵法、酶促转化法3种。发酵法是在含有C、N源的基本培养基上添加前体L-蛋氨酸，通过培养微生物细胞可以获得大量的SAM。这是目前工业生产SAM的主要途径。其中用来发酵的微生物可以由筛选或重组构建的方法得到，这在国内外有很多文章和专利的记载。Shiozaki通过筛选300多株不同的菌株，分离到一株Saccharomyces sake k-6菌，该菌在10L发酵罐中培养7天后的SAM产量达10.8g/L[Shiozaki S et al.，Agric Biol Chem，1984，48(9)：2293-2300；Shiozaki S etal.，Jour nal of Biotechnology，1986，4：345-354]。海南国栋药物研究所有限公司构建了一株含有两个表达载体的SAM高产菌株，1000L发酵罐中S-腺苷蛋氨酸产量达14-16g/L发酵液[海南国栋药物研究所有限公司，含两个表达载体的腺苷甲硫氨酸高产菌株及腺苷甲硫氨酸生产方法[P]，中国：CN 1824768A，2006.8.30]。发酵法可以实现较高的SAM产量，但是该方法存在着一定的缺陷：发酵的周期过长，且发酵结束以后需将SAM从胞内抽提出来，过程较为繁琐，且易引入胞内的其他杂质，加大了后续分离过程的难度。酶促转化法是利用哺乳动物或微生物(酵母、大肠杆菌)来源的SAM合成酶[EC2.5.1.6]催化腺苷三磷酸(ATP)和L-蛋氨酸(L-Met)来合成SAM。由于其反应产物纯度高、分离提纯容易、反应周期短、无污染等特点越来越受到研究者的关注。但是添加外源ATP代价高昂以及生物细胞中SAM合成酶含量较低、分离纯化困难等原因，成为酶法大规模生产SAM的限制因素。上海国佳生化工程技术研究中心有限公司利用ATP生产菌株生产得到含ATP的反应液，然后在此反应液中加入L-蛋氨酸和经提纯的SAM合成酶的方法转化生产SAM。该方法需要分别合成ATP及从产SAM合成酶的菌株中提取大量的SAM合成酶以达到合成SAM的需要，操作比较繁杂[上海国佳生化工程技术研究中心有限公司，一种新的腺苷甲硫氨酸的体外酶促转化方法[P]，中国：CN 1850980A，2006.10.25]。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可降低成本且操作方便的S-腺苷蛋氨酸的制备方法。

本发明的思路是：ATP既是SAM合成的前体之一，又为SAM的合成提供了所需要的大量能量，在外加L-蛋氨酸的前提下，SAM合成酶的活性和ATP的供给将影响SAM胞内合成的速率和产率。发酵法仅仅利用葡萄糖的代谢途径，供给ATP的效率不高，而以腺苷三磷酸(ATP)或其前体为底物，在磷酸化激酶(或磷酸转移酶)的催化下可以获得高的ATP产率。而微生物细胞中同时存在着能将腺苷通过底物磷酸化为ATP的酶系和利用ATP与外加L-蛋氨酸生成S-腺苷蛋氨酸的酶系。因此可将同一菌株内的ATP底物磷酸化合成酶系和SAM合成酶相偶联，实现高效的ATP原位再生和能量自偶联，以期望得到较高的SAM产率从而简化生产操作步骤，并降低生产成本。针对酶促反应中酶的活性容易受到损伤的缺陷，可加入多羟基的有机试剂来保护酶的活性。由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，因此用微生物细胞直接作为酶源进行酶催化反应，能够迅速有效地完成多步酶催化反应，并且可以省去将酶从微生物细胞中提取出来的步骤。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种S-腺苷蛋氨酸的制备方法，以多羟基有机试剂组合物保护酶的活性，以腺苷三磷酸前体、L-蛋氨酸和磷酸根离子为底物，以葡萄糖或/和麦芽糖为能量供体，加入金属离子的组合物，利用有透性的生产菌株全细胞催化生产S-腺苷蛋氨酸。

其中，所述的多羟基有机试剂组合物为甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨醇、乙二醇或甘油中的一种或几种，使用总量为40～100mM。

其中，底物中，腺苷三磷酸(ATP)前体为腺苷(AR)或腺苷一磷酸(AMP)，起始反应量为10～100mM，优选20～60mM；L-蛋氨酸的起始反应量为10～100mM，优选20～80mM；磷酸根离子的起始反应浓度为0.01～0.5M，优选0.02～0.3M。

其中，能量供体的起始反应总浓度为0.1～0.5M。

其中，所述的金属离子组合物为镁离子、钾离子和铵离子的组合物；其中Mg²⁺起始反应浓度为5～500mM，优选100～350mM；K⁺起始反应浓度为0.01～0.5M，优选0.02～0.4M；NH₄ ⁺起始反应浓度为1～50mM，优选2～20mM。

其中，所述的生产菌株选自：酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、酒香酵母属或产氨短杆菌属；优选属于酵母属的微生物酿酒酵母、面包酵母等，属于假丝酵母属的微生物近平滑假丝酵母，属于毕赤酵母属的奥默列氏毕赤酵母，属于球拟酵母属的微生物白色球拟酵母，属于德巴利酵母属的类球形德巴利酵母，属于酒香酵母属的异酒香酵母等。

生产菌株的使用量为按湿菌体100～800g/L，优选200～600g/L，即对于总体积为1L的反应液，需加入100～800g湿菌体，优选加入200～600g湿菌体。

其中，有透性的生产菌株，是指通过化学、物理或生物方法处理细胞从而得到细胞膜的通透性改变的生产菌株，具体方法为表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。

表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通X-100，阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物，或阴离子表面活性剂月桂酰·肌氨酸盐，表面活性剂使用量为0.1～50g/L，优选1～20g/L，即表面活性剂法处理生产菌株时，将表面活性剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～50g，优选加入1～20g。

有机溶剂法中使用的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，有机溶剂浓度为0.1～50mL/L，优选以1～20mL/L，即有机溶剂法处理生产菌株时，将有机溶剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～50mL，优选加入1～20mL。

其它处理细胞透性的方法，如冻融法、超声波处理法、风干法等，采用先将菌株细胞处理后，再将处理好的菌株加入反应液的方式。

其中，上述生产菌株的利用形式是生产菌株细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干菌株或废酵母泥。

S-腺苷蛋氨酸的生成反应在水溶液中进行，在pH 6～8，28～38℃条件下反应2～20小时。

本发明的主要代谢途径如附图1所示。

本发明的有益效果如下：

1、本发明直接偶联微生物体内的EMP途径酶系、ATP合成酶系(核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶)和S-腺苷蛋氨酸合成酶系(S-腺苷蛋氨酸合成酶)进行催化反应，实现产ATP和产SAM过程的偶联，从而避免了传统的酶促转化法需要添加外源的ATP及将SAM合成酶从微生物中提取出来的缺陷，可以降低成本和简化操作。

2、大量的研究经验发现多羟基有机试剂的加入可以提高酶的化学势能，从而需要更多的自由能才能破坏酶的结构，这从另一方面来讲使得酶的构象更为稳定，保护了酶的活性。

3、本发明是建立在全细胞催化的基础上的，其特点在于克服了发酵法底物转化率不高、难于实现能量和辅酶再生的种间耦合，不易改变细胞膜的通透性等缺陷。特别是与酶催化相比，由于使用的是全细胞，胞内的酶受细胞壁/细胞膜的保护，酶稳定性更好，半衰期更长，更易实现能量和辅酶的再生；胞内多种酶系的存在以实现酶的级联反应可以弥补酶法催化中级联催化不易实现的不足，同时省去酶的纯化过程，制备简单，成本低廉。

4、细胞膜通透性的改变是SAM积累于胞外的前提条件，本发明克服了传统的发酵法需要在发酵终止以后将SAM从胞内提取出来的缺陷，可以降低后续产物分离的难度，从而节省后续分离的成本和简化操作步骤。对微生物进行预处理，改善了微生物细胞壁的通透性，加速反应组分向微生物细胞的扩散、渗透，促进底物和酶系的接触，可使最大转化率以及最大得率出现的时间在一定限度内缩短。

5、金属离子的组合物通过调节酶的活性从而达到对代谢通量的调控作用；代谢通量经调节因子镁离子、钾离子和铵离子调节后，代谢途径流量分配发生了重大改变，EMP的支路途径被强烈抑制，使得EMP主途径得以加强，从而提高了对能量的利用率。

附图说明

图1为本发明中SAM的合成途径。其中AMP为腺苷一磷酸，ADP为腺苷二磷酸，ATP为腺苷三磷酸，NAD⁺为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，PPi为焦磷酸，Pi为磷酸。

具体实施方式

实施例1：

酵母培养基：葡萄糖40g/L，尿素2.0g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸锌4.0×10^-3g/L，七水合硫酸亚铁3.0×10^-3g/L，四水合氯化锰0.3×10^-3g/L，无水氯化钙1.0×10^-3g/L，生物素0.05×10^-3g/L。

酵母接种量10％，于30℃下120rpm摇床培养24小时，离心4000rpm，20分钟。取酵母泥，-7℃保藏备用。

实施例2：以葡萄糖为能量供体，利用AMP合成SAM。

取500ml摇瓶，调制由49mM AMP、0.14M葡萄糖、100g酿酒酵母泥、0.22M磷酸二氢钾、157.5mM MgCl₂、16.5mM MgSO₄、5mM NH₄Cl、40.2mM L-Met、4.5mL甲苯、35mM甘露醇、10mM的木糖醇和水组成的反应液300mL，用氢氧化钠调pH至6.8，于33℃条件下低速搅拌反应4h，反应结束后，用40％三氯乙酸沉淀，用HPLC对SAM进行定量分析，转化液中含SAM 4.5g/L。

实施例3：以葡萄糖为能量供体，利用AR合成SAM。

取500ml摇瓶，调制由45mM腺苷(AR)、0.2M葡萄糖、120g风干的近平滑假丝酵母、0.17M磷酸二氢钾、0.044M磷酸氢二钾、210mM MgCl₂、3.7mM NH₄Cl、40mML-Met、30mM的甘油、54mM甘露醇和水组成的反应液300ml，用氢氧化钾调pH至7.0，于37℃条件下低速搅拌反应8h，反应结束后，用40％三氯乙酸沉淀，用HPLC对SAM进行定量分析，转化液中含SAM 6.5g/L。

实施例4：以麦芽糖和葡萄糖为能量供体，利用AR合成SAM。

取500ml摇瓶，调制由20mM腺苷、0.1M葡萄糖、0.022M麦芽糖、70g奥默列氏毕赤酵母泥、0.02mM磷酸氢二钾、0.05M磷酸二氢钾、100mM MgCl₂、2mM NH₄Cl、20mM L-Met、6mL二甲苯、20mM的甘油、30mM山梨醇和水组成的反应液300ml，用氢氧化钾调pH至7.2，于30℃条件下低速搅拌反应7h，反应结束后，用40％三氯乙酸沉淀，用HPLC对SAM进行定量分析，转化液中含SAM 3.3g/L。

实施例5：以麦芽糖和葡萄糖为能量供体，利用AR合成SAM

取500ml摇瓶，调制由60mM腺苷、0.17M葡萄糖、0.05M麦芽糖、170g经超声波处理后的奥默列氏毕赤酵母泥、0.3M磷酸二氢钾、0.05mM磷酸二氢钠、350mMMgCl₂、16mM NH₄Cl、70mM L-Met、20mM的乙二醇、80mM山梨醇和水组成的反应液300ml，用氢氧化钾调pH至7.0，于37℃条件下低速搅拌反应15h，反应结束后，用40％三氯乙酸沉淀，用HPLC对SAM进行定量分析，转化液中含SAM 6.9g/L。

实施例6：以葡萄糖为能量供体，利用AR合成SAM

取500ml摇瓶，调制由10mM腺苷、0.1M葡萄糖、30g白色球拟酵母泥、0.01M磷酸氢二钠、5mM MgCl₂、0.01M KCl、20mM NH₄Cl、10mM L-Met、0.03mL丙酮、40mM的甘油和水组成的反应液300ml，用氢氧化钾调pH至6，于38℃条件下低速搅拌反应2h，反应结束后，用40％三氯乙酸沉淀，用HPLC对SAM进行定量分析，转化液中含SAM 1.7g/L。

实施例7：以葡萄糖为能量供体，利用AMP合成SAM

取500ml摇瓶，调制由20mM AMP、0.5M葡萄糖、60g类球形德巴利酵母泥、0.5M磷酸氢二钠、500mM MgCl₂、0.5M KCl、50mM NH₄Cl、80mM L-Met、15mL丙酮、60mM的甘油和水组成的反应液300ml，用氢氧化钾调pH至8，于28℃条件下低速搅拌反应20h，反应结束后，用40％三氯乙酸沉淀，用HPLC对SAM进行定量分析，转化液中含SAM4.2g/L。

实施例8：以葡萄糖为能量供体，利用AR合成SAM

取500ml摇瓶，调制由100mM腺苷、0.3M葡萄糖、180g白色球拟酵母泥、0.3M磷酸氢二钠、350mM MgCl₂、0.4M KCl、50mM NH₄Cl、40mM L-Met、0.03g阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物、60mM的甘油和水组成的反应液300ml，用氢氧化钾调pH至6，于38℃条件下低速搅拌反应6h，反应结束后，用40％三氯乙酸沉淀，用HPLC对SAM进行定量分析，转化液中含SAM 6.0g/L。

实施例9：以葡萄糖为能量供体，利用AMP合成SAM

取500ml摇瓶，调制由60mM AMP、0.5M葡萄糖、60g类球形德巴利酵母泥、0.5M磷酸氢二钠、500mM MgCl₂、0.02M KCl、50mM NH₄Cl、80mM L-Met、15g阴离子表面活性剂月桂酰·肌氨酸盐、60mM的甘油和水组成的反应液300ml，用氢氧化钾调pH至7，于37℃条件下低速搅拌反应18h，反应结束后，用40％三氯乙酸沉淀，用HPLC对SAM进行定量分析，转化液中含SAM6.8g/L。

实施例10：以麦芽糖和葡萄糖为能量供体，利用AR合成SAM

取500ml摇瓶，调制由60mM腺苷、0.17M葡萄糖、0.05M麦芽糖、170g经反复冻融4次后的近平滑假丝酵母泥、0.3M磷酸二氢钾、0.05mM磷酸二氢钠、350mMMgCl₂、16mM NH₄Cl、70mM L-Met、20mM的乙二醇、80mM山梨醇和水组成的反应液300ml，用氢氧化钾调pH至7.0，于37℃条件下低速搅拌反应15h，反应结束后，用40％三氯乙酸沉淀，用HPLC对SAM进行定量分析，转化液中含SAM5.7g/L。

Claims

1.一种S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于以多羟基有机试剂保护酶的活性，以腺苷三磷酸前体、L-蛋氨酸和磷酸根离子为底物，以葡萄糖或/和麦芽糖为能量供体，加入金属离子的组合物，利用有透性的生产菌株全细胞催化生产S-腺苷蛋氨酸；

其中，所述的腺苷三磷酸前体为腺苷或腺苷-磷酸；

其中，所述的金属离子的组合物为镁离子、钾离子和铵离子的组合物，其中镁离子起始反应浓度为5～500mM，钾离子起始反应浓度为0.01～0.5M，铵离子起始反应浓度为1～50mM；

其中，有透性的生产菌株，是指通过化学、物理或生物方法处理细胞从而得到细胞膜的通透性改变的生产菌株，具体方法为表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波处理法、风干法或冷冻干燥法；

其中，所述的生产菌株选自：假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、酒香酵母属或产氨短杆菌属，生产菌株的使用量为按湿菌体100～800g/L；

其中，所述的多羟基有机试剂为甘露醇、麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨醇、乙二醇或甘油中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于所述的多羟基有机试剂的使用总量为40～100mM。

3.根据权利要求1所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于底物中，腺苷三磷酸前体的起始反应量为10～100mM；L-蛋氨酸的起始反应量为10～100mM；磷酸根离子的起始反应浓度为0.01～0.5M。

4.根据权利要求3所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于腺苷三磷酸前体的起始反应量为20～60mM；L-蛋氨酸的起始反应量为20～80mM；磷酸根离子的起始反应浓度为0.02～0.3M。

5.根据权利要求1所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于能量供体的起始反应总浓度为0.1～0.5M。

6.根据权利要求1所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于镁离子起始反应浓度为100～350mM，钾离子起始反应浓度为0.02～0.4M，铵离子起始反应浓度为2～20mM。

7.根据权利要求1所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于生产菌株的使用量为按湿菌体200～600g/L。

8.根据权利要求1所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于所述表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通X-100、阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物、或阴离子表面活性剂月桂酰·肌氨酸盐；表面活性剂的使用量为0.1～50g/L。

9.根据权利要求1所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于所述有机溶剂法中使用的有机溶剂为二甲苯、甲苯或丙酮，有机溶剂的使用量为0.1～50m/L。

10.根据权利要求1所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于生产菌株的利用形式是生产菌株细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干菌株或废酵母泥。

11.根据权利要求1～10中任意一项所述的S-腺苷蛋氨酸的制备方法，其特征在于S-腺苷蛋氨酸的生成反应在水溶液中进行，在pH 6～8，28～38℃条件下反应2～20小时。