CN1896264A - 一种核苷三磷酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种核苷三磷酸的制备方法，以核苷一磷酸NMP或其前体和磷酸根离子为底物，以葡萄糖为能量供体，利用有透性的酵母细胞，经小分子化学效应物质的调控来制备高能磷酸化合物。本发明通过建立代谢网络模型和代谢流量分析、采用小分子化学效应物质调控代谢流量从而提高能量自耦联效率的方法，利用有透性的酵母细胞来高效制备高能磷酸化合物，产率大幅提高，合成时间大大缩短，底物的利用率也有提高。

Description

一种核苷三磷酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种从核苷一磷酸NMP或其前体合成核苷三磷酸NTP的方法。

背景技术

核苷三磷酸(ATP、CTP、GTP、UTP)是重要的磷酰基化合物，是核酸合成的直接前体、重要的辅酶和能量载体，在细胞的生命代谢中起着十分重要的作用。

ATP临床上可用于治疗肌无力、胃下垂、急慢性肝炎、药物性鼻炎、血管痉挛、心绞痛、阵发性房性心动过速、脑血管障碍、进行性肌萎缩、视力减退、耳鸣、肾炎、癌症以及与辅酶A，细胞色素C组成“能量合剂”用于危重病人的急救等。其衍生物环磷腺苷可用于心绞痛、急性心肌梗塞的辅助治疗，与磷酸二酯酶抑制剂氨茶碱合用，可使其作用增强；用于治疗脑血栓、使中枢性偏瘫、运动性失语和意识障碍等均有不同程度的改善。

CTP临床上用于治疗脑血管意外及后遗症、脑震荡、外伤性昏迷、颅脑手术后功能障碍、老年性痴呆、外周神经损伤、儿童脑发育不全、脂肪肝及血管疾病、神经损伤所致的意识障碍。其商品名有：美络宁，依美思，纽枢通，斯替吡等。其衍生物：胞二磷胆碱临床上用于颅脑损伤、颅脑术后和急性脑梗塞引起的意识障碍，以及帕金森综合征、神经性耳聋和耳鸣的辅助治疗。

GTP临床上也可用于迁延性肝炎、慢性肝炎、进行性肌萎缩、视力减退等蛋白质病变和酶系紊乱引起的疾病的治疗和辅助治疗。

UTP通过形成中间产物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)形式作为体内肝糖原和肌糖原合成时葡萄糖单位的供体，通过形成UDP-葡萄糖醛酸形式作为体内粘多糖，如硫酸软骨素，透明质酸，肝素等生物合成时葡萄糖醛酸的供体。UTP及相关化合物还可用于防治肺炎，治疗窦炎、纤毛运动障碍、中耳炎及支气管炎等疾病。另外，其衍生物：曲氟尿苷三磷酸酯，可抑制病毒的和在较小程度上抑制细胞的DNA聚合酶，可以应用于SARS的辅助治疗；尿二磷葡萄糖，临床上用于治疗中毒性及传染性肝炎。

自上世纪六十年代起，随着核酸发酵和核酸分解等核酸工业的发展，目前已可以廉价地制造核苷和核苷一磷酸(NMP)，其部分已作为药品或原料而制造销售，此外，核苷、核苷酸或其衍生物作为医药的开发也在积极地进行。

与NMP可廉价地制造和供应相比，虽然报导NTP有化学合成法和使用酶法合成等方法，但是这些方法成本太高，目前常用的方法是微生物转化法，利用微生物的细胞酶系合成，但是由于工艺原因，转化率普遍偏低，发酵周期太长，致使成本太高。

目前，全世界使用微生物细胞作酶源进行酶催化反应来生产ATP。由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，因此能够迅速有效地完成多步酶催化反应。1967年，Tochikura等人(J Ferment Technol.1967，45(6)：511-529)利用面包酵母细胞酶系作为酶源，由AMP生成ATP，这种能完成多步酶催化反应的方法应用于ATP生产引起了人们的重视，随后得到发展。1973年中山大学生物系微生物教研室(微生物学报.1973，Vol.13(2)：185-187)报导了利用啤酒酵母进行ATP合成的研究，他们以AMP为底物，ATP得率达到90％。黎立奇(黎立奇.中国，C07H 19/16，CN 1108660，1995)利用啤酒酵母合成ATP，得率达到91％。邱蔚然利用固定化啤酒酵母合成ATP，得率接近100％。(邱蔚然，CN1234444A^[1]；邱蔚然，CN1038257C^[2]；邱蔚然，1108660A^[3])。用戊二醛交联酵母细胞连续生产NTP时，由于NAD、ATP和其他一些未知的小分子物质的流失，导致酵母细胞的磷酸化能力迅速减弱；而用卡拉胶等包埋法生产NTP时，由于酵解过程中产生大量的CO₂，导致包埋载体、稳定性下降和酶的流失。用固定化生产NTP存在两大缺点，一方面固定化细胞运行时间短，另一方面对葡萄糖和磷酸盐的转化率低，副产物多，因此如用固定化细胞工业化生产NTP，存在过程稳定性难以保证和生产成本高的问题。

国外报导利用CMP合成CTP，得率只有80％[Hakko Kogaku Zasshi.1970，Vol.48(12)：753-762^[4]]。而目前国内CTP虽然已有合成的相关报导，但是普遍存在着转化率偏低，也只能达到80％左右，而且工艺复杂需要添加适量的ATP、吐温等(应国清，2004 Vol.32No.4 P.428-432)，而目前采用固定化酵母法合成CTP(邱蔚然，精细与专用化学品，200217期^[5]；邱蔚然，CN1234444A^[1])时，也需要添加AR或AMP，而且还需要添加价格昂贵的NAD⁺等辅酶，否则每批转化率急剧下降，致使成本大为上升，固定化细胞的质量也不稳定，固定化成本高，可操作性差，这一切都不利于CTP的工业化生产。

目前国内UTP、GTP还未有产业化生产报道，国外只有少量的相关文献报导。Kichitaro Kawaguchi等(Agr.Biol.Chem.1970，Vol.34.908-918^[10])用干燥的啤酒酵母细胞，以GMP合成GTP，得率达到61.1％。Mahn.J.K等(Appl Biochem Biotech 1987，Vol.16.95-109^[11])用啤酒酵母，以GMP合成GTP，反应得率为77.9％。UTP有文献报导的最高得率达到了79.4％[Stabilizing Nucleotides Derivatives.Japan.7,237,036，18 Sep.(1972)^[12]、Appl Biochem Biotech，Vol.16.95-109(1987)^[11]]。

鉴于高能磷酰基化合物的制备过程中，需要消耗大量的能量(ATP)，因此在高能磷酰基化合物的制备过程中需要两个酶系即ATP的再生体系和NTP合成酶系。ATP的再生体系以廉价的葡萄糖为底物，通过糖酵解途径(EMP)来实现，该途径是能量再生的最经济的途径之一；NTP合成酶系由核苷酸激酶和核苷二磷酸激酶构成，供体ATP在NTP合成过程中作为磷酸供体和能量而存在，该酶系在酿酒酵母和面包酵母中比较发达，NTP的得率主要取决于能量原位再生的效率，NTP合成酶系的效率以及两者原位耦联的效率。

目前国内外NTP得率普遍不高的一个重要原因就在于效率低下的ATP再生体系与高效的NTP合成酶系之间的不匹配。因此NTP合成的关键就在于如何提高ATP再生的速率即提高EMP途径的通量，而在现有技术中，葡萄糖通过EMP途径生成ATP的效率很低，只能维持酵母细胞一般的生命代谢，要打破原有的平衡，加大EMP途径的通量，超量表达底物磷酸化水平，只有通过基因工程技术或采用小分子化学效应物质(镁离子，钾离子，铵离子的组合)改变代谢流量的方法来实现，其中采用后者更方便快捷，易于实现。经小分子化学效应物调节后，可使EMP途径的代谢流量发生明显改变，对于底物的利用效率和利用速率(葡萄糖、磷酸盐)明显上升，ATP再生的速率也得到了很大的提高。当其速率与NTP合成体系的速率相匹配时，能量的利用效率和NTP的得率才能达到较高的水平，从而实现NTP的超量生产。

发明内容

本发明的目的在于克服NTP的制备成本高得率低的缺点，提供一种廉价而高效的核苷三磷酸NTP制备方法。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

以核苷一磷酸NMP或其前体和磷酸根离子为底物，以葡萄糖为能量供体，利用预处理过的有透性的酵母，在小分子化学效应物质的存在下反应来制备高能磷酸化合物。

本发明者们研究了通过以NMP或其前体物质为底物的以往的酵母菌体法制得NTP的方法，合理的运用全细胞催化和代谢工程的原理，通过建立代谢网络模型和代谢流量分析、采用小分子化学效应物质调控代谢流量从而提高能量自耦联效率的方法，利用有透性的酵母细胞来高效制备高能磷酸化合物，产率大幅提高，合成时间大大缩短，底物(如葡萄糖等)的利用率也有所提高。

发明的关键在于：

1)本发明直接利用了微生物体内的酶系EMP途径酶系(己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶)和NTP合成酶系(核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶)进行催化反应，由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，反应所需要的能量和辅酶因子不需要外界供给，直接由细胞产生，因此能够迅速有效地完成多步酶催化反应，在大规模生产方面，有转化效率高、成本低，以及污染小的优点。

2)本发明是建立在全细胞催化的基础上的，其特点在于克服了其它方法底物转化率不高、难于实现能量和辅酶再生的种间耦合，不易改变细胞膜的通透性等缺陷。特别是与酶催化相比，由于使用的是全细胞，胞内的酶受细胞壁/细胞膜的保护，酶稳定性更好，半衰期更长，更易实现能量和辅酶的再生；胞内多种酶系的存在以实现酶的级联反应可以弥补酶法催化中级联催化不易实现的不足，同时省去酶的纯化过程，制备简单，成本低廉。

3)本发明主要涉及葡萄糖的底物水平磷酸化。在现有技术中，葡萄糖通过EMP途径生成NTP的效率很低，只能维持酵母一般生命代谢。而在本发明利用代谢工程及全细胞催化技术，加入铵离子，镁离子等无机离子，使得FDP的累积速率明显加快，刺激丙酮酸激酶活性，加速了磷酸烯醇式丙酮酸的分解，产生更多的ATP，使葡萄糖的磷酸化速率加快；另一方面是由于磷酸烯醇式丙酮酸的分解，使得原来由甘油磷酸脱氢酶催化磷酸二羟丙酮引起的NAD的再生，仍由乙醇脱氢酶担当，系统内的代谢途径流量发生明显改变，流向甘油的代谢流量大幅减小，使得每分子葡萄糖产生的ATP的利用率因此得到了很大的提升。ATP的再生速率的加快，有利于更快更多的生成NTP。这样使得低成本、高转化率地由核苷一磷酸(NMP)及其前体物质一次转化生产NTP成为可能，开辟了NTP生产的新的、可行途径。

一般情况下，产生的ATP供给酵母的生命代谢，ATP无法有效积累，但在有大量的无机磷酸盐和Mg²⁺存在的情况下，一方面由于大量Mg²⁺的存在，刺激了己糖激酶的活性；另一方面由于大量无机磷酸盐的存在，可部分解除由ATP引起的抑制，使EMP通量明显增大，从而导致NTP在胞外的累积。

4)通过大量的研究工作发现：细胞膜的结构特性决定了细胞膜一般不允许高极性分子通过，而NTP带有约四个极性负电荷，因此欲使NTP通过细胞膜积累于反应液中，必须改变细胞膜的透性。细胞膜通透性的改变是NTP积累于胞外的前提条件。对微生物用表面活性剂进行预处理，改善了微生物细胞壁的通透性，加速反应组分向微生物细胞的扩散、渗透，促进底物和酶系的接触，可使最大转化率以及最大得率出现的时间在一定限度内缩短。

5)代谢通量经调节因子镁离子、钾离子和铵离子调节后，代谢途径流量分配发生了重大改变，EMP的支路途径被强烈抑制，使得EMP主途径得以加强。从而提高了对能量的利用率，能量的实际利用率从54.2％提高到62％左右，而NTP的积累正需要ATP供给能量与磷酸根，NTP进而得以大量积累。

下面详细说明本发明：

核苷三磷酸，即NTP是指腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)，其结构式如下：

核苷一磷酸(NMP)是指腺苷一磷酸(AMP)、鸟苷一磷酸(GMP)、尿苷一磷酸(UMP)、胞苷一磷酸(CMP)，其结构式如下：

核苷一磷酸(NMP)前体为乳清酸、腺苷(AR)、鸟苷(GR)或胞苷(CR)；小分子化学效应物质是指镁离子、钾离子和铵离子的组合物。

NTP的生成反应在水溶液中进行，在pH 5～10，20～50℃条件下反应2～20小时，优选pH 6～8，温度为25～40℃。

核苷一磷酸(NMP)或其前体的量为1～100mM，优选5～50mM，酵母的量为按湿菌体100～800g/L，优选200～600g/L。

在本发明的NTP的合成中可使用的酵母细胞是指从酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属中能够利用核苷前体合成NTP的微生物。优选的例子可举，属于酵母属的微生物酿酒酵母，面包酵母等；属于假丝酵母属的微生物近平滑假丝酵母；属于毕赤酵母属的奥默列氏毕赤酵母；属于球拟酵母属的微生物白色球拟酵母；属于德巴利酵母属的类球形德巴利酵母；属于接合酵母属的鲁氏接合酵母；属于克鲁维酵母属的马克斯克鲁维酵母；属于汉逊酵母属的杰丁汉逊酵母；属于酒香酵母属的异酒香酵母等。

酵母的利用形式为酵母细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干酵母、废酵母泥等。

有透性的酵母的预处理即菌体的破壁，是指通过化学、物理或生物方法处理酵母细胞，改变细胞膜的通透性，具体方法包括表面活性剂法，有机溶剂法，冻融法，超声波处理法、风干法、冷冻干燥法、溶菌酶法等。

表面活性剂法中表面活性剂可使用聚环氧乙烷胺、曲拉通X-100等非离子型表面活性剂，十六烷基三甲胺·溴化物等阳离子型表面活性剂，月桂酰·肌氨酸盐等阴离子表面活性剂，通常以0.1～50g/L的浓度使用，优选以1～20g/L的浓度使用。

有机溶剂法中有机溶剂可举二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等，通常以0.1～50mL/L的浓度使用，优选以1～20mL/L的浓度使用。

NTP的生产过程中有必要添加能量的供体和磷酸根离子、镁离子、钾离子、等无机离子。

能量供体包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等碳水化合物，以0.01～1M的浓度使用。

磷酸离子可举出正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸等多磷酸，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠等无机磷酸盐，以0.01～2M的浓度使用，优选0.02～0.5M。

镁离子可举出硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等无机盐，通常以1～200mM的浓度使用，优选2～50mM。K⁺浓度为1～200mM，优选2～50mM，NH₄ ⁺浓度为1～200mM，优选2～100mM。

本发明的有益效果为：

本发明者们研究了通过以NMP或其前体物质为底物的以往的酵母菌体法制得NTP的方法，合理的运用全细胞催化和代谢工程的原理，通过建立代谢网络模型和代谢流量分析、采用小分子化学效应物质调控代谢流量从而提高能量自耦联效率的方法，利用有透性的酵母细胞来高效制备高能磷酸化合物，产率大幅提高，合成时间大大缩短，底物及其他原料(如葡萄糖等)的利用率也有所提高。

	文献浓度	文献得率	本发明浓度	本发明得率
					ATPUTPGTPCTP	20.29g/L[1-3]10.24g/L/[7]6.39g/L[6]19.37g/L[1][5]	接近100％[1-3]79.4％[7]77.9％[7]80％[4]	25.341g/L25.427g/L14.921g/L26.2709g/L	99.1％(实施例1)88.9％(实施例3)92.7％(实施例7)97.2％(实施例5)

附图说明

图1是本发明中NTP的合成途径示意图。

图2是ATP的HPLC检测方法中标准品HPLC图谱。

图3是ATP的HPLC检测方法中ATP样品HPLC图谱。

图4是UTP的HPLC检测方法中标准品HPLC图谱。

图5是UTP的HPLC检测方法中UTP样品HPLC图谱。

图6是GTP的HPLC检测方法中标准品HPLC图谱。

图7是GTP的HPLC检测方法中GTP样品HPLC图谱。

图8是CTP的HPLC检测方法中标准品HPLC图谱。

图9是CTP的HPLC检测方法中CTP样品HPLC图谱。

其中图2，图3中1为AMP，2为腺苷二磷酸ADP，3为ATP。图4，图5中4为UMP，5为尿苷二磷酸UDP，6为UTP。图6，图7中7为GMP，8为鸟苷二磷酸GDP，9为GTP。图8，图9中10为CMP，11为胞苷二磷酸CDP，12为CTP。

具体实施方式

实施例1.利用AMP合成ATP

酵母培养基(g/L)：葡萄糖40，尿素2.0，磷酸二氢钾1.5，七水合硫酸镁0.5，七水合硫酸锌4.0×10^-3，七水合硫酸亚铁3.0×10^-3，四水合氯化锰0.3×10^-3，无水氯化钙1.0×10^-3，生物素0.05×10^-3。酿酒酵母接种量10％，于30℃下120rpm摇床培养24小时，离心4000rpm，20分钟。取酵母泥，-7℃保藏备用。

在容量为15L的反应槽中调制由AMP139.4克，葡萄糖540克，酵母泥2800克，硫酸铵20克，硫酸镁30克，磷酸二氢钾0.20M，十六烷基三甲胺·溴化铵10克和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH至6.5，于37℃条件下低速搅拌反应5h，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对ATP进行定量分析，转化液中含ATP20.18克/升，可确认ATP的得率达到99.1％(mol计)。

实施例2.利用AR合成ATP

在容量为15L的反应槽中调制由AR140.55克，葡萄糖810克，利用实施例1所述方法培养面包酵母冻干粉2700克，硫酸铵20克，硫酸镁30克，磷酸二氢钾0.20M，苯10毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH至6.5，于37℃条件下低速搅拌反应5h，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对ATP进行定量分析，转化液中含ATP25.34克/升，可确认ATP的得率达到95％(mol计)。

实施例3.利用UMP合成UTP

在容量为15L的反应槽中调制由UMP191.52克，葡萄糖618克，利用实施例1所述方法培养酿酒酵母2700克，风干处理，硫酸铵20克，硫酸镁30克，磷酸二氢钠0.26M，曲拉通X-100 10毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH至6.5，于37℃条件下低速搅拌反应4h，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对UTP进行定量分析，转化液中含UTP25.43克/升，可确认UTP的得率达到88.9％(mol计)。

实施例4.利用乳清酸合成UTP

在容量为15L的反应槽中调制由乳清酸95克，葡萄糖600克，市售面包酵母粉3000克，硫酸铵40克，硫酸镁35克，磷酸二氢钾0.30M，二甲苯12毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH至6.5，于37℃条件下低速搅拌反应8h，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对UTP进行定量分析，转化液中含UTP25.43克/升，可确认UTP的得率达到86.3％(mol计)。

实施例5.利用CMP合成CTP

在容量为15L的反应槽中调制由CMP180.8克、葡萄糖600克、硫酸镁20克、利用实施例1所述方法培养酿酒酵母2700克，风干处理，硫酸铵30克，氯化钠10克，磷酸二氢钾0.25M，十六烷基三甲胺·溴化铵10克和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7，于30℃低速搅拌反应3小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对CTP进行定量分析，转化液中含CTP26.27克/升，可确认CTP的得率达到97.2％(mol计)。

实施例6.利用CR合成CTP

在容量为15L的反应槽中调制由CR140.54克、葡萄糖720克、硫酸镁20克、利用实施例1所述方法培养面包酵母2700克，反复冻融3次，硫酸铵30克，氯化钠10克，磷酸氢二钠0.30M，十六烷基三甲胺·溴化铵10克和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7，于30℃低速搅拌反应4小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对CTP进行定量分析，转化液中含CTP26.27克/升，可确认CTP的得率达到94.1％(mol计)。

实施例7.利用GMP合成GTP

在容量为15L的反应槽中调制由GMP111.75克、葡萄糖550克、硫酸镁20克、利用实施例1所述方法培养酿酒酵母2800克，风干处理，超声处理20分钟，硫酸铵30克，氯化钠10克，磷酸二氢钾0.20M，乙酸乙酯10毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7，于30℃低速搅拌反应4小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对GTP进行定量分析，转化液中含GTP14.92克/升，可确认GTP的得率达到92.7％(mol计)。

实施例8.利用GR合成GTP

在容量为15L的反应槽中调制由GR89.76克、葡萄糖850克、硫酸镁20克、啤酒厂酵母泥2700克，硫酸铵30克，氯化钠10克，磷酸二氢钾0.20M，甲苯10毫升和水组成的反应液10L，用氢氧化钠调pH为7，于30℃低速搅拌反应4小时，反应结束后，用高氯酸沉淀，用HPLC对GTP进行定量分析，转化液中含GTP14.92克/升，可确认GTP的得率达到90％(mol计)。

HPLC检测方法

1、ATP的HPLC检测方法：

色谱条件

色谱柱：汉邦Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm)；

流动相：甲醇-6‰(体积分数)磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6.6)(体积比为10∶90)；

流速：1.0mL/min；

检测波长：261nm；

柱温：室温；

进样体积：20μL。

标准品溶液及供试品溶液的制备

精密称取AMP、ADP、ATP，用缓冲液配制成质量浓度约为50mg·L^-1的标准品溶液；

将经预处理的样品用缓冲液稀释至约50mg·L^-1，并用0.45μm微孔膜进行过滤后，作为供试品溶液。

标准品及供试品的HPLC图谱，见图2，图3

2、UTP的HPLC检测方法：

色谱条件

色谱柱：汉邦Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm)；

流动相：甲醇-6‰(体积分数)磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6.6)(体积比为5∶95)；

流速：1.0mL/min；

检测波长：271nm；

柱温：室温；

进样体积：20μL。

标准品溶液及供试品溶液的制备

精密称取UMP、UDP、UTP，用缓冲液配制成质量浓度约为50mg·L^-1的标准品溶液；

将经预处理的样品用缓冲液稀释至约50mg·L^-1，并用0.45μm微孔膜进行过滤后，作为供试品溶液。

标准品及供试品的HPLC图谱，见图4，图5

3、GTP的HPLC检测方法：

色谱条件

色谱柱：汉邦Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm)；

流动相：甲醇-6‰(体积分数)磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6.6)(体积比为5∶95)；

流速：1.0mL/min；

检测波长：271nm；

柱温：室温；

进样体积：20μL。

标准品溶液及供试品溶液的制备

精密称取GMP、GDP、GTP，用缓冲液配制成质量浓度约为50mg·L^-1的标准品溶液；

将经预处理的样品用缓冲液稀释至约50mg·L^-1，并用0.45μm微孔膜进行过滤后，作为供试品溶液。

标准品及供试品的HPLC图谱，见图6，图7

4、CTP的HPLC检测方法：

色谱条件

色谱柱：汉邦Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm)；

流动相：甲醇-6‰(体积分数)磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6.6)(体积比为5∶95)；

流速：1.0mL/min；

检测波长：271nm；

柱温：室温；

进样体积：20μL。

标准品溶液及供试品溶液的制备

精密称取CMP、CDP、CTP，用缓冲液配制成质量浓度约为50mg·L^-1的标准品溶液；

将经预处理的样品用缓冲液稀释至约50mg·L^-1，并用0.45μm微孔膜进行过滤后，作为供试品溶液。

标准品及供试品的HPLC图谱，见图8，图9。

Claims (17)

1、一种核苷三磷酸的制备方法，其特征是以核苷一磷酸NMP或其前体和磷酸根离子为底物，以葡萄糖为能量供体，利用有透性的酵母细胞，在小分子化学效应物质的存在下反应来制备高能磷酸化合物。

2、根据权利要求1所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是所述的核苷三磷酸NTP是指腺苷三磷酸ATP、鸟苷三磷酸GTP、尿苷三磷酸UTP、胞苷三磷酸CTP，其结构式如下：

3、根据权利要求1所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是所述的核苷一磷酸NMP是指腺苷一磷酸AMP、鸟苷一磷酸GMP、尿苷一磷酸UMP、胞苷一磷酸CMP，其结构式如下：

4、根据权利要求1所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是所述的核苷一磷酸NMP前体为乳清酸、腺苷AR、鸟苷GR或胞苷CR。

5、根据权利要求1所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是所述的小分子化学效应物质是指镁离子、钾离子和铵离子的组合物。

6、根据权利要求1所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是核苷三磷酸NTP的生成反应在水溶液中进行，在pH5～10，20～50℃条件下反应2～20小时。

7、根据权利要求6所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是反应条件为pH6～8，温度为25～40℃。

8、根据权利要求1或3或4所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是核苷一磷酸NMP或其前体的量为1～100mM。

9、根据权利要求8所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是核苷一磷酸NMP或其前体的量为5～50mM。

10、根据权利要求1或5所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是Mg²⁺浓度为1～200mM，K⁺浓度为1～200mM，NH₄ ⁺浓度为1～200mM，葡萄糖的浓度为0.1～1M，PO₄ ^3-浓度为0.01～2M。

11、根据权利要求10所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是Mg²⁺浓度为2～50mM，K⁺浓度为2～50mM，NH₄ ⁺浓度为2～100mM，PO₄ ^3-浓度为0.02～0.5M。

12、根据权利要求1所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是所述的酵母细胞是指从酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属中能够利用核苷前体合成NTP的酵母，酵母细胞的使用量为按湿菌体100～800g/L。

13、根据权利要求12所述的核苷三磷酸的制备方法，，其特征是所述的酵母细胞为酿酒酵母、近平滑假丝酵母、面包酵母、奥默列氏毕赤酵母、白色球拟酵母、类球形德巴利酵母、鲁氏接合酵母、马克斯克鲁维酵母、杰丁汉逊酵母或异酒香酵母，酵母的使用量为按湿菌体200～600g/L。

14、根据权利要求1所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是所述的有透性的酵母细胞是指通过化学、物理或生物方法处理过的细胞膜的通透性改变过的酵母细胞，具体方法包括表面活性剂法、有机溶剂法、冻融法、超声波处理法、风干法、冷冻干燥法或溶菌酶法。

15、根据权利要求14所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是表面活性剂法中使用的表面活性剂包括非离子型表面活性剂聚环氧乙烷胺或曲拉通X-100，阳离子型表面活性剂十六烷基三甲胺·溴化物或阴离子表面活性剂月桂酰·肌氨酸盐，使用浓度为0.1～50g/L，优选1～20g/L。

16、根据权利要求14所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是有机溶剂法中使用的有机溶剂为二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮或乙酸乙酯，使用浓度为0.1～50ml/l，优选1～20ml/l。

17、根据权利要求1、12或14所述的核苷三磷酸的制备方法，其特征是酵母的利用形式为酵母细胞的干燥物、经过发酵培养分离离心得到的细胞、细胞的冻干物、市售酵母粉、风干酵母或废酵母泥。

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