CN101294175A - 一种双水相水解体系制备低聚木糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双水相水解体系制备低聚木糖的方法，包括如下步骤：1.在水解槽中，配置聚乙二醇和硫酸铵体系，或聚乙二醇和葡聚糖体系的双水相系统；2.加入粗木聚糖溶液和木聚糖酶，进行酶水解反应；3.将反应液转入分配槽，静置成相后，下相经超滤膜分离，再经纳滤膜分离得低聚木糖；回收下相经超滤后的截留物，与上相合并，转入水解槽；4.对于原始聚乙二醇和硫酸铵体系的双水相系统，在水解槽中，再加入硫酸铵，形成双水相体系，返回步骤2；对于原始聚乙二醇和葡聚糖体系的双水相系统，直接返回步骤2。本发明技术利用双水相体系，回收利用木聚糖酶，提高了木聚糖酶的利用率，易于规模放大，操作简便，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种低聚木糖的制备方法，具体涉及一种将木聚糖酶水解的过程与双水相分离体系集成制备低聚木糖的方法。
背景技术
天然纤维素资源是地球上最丰富的可再生有机物质，在世界通过植物光合作用产生的生物量高达1000亿吨，其中只有11％用作农作物产品、饲料、造纸及建筑材料等，89％的天然纤维素资源则被自然界中的各种微生物降解，最终转化成二氧化碳和水。虽然这是自然界中重要的碳循环，但从原子经济角度来说，无疑是巨大的资源浪费。半纤维素作为天然纤维素资源的重要组成部分之一，是除纤维素以外最为丰富、最廉价的可再生资源。利用天然木质纤维素为原材料，制备功能性低聚木糖产品具有广阔的市场前景和商业价值。
低聚糖，又称寡糖，是由2～10个单糖分子通过糖苷键连接形成的直链或支链的糖类物质，其分子量约为300～2000道尔顿。低聚木糖是由2～10个木糖分子通过β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖，又称木寡糖。低聚木糖是功能性低聚糖家族中的一个重要成员，其甜度低于蔗糖和葡萄糖，约为蔗糖的40％，与麦芽糖的甜度相当。
低聚木糖具有显著的双歧杆菌增殖能力，可使双歧杆菌等有益菌群快速增殖，从而抑制肠道内有害菌群的生长；难于被消化吸收，不能被唾液、胰液、小肠绒毛腺均质液等分解；降低血清胆固醇和中性脂肪、防止老化和骨质疏松症，具有抗龋齿、防止便秘的效果，有利于口腔健康、清除肠道内毒素的特点；具有独特的酸与热稳定性和难发酵等优点，已被广泛应用于食品、医药保健品等诸多领域。
木聚糖是半纤维素的主要成分，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是自然界中最主要的可再生资源之一。木聚糖是一种杂合多聚分子，主链由β-1，4-糖苷键相连的β-D-吡喃型木糖残基聚合而成，侧链上连有多种不同大小短取代基。玉米芯、甘蔗渣、棉子壳以及稻麦等的秸秆中富含木聚糖，例如玉米芯中含有高达40％的木聚糖，且这些原料价廉易得，是制备低聚木糖的理想对象。
双水相生物催化技术的基本原理是利用两种不同高聚物的水溶液或一种高聚物与一种无机盐的水溶液，由于其浓度的不同，而形成互相不溶的两水相体系，调整其浓度可将反应物和生物催化剂分配于不同的水相中，有效地实现生化反应与产物的反应分离耦合。
当生物大分子(如生物活性的酶分子)进入双水相体系后，由于生物大分子的表面性质、电荷作用和不同分子间作用力，以及不同环境因素的影响，使其在两相间的分配浓度不同，表现较大或较小的分配系数。在生物催化过程中，双水相体系可以将反应物、产物以及酶分配于不同的水相中，最大限度地回收酶活力，同时提高催化反应的效率，简化操作过程，能耗低，处理量大，降低投资和费用，更重要的是易于过程放大，特别适合于工业化生物催化过程。
低聚木糖的制备方法有酸水解法、蒸汽爆破法、酶水解法和微波降解法，酸水解法、蒸汽爆破法与微波降解法等物理、化学方法，由于降解速度难以控制，精制过程繁琐，效率低等特点，不适合于低聚木糖的工业化生产。而酶水解法具有高效、条件温和、环境友好等优点，已经成为工业化生产低聚木糖的主要制备方法。目前，国内外主要采用黑曲霉、里氏木霉、链霉菌等天然产木聚糖酶的菌种，进行酶水解制备低聚木糖，其生物加工过程包括木聚糖的提取、木聚糖酶的制备、酶解木聚糖以及产品的精制等工艺。虽然酶水解法具有明显优点，但也存在着木聚糖酶回收利用率低、工艺步骤较多以及生物加工过程不易放大等问题。因此，提高木聚糖酶的回收利用率、降低低聚木糖的生产成本以及简化其规模放大过程就显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用双水相生物催化体系制备低聚木糖的生产方法，以提高木聚糖酶的回收利用率、降低低聚木糖的生产成本以及简化其规模放大过程。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种双水相水解体系制备低聚木糖的方法，包括如下步骤：
(1)在水解槽中，配置聚乙二醇和硫酸铵体系的双水相系统，或聚乙二醇和葡聚糖体系的双水相系统；
(2)加入粗木聚糖溶液和木聚糖酶，使双水相体系中木聚糖浓度达1～50g/L，木聚糖酶的加入量为5～50IU/g木聚糖，在pH4.0～8.0，30～60℃，搅拌转速100～300r/min下，酶水解反应2～12小时；
(3)将反应液转入分配槽，静置成相后，下相经截留分子量为1000～20000的超滤膜分离，再经截留分子量为150～500的纳滤膜分离得低聚木糖；回收下相经超滤后的截留物，与上相合并，转入水解槽；
(4)对于原始聚乙二醇和硫酸铵体系的双水相系统，在水解槽中，再加入硫酸铵，形成双水相体系，返回步骤(2)；对于原始聚乙二醇和葡聚糖体系的双水相系统，直接返回步骤(2)。
其中，双水相系统中，聚乙二醇的成相浓度范围重量百分比为1～50％，硫酸铵的成相浓度范围重量百分比为5～50％，葡聚糖的成相浓度范围重量百分比为5～50％。
上述聚乙二醇的分子量范围为1000～6000，葡聚糖的分子量范围为10000～50000。
步骤(2)中，所述的粗木聚糖溶液采用如下方法制备：
将木质纤维素类生物质经干燥、粉碎后，在20～40℃下，边加入碱溶液边搅拌；然后，在70～100℃下蒸煮1～5小时；过滤除固形物，收集蒸煮液；蒸煮液采用强酸中和至pH4.0～8.0；中和的蒸煮液采用超滤技术脱盐，得到浓缩的粗木聚糖液。其中，所述的木质纤维素类生物质为玉米芯、秸杆、甘蔗渣、桦木或杨木；所述的碱溶液可以为1～6mol/L的NaOH；所述的强酸为可以为1～6mol/L盐酸。
步骤(2)中，所述的木聚糖酶采用如下方法制备：
本发明所采用的木聚糖酶来源于重组毕赤酵母菌NL-OU，其制备方法为：重组毕赤酵母菌NL-OU经平板活化后，接种单菌落于摇瓶培养基中，在20～40℃、100～200r/min摇瓶培养12～72小时，至OD600达到2～10，得到种子液。将此种子液以5％～20％(v/v)接种至灭菌的甘油培养基中，在20～40℃，400～800r/min条件下，发酵培养约12～48小时至溶解氧上升大于50％。向罐中流加甘油溶液，流速15～35mL/(L·h)持续10～28小时，然后停止流加1～3小时，pH值控制在4.0～8.0左右，温度维持20～40℃。然后向罐中流加甲醇，流速1～10mL/(L·h)持续24～72小时，温度维持20～40℃，最后离心收集得到木聚糖酶粗酶液。摇瓶培养基组成：葡萄糖0.5％～5％(w/v)，蛋白胨1％～5％(w/v)，酵母膏0.5％～5％(w/v)。30％～70％(w/v)甘油培养基组成：甘油30％～70％(w/v)，CaSO4·2H2O 0.1％～5％(w/v)，MgSO4·7H2O 0.5％～10％(w/v)，K2SO40.5％～10％(w/v)，KOH 0.1％～5％(w/v)，氨水调pH值为4.0～8.0。
双水相体系的建立方法如下：
在室温条件下，取一定量1％～50％(w/w)浓度的聚乙二醇于10mL刻度离心管中，向刻度离心管中滴加5％～50％(w/w)浓度的硫酸铵或葡聚糖等溶液，在混合器上混匀，至出现混浊，记下此时加入溶液的质量。接着再逐滴加入去离子水，至混浊刚好消失时，记下加入去离子水的质量。算出聚乙二醇和硫酸铵或葡聚糖的百分含量，即为临界点含量。重复以上操作找出不同聚乙二醇浓度时的临界点。绘制出聚乙二醇/硫酸铵体系或聚乙二醇/葡聚糖体系的双水相相图。
本发明双水相水解制备低聚木糖的反应器如图1所示，该反应器装置及其工作原理为本技术领域内的常规技术。
本发明将木聚糖酶水解制备低聚木糖的过程与双水相体系合理地集成，不但提高了木聚糖酶的回收利用率，而且简化制备低聚木糖的工艺路线，降低了生产成本，为低聚木糖的生产及规模化制备提供了新思路和新工艺。
本发明与文献报道的低聚木糖制备或生产工艺相比，具有如下优点：
1.木聚糖酶利用率高。同时，由于聚乙二醇的存在，稳定和提高了木聚糖酶的酶活力。
2.简化酶水解过程，操作快速、方便。
3.双水相成相迅速，易于规模放大。
4.以玉米芯、秸杆、甘蔗渣、桦木和杨木等农林废弃物为原料，降低了生产成本。
附图说明
图1是本发明的双水相水解反应器的示意图。其中，1为水解槽，2为分配槽，3为超滤膜组件。
具体实施方式：
以下结合应用实施例对本发明作进一步的阐述。实施实例是为说明而非限制本发明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施实例不以任何方式限制本发明，可做适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。
实施例1：木聚糖酶的制备
本发明所采用的木聚糖酶来源于重组毕赤酵母菌NL-OU(欧阳嘉，王向明，张清，严明，许琳.里氏木霉木聚糖酶XYN II基因在毕赤酵母中的分泌表达.林产化学与工业，2007，27(5)：83-88)。其制备方法为：重组毕赤酵母菌NL-OU经平板活化后，接种单菌落于50mL摇瓶培养基中，在30℃、150r/min摇瓶培养48小时，至OD600达到2-6，得到种子液。将此种子液以10％(v/v)接种至灭菌的甘油培养基中，在28℃，600r/min条件下，发酵培养约20小时至溶解氧上升大于50％。向罐中流加甘油溶液，流速20mL/(L·h)持续12小时，然后停止流加3小时，pH值控制在5.0左右，温度维持28℃。然后向罐中流加甲醇，流速3mL/(L·h)持续30小时，温度维持28℃，最后离心收集得到木聚糖酶粗酶液。摇瓶培养基组成：葡萄糖1％(w/v)，蛋白胨1％(w/v)，酵母膏0.5％(w/v)。50％(w/v)甘油溶液组成：甘油50％(w/v)，CaSO4·2H2O 0.1％(w/v)，MgSO4·7H2O1％(w/v)，K2SO41.5％(w/v)，KOH 0.3％(w/v)，氨水调pH值为5.0。
实施例2：木聚糖的制备
将玉米芯经干燥、粉碎、过筛后得到1cm左右颗粒的原料。在25℃条件下，加入氢氧化钠和去离子水，边加边搅拌。然后，在90℃条件下蒸煮3小时。过滤除固形物，收集蒸煮液。蒸煮液采用强酸中和至pH5.0。中和的蒸煮液采用截留分子量为6000的超滤膜除盐，去除90％以上的无机盐和低分子化合物，得到浓缩的粗木聚糖液。
实施例3：双水相酶水解制备低聚木糖
在双水相水解反应器的水解槽中，加入浓缩的粗木聚糖溶液200mL(木聚糖浓度为20g/L)，加入150g聚乙二醇2000和100g硫酸铵，补充去离子水至总体系重量为1000g。聚乙二醇/硫酸铵体系中，聚乙二醇2000浓度为15％(w/w)，硫酸铵浓度为10％(w/w)。经过机械搅拌(150r/min)混匀后，加入200IU木聚糖酶粗酶液进行酶水解。在pH 5.0，温度为50℃，搅拌转速为150r/min条件下，酶水解反应4小时。然后，将酶水解液转到双水相水解反应器的分配槽中，静置60分钟即可完成成相。下相水溶液相采用截留分子量为2000的超滤膜分离出低聚木糖。同时，回收水相中残留的木聚糖和聚乙二醇2000，将回收的木聚糖和聚乙二醇2000与上相聚乙二醇2000相均泵入水解槽中，再加入粗木聚糖溶液和硫酸铵，进行新一轮水解制备低聚木糖过程。对于超滤透过的低聚木糖溶液中含有无机盐成份，采用截留分子量为150的纳滤膜除去95％无机盐，浓缩低聚木糖溶液。
实施例4：双水相酶水解制备低聚木糖
在双水相水解反应器的水解槽中，加入浓缩的粗木聚糖溶液200mL(木聚糖浓度为5g/L)，加入150g的聚乙二醇4000和110g硫酸铵，补充去离子水至总体系重量为1000g。聚乙二醇/硫酸铵体系中，聚乙二醇4000浓度为15％(w/w)，硫酸铵浓度为11％(w/w)。经过机械搅拌(150r/min)混匀后，加入20IU木聚糖酶粗酶液进行酶水解。在pH 5.0，温度为50℃，搅拌转速为150r/min条件下，酶水解反应4小时。然后，将酶水解液转到双水相水解反应器的分配槽中，静置60分钟即完成成相。下相水溶液相采用截留分子量为2000的超滤膜分离出低聚木糖。同时，回收水相中残留的木聚糖和聚乙二醇4000，将回收的木聚糖和聚乙二醇4000与上相聚乙二醇4000相均泵入水解槽中，再加入粗木聚糖溶液和硫酸铵，进行新一轮水解制备低聚木糖过程。对于超滤透过的低聚木糖溶液中含有无机盐成份，采用截留分子量为150的纳滤膜除去95％无机盐，同时得到浓缩的低聚木糖溶液。
实施例5：双水相酶水解制备低聚木糖
在双水相水解反应器的水解槽中，加入浓缩的粗木聚糖溶液200mL(木聚糖浓度为200g/L)，加入120g的聚乙二醇2000和150g葡聚糖50000，补充去离子水至总体系重量为1000g。聚乙二醇/葡聚糖体系中聚乙二醇2000浓度为12％(w/w)，葡聚糖浓度为15％(w/w)。经过机械搅拌(150r/min)混匀后，加入400IU木聚糖酶粗酶液进行酶水解。在pH 5.0，温度为50℃，搅拌转速为150r/min条件下，酶水解反应4小时。然后，将酶水解液转到双水相水解反应器的分配槽中，静置120分钟即完成成相。下相葡聚糖相采用截留分子量为2000的超滤膜分离出低聚木糖。同时，回收水相中残留的木聚糖、聚乙二醇2000和葡聚糖50000，将回收的木聚糖、聚乙二醇2000和葡聚糖50000与上相聚乙二醇2000相均泵入水解槽中，再加入粗木聚糖溶液，进行新一轮水解制备低聚木糖过程。对于超滤透过的低聚木糖溶液，采用截留分子量为150的纳滤膜浓缩，得低聚木糖溶液。
实施例6：双水相酶水解制备低聚木糖：
在双水相水解反应器的水解槽中，加入浓缩的粗木聚糖溶液200mL(木聚糖浓度为100g/L)，加入60g的聚乙二醇4000和180g葡聚糖20000，补充去离子水至总体系重量为1000g。聚乙二醇/葡聚糖体系中，聚乙二醇4000浓度为6％(w/w)，葡聚糖20000浓度为18％(w/w)。经过机械搅拌(150r/min)混匀后，加入1000IU木聚糖酶粗酶液进行酶水解。在pH 5.0，温度为50℃，搅拌转速为150r/min条件下，酶水解反应4小时。然后，将酶水解液转到双水相水解反应器的分配槽中，静置120分钟即可完成成相。下相葡聚糖相采用截留分子量为2000的超滤膜分离出低聚木糖。同时，回收水相中残留的木聚糖、聚乙二醇4000和葡聚糖20000，将回收的木聚糖、聚乙二醇4000和葡聚糖20000与上相聚乙二醇4000相均泵入水解槽中，再加入粗木聚糖溶液，进行新一轮水解制备低聚木糖过程。对于超滤透过的低聚木糖溶液，采用截留分子量为150的纳滤膜浓缩，得低聚木糖溶液。
Claims (6)
1、一种双水相水解体系制备低聚木糖的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)在水解槽中，配置聚乙二醇和硫酸铵体系的双水相系统，或聚乙二醇和葡聚糖体系的双水相系统；
(2)加入粗木聚糖溶液和木聚糖酶，使双水相体系中木聚糖浓度达1～50g/L，木聚糖酶的加入量为5～50IU/g木聚糖，在pH4.0～8.0，30～60℃，搅拌转速100～300r/min下，酶水解反应2～12小时；
(3)将反应液转入分配槽，静置成相后，下相经截留分子量为1000～20000的超滤膜分离，再经截留分子量为150～500的纳滤膜分离得低聚木糖；回收下相经超滤后的截留物，与上相合并，转入水解槽；
(4)对于原始聚乙二醇和硫酸铵体系的双水相系统，在水解槽中，再加入硫酸铵，形成双水相体系，返回步骤(2)；对于原始聚乙二醇和葡聚糖体系的双水相系统，直接返回步骤(2)。
2、根据权利要求1所述的双水相水解体系制备低聚木糖的方法，其特征在于形成的双水相体系中，聚乙二醇的成相浓度范围重量百分比为1～50％，硫酸铵的成相浓度范围重量百分比为5～50％，葡聚糖的成相浓度范围重量百分比为5～50％。
3、根据权利要求1或2所述的双水相水解体系制备低聚木糖的方法，其特征在于聚乙二醇的分子量范围为1000～6000。
4、根据权利要求1或2所述的双水相水解体系制备低聚木糖的方法，其特征在于葡聚糖的分子量范围为10000～50000。
5、根据权利要求1所述的双水相水解体系制备低聚木糖的方法，其特征在于步骤(2)中所述的粗木聚糖溶液采用如下方法制备：将木质纤维素类生物质经干燥、粉碎后，在20～40℃下，边加入碱溶液边搅拌；然后，在70～100℃下蒸煮1～5小时；过滤除固形物，收集蒸煮液；蒸煮液采用强酸中和至pH4.0～8.0；中和的蒸煮液采用超滤技术脱盐，得到浓缩的粗木聚糖液。
6、根据权利要求5所述的双水相水解体系制备低聚木糖的方法，其特征在于所述的木质纤维素类生物质为玉米芯、秸杆、甘蔗渣、桦木或杨木。
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Effective date of registration: 20130723 Address after: 810000 Qinghai biological science and Technology Industrial Park, Qinghai, Xining Patentee after: WEIDE (QINGHAI) BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Address before: Nanjing City, Jiangsu province 210037 Longpan road Xinzhuang No. 9 Patentee before: Nanjing Forestry University |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: QINGHAI WEIDE SPECIAL SUGAR CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: QINGHAI WEIDE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20150611 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150611 Address after: 810016 Xining Biological Park, Qinghai Road, No. four, No. 10 Patentee after: QINGHAI WEIDE SPECIAL SUGAR CO., LTD. Address before: 810000 Qinghai biological science and Technology Industrial Park, Qinghai, Xining Patentee before: WEIDE (QINGHAI) BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
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| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 810016 Xining Biological Park, Qinghai Road, No. four, No. 10 Patentee after: Dragon special Sugar Co. Address before: 810016 Xining Biological Park, Qinghai Road, No. four, No. 10 Patentee before: QINGHAI WEIDE SPECIAL SUGAR CO., LTD. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 810000 Xining biological science and Technology Industrial Park, Xining, Qinghai Province, No. 10 Patentee after: Van Neng special sugar industry Co., Ltd. Address before: 810016 Xining Biological Park, Qinghai Road, No. four, No. 10 Patentee before: Dragon special Sugar Co. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110831 Termination date: 20180620 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |