CN104830930B - 一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及生物催化法制备2’‑脱氧鸟苷的技术领域，具体为一种核苷类药物中间体2’‑脱氧鸟苷的生产方法，该方法，以β‑胸苷和鸟嘌呤为原料，采用发酵乳杆菌菌体浆状物为生物催化剂，在聚乙二醇10000/磷酸氢二钾双水相系统下进行生物催化反应，得到2’‑脱氧鸟苷产物。在最优化条件下，底物β‑胸苷加入量达到16.5g/L，胸苷转化率达89％，产物2’‑脱氧鸟苷达16.1g/L。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及生物催化法制备2’-脱氧鸟苷的技术领域，具体为一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法。
背景技术
2＇-脱氧鸟苷是一种天然的脱氧核苷，可直接用于制备组合脱氧核苷药物或者作为化学试剂用于生化研究；同时可作为中间体用于合成一些抗病毒核苷类药物以及分子标记物，如文献（Journal of Medicinal Chemistry,1985, 28：1194-1198）以2’-脱氧鸟苷原料合成8-溴-2’-脱氧鸟苷和8-羟基-2’-脱氧鸟苷等重要分子标记物；文献（TetrahedronLetters,1982,23 (22):2253-2256,1982 Tetrahedron Letters,1990，31(3):319-322）中报道了合成2’-脱氧鸟苷的6位衍生物，如6-甲氧基、6-氨基等系列重要抗肿瘤的2’-脱氧鸟苷衍生物；另外中国专利CN201110114010公开报道了采用2’-脱氧鸟苷为原料合成致癌或抗癌过程中的重要分子标记物N7-鸟嘌呤烷化物。
由于采用化学法合成2’-脱氧鸟苷的收率极低，因此，目前，工业上2’-脱氧鸟苷生产方法采用DNA水解法，即从DNA水解液中萃取与分离得到。因此，人们开始着手于采用生物法来制备2’-脱氧鸟苷。
中国专利CN201010611733和文献（药物生物技术，2011，18(2):119-123）报道了以鸟苷酸（5’-单磷酸鸟苷）为原料，采用乙酰短杆菌的核苷磷酸化酶和磷酸单酯酶双酶作用下催化合成2’-脱氧鸟苷，该方法除产物2’-脱氧鸟苷外，还生成了鸟苷，不利于后续分离纯化。
日本有机合成药品工业株式会社的三上洋一（Yoichi Mikanmi）等（中国专利CN200510137532、CN200510137533、CN200510137534、CN01110115、US20010034047A1、US20040067558A1以及US20040072303A1等同族专利）报道了先将鸟嘌呤与乙二醛进行反应生成乙二醛-鸟嘌呤复合体来提高鸟嘌呤的溶解度，转化完毕后再经碱解脱去乙二醛基团生成2’-脱氧鸟苷；该方法虽然一定程度上提高2’-脱氧鸟苷的转化产率，但所用乙二醛对人体健康以及环境仅有危害。
欧洲专利EP1457568、美国专利US20050170470A1和世界专利WO2003057895A1采用鸟苷、5’-单磷酸鸟苷、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤作为脱氧核糖受体来制备2’-脱氧鸟苷或2’-脱氧鸟苷前提物（如5’-单磷酸2’-脱氧鸟苷、2-氨基-6-氯-2’-脱氧核苷、2，6-二氨基-2’-脱氧核苷）前提物再经处理得到2’-脱氧鸟苷，如5’-单磷酸2’-脱氧鸟苷水解脱去5’-磷酸基得到2’-脱氧鸟苷，而2-氨基-6-氯-2’-脱氧核苷和2，6-二氨基-2’-脱氧核苷则再腺苷脱氨酶作用下，将6-氯（-Cl）或6-氨基(-N2H)位替代基团转换成6-酮基(=O)。
美国专利US6197552和文献（Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic，2000，10：207–213）同样报道了采用2，6-二氨基嘌呤作为脱氧糖基受体合成2’-脱氧鸟苷前提物2，6-二氨基-2’-脱氧核苷。文献（Biosci. Biotechnol. Biochem., 2003，67 (5)：989–995）报道了采用2-氨基-6-氯嘌呤作为脱氧糖基受体合成2’-脱氧鸟苷前提物2-氨基-6-氯-2’-脱氧核苷。
但由于鸟嘌呤难溶于水，这是鸟嘌呤作为糖基受体的瓶颈之处，为了提高2’-脱氧鸟苷转化产率，关键措施是提高鸟嘌呤在转化体系的溶解度。但是从上述报道来看，基本上很少关注于如何提高鸟嘌呤在转化体系中溶解度的问题，而是着重鸟嘌呤的替代前提物（如鸟苷酸、鸟苷、2-氨基-6-氯嘌呤以及2，6-二氨基嘌呤）方面，虽然这些替代前提物与鸟嘌呤相比，在转化体系溶解度大大提高，使得2’-脱氧鸟苷终转化产率一定程度上得到提高，但是存在转化率偏低、替代前提物不易获得以及副产物增加等缺陷。
双水相系统是指将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相溶的两相，两相中均含有水分，构成了双水相体系。双水相技术早期主要用于生物分子和细胞的分离与纯化，近年来开始应用于微生物催化过程，为酶催化过程引入了一种全新的反应体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法。该方法将双水相系统应用到生物催化制备2’-脱氧鸟苷的工艺中，解决以往鸟嘌呤在转化体系中溶解度低的瓶颈问题，可大大增加鸟嘌呤溶解度，大副度提高转化率。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法，是采用产脱氧核苷核糖转移酶的发酵乳杆菌CGMCC 1.1880菌体浆状物为生物催化剂，在聚乙二醇（PEG）/无机盐双水相转化体系，以β-胸苷和鸟嘌呤为原料进行酶促反应，最后获得2’-脱氧鸟苷。
所述的双水相转化体系中所用多聚物为聚乙二醇，所选的种类有PEG4000、PEG8000、PEG10000、PEG15000和PEG20000。其优选为PEG10000和PEG15000，其最优选为PEG10000。所述聚乙二醇的浓度为25g/L-55g/L，包括 25g/L、45g/L和55g/L，优选PEG10000的的浓度为45g/L。
本发明双水相转化体系中所用无机盐为磷酸盐，所选的盐种类有磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和磷酸二氢铵，优选为磷酸二氢钾。磷酸盐的浓度为30g/L-60g/L，包括30g/L、45g/L和60g/L，优选磷酸二氢钾的浓度为45g/L。
本发明所用的底物为β-胸苷和鸟嘌呤，其中β-胸苷浓度为16.5g/L，鸟嘌呤所选的浓度为10.3g/L-18.0g/L，包括10.3g/L、15.2g/L和18.0g/L，优选浓度为15.2g/L；β-胸苷和鸟嘌呤摩尔比为1:1-2,包括1：1、1：1.5和1：2，优选的比例为1：1.5。
β-胸苷是目前五种脱氧核苷（2’-脱氧腺苷、2’-脱氧尿苷、2’-脱氧胞苷、2’-脱氧鸟苷和β-胸苷）中最易得、价廉的脱氧糖基供体，而鸟嘌呤相比于其它含鸟嘌呤结构的物质,如鸟苷、鸟苷酸或者2，6-二氨基嘌呤等，是最为直接、易得和价廉的脱氧核糖受体，因此，采用生物催化法制备2’-脱氧鸟苷，鸟嘌呤和β-胸苷作为初始底物是最理想的组合。
本发明的积极效果体现在：
（一）、该方法将双水相系统应用到生物催化制备2’-脱氧鸟苷的工艺中，解决以往鸟嘌呤在转化体系中溶解度低的瓶颈问题，可大大增加鸟嘌呤溶解度，大副度提高转化率。
（二）、本发明中的生物催化法生产2’-脱氧鸟苷，产率最大达到可达16.1g/L，β-胸苷转化率可达89％。
具体实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
由于产脱氧核苷核糖转移酶的菌株发酵乳杆菌CGMCC 1.1880（CGMCC为中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture CollectionCenter）的简称）的斜面培养基、种子培养基和发酵产酶培养基及培养条件采用本领域公知的技术，下面具体实施例菌采用统一的培养基及培养条件。
斜面培养基组成（g/L）以及培养条件：
葡萄糖糖5、酵母浸粉 10、磷酸氢二钾 1、七水硫酸镁 0.5、硫酸锰0.01，甘油 5、酶解酪蛋白胨 2、琼脂25 、pH值7.5；培养温度35℃、，培养24-48小时。
种子培养基组成（g/L）以及培养条件：
葡萄糖糖5、酵母浸粉 20、磷酸氢二钾 5、七水硫酸镁 0.15、甘油 10、蛋白胨 5、pH值7.5；培养温度35℃、，培养18-24小时。
发酵产酶培养基组成（g/L）以及培养条件：
葡萄糖糖10、酵母浸粉 25、磷酸氢二钾 2.5、磷酸二氢钾 0.5、七水硫酸镁 0.5、甘油 20、蛋白胨 15、氯化钠 5、七水硫酸锌 0.05、七水硫酸亚铁 0.05、鸟嘌呤 0.01、尿素0.1、氯化钙 0.05、乳糖 0.5、pH值7.5；培养温度35℃、，培养48-60小时。
实施例1：生物催化法合成2’-脱氧鸟苷
1）产酶菌体的收集与预处理
产酶菌株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum ) CGMCC 1.1880在上述公知的产酶培养条件下进行繁殖生长并富产脱氧核苷核糖转移酶，得1升产酶发酵液，采用离心（离心条件：6000转/分钟，离心20分钟），收集得到57克菌体浆状物，然后用500毫升去离子水将菌体重新制成菌悬液并搅拌10分钟进行洗涤菌体，然后再上述相同的离心条件离心收集菌体，得到53克洗涤后的菌体浆状物。然后用1升0.5M磷酸缓冲液（pH8.0）洗涤，再经同样条件离心得到50克菌体浆状物。该菌体浆状物即为制备2’-脱氧鸟苷的生物催化剂。
2）生物催化合成2’-脱氧鸟苷
先在2升反应器将用800毫升去离子水使25克聚乙醇10000（PEG 10000）溶解完全，然后一边搅拌一边加入30克磷酸二氢钾，溶解完全后，加入16.5克β-胸苷和10.3克鸟嘌呤，搅拌混合均匀。然后再加入步骤1）所得到50克菌体浆状物，同样搅拌使菌体分撒均匀。接着用去离子水定容至1升，最后用5M氢氧化钾溶液将转化体系的pH值调至8.0。pH值调节完毕后，置于水浴中，将反应温度升至40℃进行生物催化反应，反应过程中一直搅拌。反应36小时后，取样测定β-胸苷转化率和产物2’-脱氧鸟苷产率。测定方法采用高效液相色谱法（HPLC），其检测方法如下所示：
色谱柱：Diamonsil C18，5um， 250 x 4.6mm；流动相：甲醇：0.02mol磷酸钾缓冲盐=20：80；流速：0.8ml/min；检测波长：254nm
HPLC分析结果显示，β-胸苷转化率为72%，产物2’-脱氧鸟苷产率为13.1 g/L。
实施例2：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例1中PEG10000用PEG8000替换，其它条件均与实施例1相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为60%，产物2’-脱氧鸟苷产率为10.8 g/L。
实施例3：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例1中PEG10000用PEG4000替换，其它条件均与实施例1相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为46%，产物2’-脱氧鸟苷的产率为8.2 g/L。
实施例4：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例1中PEG10000用PEG15000替换，其它条件均与实施例1相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为65%，产物2’-脱氧鸟苷的产率为11.5 g/L。
实施例5：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例1中PEG10000用PEG20000替换，其它条件均与实施例1相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为35%，产物2’-脱氧鸟苷的产率为6.2 g/L。
实施例6：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例1中PEG10000浓度由25克/升提高至45克/升，其它条件均与实施例1相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为82%，产物2’-脱氧鸟苷的产率为14.8 g/L。
实施例7：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例1中PEG10000浓度由25克/升提高至55克/升，其它条件均与实施例1相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为69%，产物2’-脱氧鸟苷产率为12.3g/L。
实施例8：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例6中磷酸二氢钾浓度用磷酸二氢钠替换，其它条件均与实施例6相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为75%，产物2’-脱氧鸟苷产率为13.4 g/L。
实施例9：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例6中磷酸二氢钾浓度用磷酸二氢铵替换，其它条件均与实施例6相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为51%，产物2’-脱氧鸟苷产率为8.9 g/L。
实施例10：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例6中磷酸二氢钾浓度由30克/升提高至45克/升，其它条件均与实施例6相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为85%，产物2’-脱氧鸟苷产率为15.3 g/L。
实施例11：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例6中磷酸二氢钾浓度由30克/升提高至60克/升，其它条件均与实施例6相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为62%，产物2’-脱氧鸟苷产率为11.2 g/L。
实施例12：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例10中鸟嘌呤浓度由10.3克/升提高至15.2克/升，其它条件均与实施例10相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为89%，产物2’-脱氧鸟苷产率为16.1 g/L。
实施例13：生物催化法生产2’-脱氧鸟苷
将实施例10中鸟嘌呤浓度由10.3克/升提高至18.0克/升，其它条件均与实施例10相同，反应结束后，经HPLC分析显示，β-胸苷转化率为81%，产物2’-脱氧鸟苷产率为14.5 g/L。
Claims (2)
1.一种核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法，其特征在于：该方法以β-胸苷和鸟嘌呤为原料，在双水相转化体系中用生物催化法合成2’-脱氧鸟苷，所述的双水相转化体系选自聚乙二醇/磷酸盐体系；双水相转化体系中聚乙二醇选自PEG4000、PEG8000、PEG10000、PEG15000和PEG20000；双水相体系中磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和磷酸二氢铵；所选β-胸苷与鸟嘌呤的摩尔比为1：（1-2）；所述聚乙二醇的所选浓度为25g/L-55g/L；所述的磷酸盐的所选浓度为30g/L-60g/L。
2.根据权利要求1所述的核苷类药物中间体2’-脱氧鸟苷的生产方法，其特征在于：所选用脱氧核糖供体为β-胸苷，其所选浓度为16.5g/L；所选用脱氧核糖受体为鸟嘌呤，其所选浓度为10.3g/L-18.0g/L。
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