CN101538598B - 一种胞二磷胆碱的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胞二磷胆碱的制备方法，以氯化胆碱、磷酸根离子和胞苷一磷酸或其前体为底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麦芽糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化制备胞二磷胆碱。本发明通过建立代谢网络模型和代谢流量分析、采用小分子化学效应物质调控代谢流量从而提高能量自耦联及胆碱磷酸化效率的方法，利用有透性的酵母细胞来高效制备胞二磷胆碱，产品浓度大幅提高，底物的利用率也有提高。

Description

一种胞二磷胆碱的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种胞二磷胆碱的制备方法。

背景技术

胞二磷胆碱，又称胞磷胆碱钠，是脑代谢激活剂，可促进神经细胞膜卵磷脂的合成，具有修复脑损伤，抗缺氧，改善记忆，增强智力的作用，临床应用较广。所以，胞二磷胆碱的合成技术是人们比较关心的研究课题。

与CMP可廉价地制造和供应相比，虽然报导胞二磷胆碱有化学合成法、酶法和微生物转化合成等方法，但是前两种方法成本太高，现在已不再采用。目前常用的方法是微生物转化法，利用微生物的细胞酶系合成，但是由于工艺原因，转化率普遍偏低，发酵周期太长，致使转化率、产品浓度较低。

目前，全世界使用微生物细胞作酶源进行酶催化反应来生产胞二磷胆碱。由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，因此能够迅速有效地完成多步酶催化反应。1970年，Tochikura等人(J FermentTechnol.1970，48：769-773)采用风干面包酵母(Saccharomyces carlsbergensis)作酶源，在磷酸缓冲液中，以葡萄糖酵解提供能量，CMP和磷酸胆碱作底物，合成了胞二磷胆碱。其后他们还研究了43株菌株产胞二磷胆碱的能力，获得了两株菌株(Saccharomycesrouxii IAM 4309和Saccharomyces rouxii IFO 0495)，转化率可达80％。我国从1975年开始陆续报道，利用啤酒生产中的下脚料湿酵母等为原料，催化CMP与磷酸胆碱或氯化胆碱转化生产胞二磷胆碱，转化率在80％左右。1992年邱蔚然等首次报道了采用K-卡拉胶固定化酵母生物合成胞二磷胆碱，转化率为40％-60％。徐仁华等(徐仁华，苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司，中国，C12P 19/30，CN 1944661A，2007)利用啤酒酵母合成胞二磷胆碱，转化率达到65％，产品浓度最高只有4g/L。张剑(张剑，CN101130797A，2008)利用啤酒厂废酵母将CMP和磷酸胆碱合成胞二磷胆碱，转化率达到80％，产品浓度未提及。这种工艺采用的磷酸胆碱需要由氯化胆碱与无水磷酸在高温下缩合形成，工艺更复杂，污染与副产物更多，设备成本和操作成本也很高。

鉴于胞二磷胆碱的制备过程中，需要消耗大量的能量(ATP)，因此在胞二磷胆碱的制备过程中需要两个酶系即ATP的再生体系和胞二磷胆碱合成酶系。ATP的再生体系以廉价的葡萄糖为底物，通过糖酵解途径(EMP)来实现，该途径是能量再生的最经济的途径之一；胞二磷胆碱合成酶系由核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶构成，供体ATP在胞二磷胆碱合成过程中作为磷酸供体和能量而存在，该酶系在酿酒酵母和面包酵母中比较发达，胞二磷胆碱的产品浓度主要取决于能量原位再生的效率，胞二磷胆碱合成酶系的效率以及两者原位耦联的效率。

目前国内外胞二磷胆碱转化率、产品浓度普遍不高的一个重要原因就在于效率低下的ATP再生体系与高效的胞二磷胆碱合成酶系之间的不匹配。因此胞二磷胆碱合成的关键就在于如何提高ATP再生的速率即提高EMP途径的通量，而在现有技术中，葡萄糖通过EMP途径生成ATP的效率很低，只能维持酵母细胞一般的生命代谢，要打破原有的平衡，加大EMP途径的通量，超量表达底物磷酸化水平，只有通过基因工程技术或采用小分子化学效应物质(镁离子和钾离子的组合)改变代谢流量的方法来实现，其中采用后者更方便快捷，易于实现。经小分子化学效应物调节后，可使EMP途径的代谢流量发生明显改变，对于底物的利用效率和利用速率(葡萄糖、磷酸盐)明显上升，ATP再生的速率也得到了很大的提高。当其速率与胞二磷胆碱合成体系的速率相匹配时，能量的利用效率和胞二磷胆碱的转化率、产品浓度才能达到较高的水平，从而实现胞二磷胆碱的超量生产。

另一方面，由于胆碱激酶在常规反应条件下活性较低，不能有效地合成磷酸胆碱，这样减缓了胞二磷胆碱合成的速率。所以现有工艺通常使用磷酸胆碱。磷酸胆碱是通过氯化胆碱与无水磷酸在高温条件下脱水缩合而成，这样使得设备增多，流程变得复杂，操作强度也大大增加，成本也随之提高。而利用小分子效应物(甘露醇、半胱氨酸或精胺)调节并提高胆碱激酶的活性使直接利用氯化胆碱作为转化原料成为可能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种胞二磷胆碱的廉价高效的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的思路是：

通过以氯化胆碱、磷酸根离子和胞苷一磷酸(CMP)或其前体物质为底物，采用酵母细胞全细胞催化法制备胞二磷胆碱，合理的运用全细胞催化和代谢工程的原理，通过建立代谢网络模型和代谢流量分析、采用小分子化学效应物质调控代谢流量从而提高能量自耦联及胆碱磷酸化效率的方法，利用有透性的酵母细胞来高效制备胞二磷胆碱，从而使产率大幅提高，底物(如葡萄糖等)的利用率也有所提高。

发明的关键在于：

1)本发明直接利用了微生物体内的酶系EMP途径酶系(己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶)和胞二磷胆碱合成酶系(核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶)进行催化反应，由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，反应所需要的能量和辅酶因子不需要外界供给，直接由细胞产生，因此能够迅速有效地完成多步酶催化反应，在大规模生产方面，有转化效率高、成本低，以及污染小的优点。

2)本发明是建立在全细胞催化的基础上的，其特点在于克服了其它方法底物转化率不高、难于实现能量和辅酶再生的种间耦合，不易改变细胞膜的通透性等缺陷。特别是与酶催化相比，由于使用的是全细胞，胞内的酶受细胞壁、细胞膜的保护，酶稳定性更好，半衰期更长，更易实现能量和辅酶的再生；胞内多种酶系的存在以实现酶的级联反应可以弥补酶法催化中级联催化不易实现的不足，同时省去酶的纯化过程，制备简单，成本低廉。

3)本发明主要涉及葡萄糖的底物水平磷酸化。在现有技术中，葡萄糖通过EMP途径生成ATP的效率很低，只能维持酵母一般生命代谢。而在本发明利用代谢工程及全细胞催化技术，加入钾离子，镁离子等无机离子，使得FDP的累积速率明显加快，刺激丙酮酸激酶活性，加速了磷酸烯醇式丙酮酸的分解，产生更多的ATP，使葡萄糖的磷酸化速率加快；另一方面是由于磷酸烯醇式丙酮酸的分解，使得原来由甘油磷酸脱氢酶催化磷酸二羟丙酮引起的NAD的再生，仍由乙醇脱氢酶担当，系统内的代谢途径流量发生明显改变，流向甘油的代谢流量大幅减小，使得每分子葡萄糖产生的ATP的利用率因此得到了很大的提升。ATP的再生速率的加快，有利于更快更多的生成CTP和磷酸胆碱。这样使得低成本、高转化率地由CMP及其前体物质和氯化胆碱一次转化生产胞二磷胆碱成为可能，开辟了胞二磷胆碱生产的新的、可行途径。

一般情况下，产生的ATP供给酵母的生命代谢，ATP无法有效积累，但在有大量的无机磷酸盐和Mg²⁺存在的情况下，一方面由于大量Mg²⁺的存在，刺激了己糖激酶的活性；另一方面由于大量无机磷酸盐的存在，可部分解除由ATP引起的抑制，使EMP通量明显增大，从而导致能量ATP合成速率增大，高效地耦联了消耗ATP的CTP合成与磷酸胆碱的合成。

4)通过大量的研究工作发现：细胞膜的结构特性决定了细胞膜一般不允许极性分子通过，而胞二磷胆碱带有约一个极性负电荷，因此欲使胞二磷胆碱通过细胞膜积累于反应液中，必须改变细胞膜的透性。细胞膜通透性的改变是胞二磷胆碱积累于胞外的前提条件。对微生物用表面活性剂进行预处理，改善了微生物细胞壁的通透性，加速反应组分向微生物细胞的扩散、渗透，促进底物和酶系的接触，可使最大转化率以及最大产品浓度出现的时间在一定限度内缩短。

5)代谢通量经调节因子镁离子和钾离子调节后，代谢途径流量分配发生了重大改变，EMP的支路途径被强烈抑制，使得EMP主途径得以加强。从而提高了对能量的利用率，能量的实际利用率从54.2％提高到62％左右，而胞二磷胆碱的积累正需要ATP供给能量与磷酸根，胞二磷胆碱进而得以大量积累。

6)胆碱激酶的活性经调节因子(甘露醇、半胱氨酸或精胺)调节提高后，磷酸胆碱的合成速率大大提高，而CTP积累所导致的对胆碱激酶的抑制也有效地被解除，从而胞二磷胆碱合成的两个底物的合成速率也得到匹配，胞二磷胆碱得到快速而大量的积累。

本发明的具体技术方案如下：

一种胞二磷胆碱的制备方法，以氯化胆碱、磷酸根离子和胞苷一磷酸或其前体为底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麦芽糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化制备胞二磷胆碱。

其中，胞二磷胆碱，即CDP-choline，其结构式如下：

其中，胞苷一磷酸，即CMP，其结构式如下：

其中，所述的胞苷一磷酸前体为乳清酸或胞苷。

其中，磷酸离子可选自正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等无机磷酸盐。

底物中，胞苷一磷酸或其前体的起始反应浓度为20～50mM；氯化胆碱的起始反应浓度为40～150mM；磷酸根离子的起始反应浓度为0.01～2M，优选0.02～0.5M。

能量供体可选择葡萄糖、果糖、蔗糖或麦芽糖中的任意一种，起始反应浓度为0.1～1M。

其中，所述的小分子化学效应物质为镁离子、钾离子、甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一种或几种的组合物；Mg²⁺可选自硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等无机盐，其起始反应浓度为1～200mM，优选2～50mM；K⁺起始反应浓度为1mM～2M，优选0.1～1M；甘露醇起始反应浓度为1～20mM，优选5～10mM；半胱氨酸起始反应浓度为1～10mM，优选3～8mM；精胺起始反应浓度为1～20mM，优选2～10mM。

其中，所述的酵母细胞是指从酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属中任意一种能够利用胞苷一磷酸或胞苷前体合成胞二磷胆碱的酵母；优选的例子可举，属于酵母属的微生物酿酒酵母，面包酵母等；属于假丝酵母属的微生物近平滑假丝酵母；属于毕赤酵母属的奥默列氏毕赤酵母；属于球拟酵母属的微生物白色球拟酵母；属于德巴利酵母属的类球形德巴利酵母；属于接合酵母属的鲁氏接合酵母；属于克鲁维酵母属的马克斯克鲁维酵母；属于汉逊酵母属的杰丁汉逊酵母；属于酒香酵母属的异酒香酵母等。酵母的使用量为按湿菌体100～800g/L，优选200～600g/L。

其中，所述的有透性的酵母细胞是指通过化学、物理或生物方法处理过的细胞膜的通透性改变过的酵母细胞，具体方法包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。

表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通X-100、阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物，或者阴离子表面活性剂月桂酰·肌氨酸盐，使用量为0.1～50g/L，优选1～20g/L，即表面活性剂法处理酵母细胞时，将表面活性剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～50g，优选加入1～20g。

有机溶剂法中使用的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用量为0.1～50mL/L，优选1～20mL/L，即有机溶剂法处理生产菌株时，将有机溶剂直接加入反应液，对于总体积为1L的反应液，加入0.1～50mL，优选加入1～20mL。

上述酵母的利用形式可以是酵母细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干酵母或废酵母泥。

胞二磷胆碱的生成反应在水溶液中进行，在pH 5～10，20～50℃条件下反应2～20小时。优选反应条件是pH 6～8，温度为25～40℃。

本发明的制备胞二磷胆碱的主要代谢途径如图1所示。

本发明的有益效果为：

本发明者们研究了通过以氯化胆碱、磷酸根离子和CMP或其前体物质为底物的酵母全细胞催化制备胞二磷胆碱的方法，合理的运用全细胞催化和代谢工程的原理，通过建立代谢网络模型和代谢流量分析、采用小分子化学效应物质调控代谢流量从而提高能量自耦联及胆碱磷酸化效率的方法，利用有透性的酵母细胞来高效制备高能磷酸化合物，转化率和产品浓度大幅提高，底物及其他原料(如葡萄糖等)的利用率也有所提高，并且采用氯化胆碱为反应原料，避免了额外设备投入，降低了生产成本。利用本发明的方法生产胞二磷胆碱的反应结果见表1。

表1本发明方法与现有方法产量对比

^*文献是指顾复昌，杨亮懿.胞二磷胆碱的生产.发酵科技通讯(2007)

附图说明

图1是本发明中胞二磷胆碱的合成途径。

具体实施方式：

实施例1：

酵母培养基(g/L)：葡萄糖40，尿素2.0，磷酸二氢钾1.5，七水合硫酸镁0.5，七水合硫酸锌4.0×10^-3，七水合硫酸亚铁3.0×10^-3，四水合氯化锰0.3×10^-3，无水氯化钙1.0×10^-3，生物素0.05×10^-3。酿酒酵母接种量10％，于30℃下120rpm摇床培养24小时，离心4000rpm，20分钟。取酵母泥，-7℃保藏备用。

实施例2：以CMP和氯化胆碱为底物，葡萄糖为能量供体，制备胞二磷胆碱

在容量为15L的反应槽中，调制由60mM氯化胆碱、0.20M磷酸二氢钠、30mM CMP、0.3M葡萄糖、50mM硫酸镁、1mM氯化钾、2mM半胱氨酸、利用实施例1所述的方法培养的2800克酿酒酵母泥、十六烷基三甲胺·溴化铵10克和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH至6.8，于37℃条件下低速搅拌反应10h，反应结束后，离心沉淀，对上清液进行胞二磷胆碱定量分析，转化液中含胞二磷胆碱14.9克/升，胞二磷胆碱的转化率达到97.4％(mol计)。

实施例3：以胞苷和氯化胆碱为底物，葡萄糖为能量供体，制备胞二磷胆碱

在容量为15L的反应槽中，调制由150mM氯化胆碱、0.5M磷酸二氢钾、50mM胞苷、0.5M葡萄糖、2mM硫酸镁、5mM甘露醇、利用实施例1所述的方法培养的2700g面包酵母泥、10g曲拉通X-100和水组成的反应液12L，用氢氧化钠调pH至6.0，于32℃条件下低速搅拌反应15h，反应结束后，离心沉淀，对上清液进行胞二磷胆碱定量分析，转化液中含胞二磷胆碱22.95克/升，胞二磷胆碱的转化率达到90％(mol计)。

实施例4：以CMP和氯化胆碱为底物，葡萄糖为能量供体，制备胞二磷胆碱

在容量为1500升的反应槽中，调制由60mM氯化胆碱、2M磷酸二氢钾、20mM CMP、1M葡萄糖、200mM硫酸镁，10mM半胱氨酸、利用实施例1所述的方法培养的250kg奥默列氏毕赤酵母泥、500mL二甲苯和水组成的反应液1000升，用氢氧化钠调pH至8，于40℃条件下低速搅拌反应20h，反应结束后，离心沉淀，对上清液进行胞二磷胆碱定量分析，转化液中含胞二磷胆碱10.12克/升，胞二磷胆碱的转化率达到99.2％(mol计)。

实施例5：以乳清酸和氯化胆碱为底物，麦芽糖为能量供体，制备胞二磷胆碱

在容量为15升的反应槽中，调制由50mM氯化胆碱、0.01M磷酸二氢钾、20mM乳清酸、0.1M麦芽糖、20mM硫酸镁、1mM精胺、利用实施例1所述的方法培养的2000g经风干的白色球拟酵母和水组成的反应液10升，用氢氧化钠调pH至10，于25℃条件下低速搅拌反应18h，反应结束后，离心沉淀，对上清液进行胞二磷胆碱定量分析，转化液中含胞二磷胆碱9.18克/升，胞二磷胆碱的转化率达到90％(mol计)。

实施例6：以CMP和氯化胆碱为底物，果糖为能量供体，制备胞二磷胆碱

在容量为15升的反应槽中，调制由100mM氯化胆碱、0.02M磷酸二氢钾、40mMCMP、0.2M果糖、10mM精胺、利用实施例1所述的方法培养的1000g经冻融处理的近平滑假丝酵母和水组成的反应液10升，用氢氧化钠调pH至5，于20℃条件下低速搅拌反应10h，反应结束后，离心沉淀，对上清液进行胞二磷胆碱定量分析，转化液中含胞二磷胆碱19.18克/升，胞二磷胆碱的转化率达到94％(mol计)。

实施例7：以CMP和氯化胆碱为底物，蔗糖为能量供体，制备胞二磷胆碱

在容量为15升的反应槽中，调制由80mM氯化胆碱、0.1M磷酸二氢钾、40mM CMP、0.2M蔗糖、1mM硫酸镁、20mM精胺、利用实施例1所述的方法培养的6000g经超声波处理的类球形德巴利酵母和水组成的反应液10升，用氢氧化钠调pH至7，于50℃条件下低速搅拌反应2h，反应结束后，离心沉淀，对上清液进行胞二磷胆碱定量分析，转化液中含胞二磷胆碱19.38克/升，胞二磷胆碱的转化率达到95％(mol计)。

实施例8：以CMP和氯化胆碱为底物，蔗糖为能量供体，制备胞二磷胆碱

在容量为15升的反应槽中，调制由60mM氯化胆碱、1M磷酸二氢钾、30mM CMP、0.5M蔗糖、20mM甘露醇、1mM半胱氨酸、利用实施例1所述的方法培养的80000g杰丁汉逊酵母、500mL丙酮和水组成的反应液10升，用氢氧化钠调pH至7，于35℃条件下低速搅拌反应15h，反应结束后，离心沉淀，对上清液进行胞二磷胆碱定量分析，转化液中含胞二磷胆碱14.54克/升，胞二磷胆碱的转化率达到95％(mol计)。

实施例9：以胞苷和氯化胆碱为底物，葡萄糖为能量供体，制备胞二磷胆碱

在容量为15升的反应槽中，调制由80mM氯化胆碱、0.5M焦磷酸、35mM胞苷、0.8M葡萄糖、0.01M氯化钾、1mM甘露醇、3mM半胱氨酸、利用实施例1所述的方法培养的4000g异酒香酵母、1mL乙酸乙酯和水组成的反应液10升，用氢氧化钠调pH至7，于38℃条件下低速搅拌反应5h，反应结束后，离心沉淀，对上清液进行胞二磷胆碱定量分析，转化液中含胞二磷胆碱16.07克/升，胞二磷胆碱的转化率达到90％(mol计)。

实施例10.以胞苷和氯化胆碱为底物，葡萄糖为能量供体，制备胞二磷胆碱

在容量为15升的反应槽中，调制由40mM氯化胆碱、0.2M焦磷酸、20mM胞苷、0.5M葡萄糖、5mM硫酸镁、10mM甘露醇、8mM半胱氨酸、2mM精胺、利用实施例1所述的方法培养的2000g酿酒酵母、500g月桂酰·肌氨酸盐和水组成的反应液10升，用氢氧化钠调pH至8，于38℃条件下低速搅拌反应8h，反应结束后，离心沉淀，对上清液进行胞二磷胆碱定量分析，转化液中含胞二磷胆碱9.8克/升，胞二磷胆碱的转化率达到96％(mol计)。

Claims (10)

1.一种胞二磷胆碱的制备方法，其特征是以氯化胆碱、磷酸根离子和胞苷一磷酸或其前体为底物，以葡萄糖、果糖、蔗糖或麦芽糖为能量供体，加入小分子化学效应物质，利用有透性的酵母细胞全细胞催化制备胞二磷胆碱；

其中，所述的胞苷一磷酸前体为乳清酸或胞苷；

所述的小分子化学效应物质为镁离子、钾离子中的任意一种或两种，与甘露醇、半胱氨酸和精胺中的任意一种或几种的组合物。

2.根据权利要求1所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征是底物中，胞苷一磷酸或其前体的起始反应浓度为20～50mM；氯化胆碱的起始反应浓度为40～150mM；磷酸根离子的起始反应浓度为0.01～2M。

3.根据权利要求1所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征是能量供体的起始反应浓度为0.1～1M。

4.根据权利要求1所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征是Mg²⁺起始反应浓度为1～200mM，K⁺起始反应浓度为1mM～2M，甘露醇起始反应浓度为1～20mM，半胱氨酸起始反应浓度为1～10mM，精胺起始反应浓度为1～20mM。

5.根据权利要求1所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征是所述的酵母细胞是指从酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属中任意一种能够利用胞苷一磷酸或胞苷前体合成胞二磷胆碱的酵母，酵母的使用量为按湿菌体100～800g/L。

6.根据权利要求1所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征是所述的有透性的酵母细胞是指通过表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法处理过的细胞膜的通透性改变过的酵母细胞。

7.根据权利要求6所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征是表面活性剂法中使用的表面活性剂为非离子型表面活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通X-100、阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物，或者阴离子表面活性剂月桂酰·肌氨酸盐，表面活性剂的使用量为0.1～50g/L。

8.根据权利要求6所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征是有机溶剂法中使用的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，有机溶剂使用量为0.1～50mL/L。

9.根据权利要求1、5、6、7或8所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征是酵母的利用形式可以是酵母细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干酵母或废酵母泥。

10.根据权利要求1～8中任意一项所述的胞二磷胆碱的制备方法，其特征是胞二磷胆碱的生成反应在水溶液中进行，在pH 5～10，20～50℃条件下反应2～20小时。

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