CN102250866A - 一种拟水相载体固定化木聚糖酶及利用其制备低聚木糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟水相载体固定化木聚糖酶，由如下步骤制备得到：将单甲氧基聚乙二醇与活化剂反应，得到烷氧基醇活化酯；将木聚糖酶与烷氧基醇活化酯反应制备拟水相载体固定化木聚糖酶，再经凝胶过滤色谱纯化、冷冻干燥即得。本发明还公开了利用上述拟水相载体固定化木聚糖酶制备低聚木糖的方法。本发明的优点在于：水溶性载体固定化酶与不溶性底物之间的有效接触，呈现均相催化反应，提高转化效率；烷氧基醇具有稳定酶的作用，保证固定化酶维持高酶活力；利用烷氧基醇的成两水相特征，自萃取回收固定化酶，实现拟水相载体固定化酶、底物、产物的自主分离；转化过程的可控性，使生成的低聚木糖聚合度分布更为合理，提高产品品质。

Description

一种拟水相载体固定化木聚糖酶及利用其制备低聚木糖的方法

技术领域

本发明涉及一种木聚糖酶的固定化方法，具体涉及一种利用拟水相载体固定化木聚糖酶及利用其制备低聚木糖的方法。

背景技术

木聚糖酶是一类O-糖苷水解酶(EC 3.2.1.X)，专门随机内切木聚糖1，4-β-D-木糖苷键。由于半纤维素或木聚糖是第二大天然多聚糖，因此自然界中存在多种生物分泌可分解木聚糖的酶，如：细菌、藻类、真菌、原生动物、腹足动物等。

木聚糖酶的固定化早于1985年就有文献报道，Jerzy Rogalski等人将土曲霉产木聚糖酶固定于玻璃珠上。木聚糖酶固定化技术，按照固定化原理分类，可分为吸附法、包埋法、共价法、亲和法、融合法、微囊法以及组合法等方法。

木聚糖酶固定化中所用载体材料，可分为不可溶性载体、可溶性载体以及融合载体，其中不可溶性载体如壳聚糖、海藻酸钠、离子交换树脂、环氧载体、葡聚糖、聚磺酸膜等；可溶性载体如Eudragit L-100、Eudragit S-100等；融合载体如植物种子油等。

国内外近二十年中，木聚糖酶载体固定化的研究主要集中于吸附法、共价法、亲和法，另有少量研究包埋法、融合法和组合方法固定木聚糖酶。早期研究中多以不可溶性载体随机固定木聚糖酶，如国内最早报道朱启忠应用壳聚糖作为随机共价固定化木聚糖酶，热稳定性优于游离酶；Jerzy Rogalski等人利用玻璃珠为载体，固定土曲霉(Aspergillusterreus)产木聚糖酶；Severian Dumitriu等人以壳聚糖-黄原胶的水凝胶为载体，吸附固定绿色木霉的木聚糖酶。这固定化技术多注重木聚糖酶酶活的回收，但缺少实际应用和相关的操作稳定性和储存稳定性研究，体现不出固定化酶的优越性。限制原因主要在于木聚糖酶的反应底物(大分子木聚糖)自身突出特点--不溶解性，这一先天瓶颈限制了木聚糖酶的固定化应用，不利于固定化木聚糖酶对木聚糖的接触。

为了克服固定化木聚糖酶与木聚糖之间的可及性问题，研究人员试图寻找即可以解决可及性问题，又满足酶回收的固定化技术。印度的Meryam Sardar、I.Roy、Ruchi Gaur等人采用甲基丙烯酸和甲基丙烯酰甲酯聚合物作为固定化载体，随机吸附固定化木聚糖酶。此类聚合物是一类溶解性可逆的智能聚合物，通过调节溶液pH值的方式，控制智能聚合物的可逆溶解。正是利用该聚合物独特的可逆溶解性，可作为木聚糖酶固定化载体(如Eudragit L-100)，在溶液pH值高于4.0时，溶解于水相中，使固定化酶与不溶性底物充分接触，保证良好的扩散特性，利于生物催化反应；当溶液pH值低于4.0时，智能聚合物呈现不溶特性，从溶液中析出，利于酶的回收。类似固定化技术研究，国内较晚一些，中国农业大学的李里特、艾志录和广西植物研究所的周玉恒等人应用可逆溶解智能聚合物(如Eudragit S-100和L-100)随机固定化木聚糖酶，酶活回收率水平较高，且热稳定性显著提高，重复使用4～6次。但此类固定化木聚糖酶的应用过程中，仍然存在不溶性底物对固定化酶的非特异性吸附问题，造成固定化酶较大的损失，这也限制了此类固定化木聚糖酶的应用。

低聚木糖，又称木寡糖，是由2～10个木糖分子通过β-1，4-糖苷键连接的低聚糖，其甜度低于蔗糖和葡萄糖。低聚木糖具有显著的增殖肠道内双歧杆菌的能力，可使肠道内双歧杆菌等有益细菌快速繁殖，进而抑制肠道内有害菌群的繁殖；也具备优良的保健功能。因此，低聚木糖广泛应用于食品、医药保健品、饲料添加剂等诸多领域。

我国是一个农林废弃物资源丰富的国家，每年的可再生农林废弃物总量达到6～8亿吨，其中的半纤维素成分含量丰富，例如玉米芯中的木聚糖含量高达40％。这些原料价廉易得，又可变废为宝，是理想的低聚木糖的生产原料。

目前，低聚木糖主要的工业化生产方法是采用化学-游离酶水解法，由黑曲霉、里氏木霉、链霉菌等产木聚糖酶菌种生产木聚糖酶，采用化学法从农林废弃物中提取粗木聚糖，再由木聚糖酶水解制备低聚木糖。该方法的主要存在木聚糖酶的回收利用率低、酶活稳定性差、产品中不同聚合度低聚木糖分布不均和工艺过程复杂等问题。

与游离酶相比，固定化酶的优势在于既保持高效、专一、温和的酶催化反应特性的同时，又具有高稳定性、分离回收容易、多次重复使用、操作的连续可控性以及工艺简便等优点。然而，木聚糖是一类不溶于水的生物大分子，常规的固定化木聚糖酶也是一类不溶于水的固体，由于存在着空间位阻，使木聚糖和固定化酶之间的接触有限，扩散困难，导致水解得率非常低。同时，固定化酶与木聚糖混合在一起，不利于固定化酶的回收再利用。因此，提高固定化酶与不溶性底物之间的可及性，提高木聚糖酶的回收利用率，合理分布不同聚合度成分，提高产品品质，降低生产成本，简化工艺过程就显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种拟水相载体固定化木聚糖酶，以提高固定化酶与不溶性底物之间的可及性，且提高木聚糖酶的回收利用率。

本发明还要解决的技术问题是提供利用上述拟水相载体固定化酶自萃取生物转化制备低聚木糖的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种拟水相载体固定化木聚糖酶，其由如下步骤制备得到：

(1)将单甲氧基聚乙二醇与活化剂反应，得到烷氧基醇活化酯；

(2)将木聚糖酶与步骤(1)得到的烷氧基醇活化酯反应制备拟水相载体固定化木聚糖酶，再经凝胶过滤色谱纯化、冷冻干燥即得。

步骤(1)中，所述的单甲氧基聚乙二醇分子量范围为1000～6000，优选4000～6000。

步骤(1)中，所述的活化剂为N，N’-羰基二咪唑。

步骤(1)中，单甲氧基聚乙二醇与活化剂的质量比为1∶1～100，优选1∶70～100，反应在有机溶剂中进行，所述的有机溶剂优选为N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃，反应温度为5～100℃，优选30～60℃，反应时间为1～48小时，优选12～30小时。

步骤(1)中，反应结束后，可加冰乙醚沉淀，用氯仿或二氯甲烷溶解，重复溶解、沉淀2～4次，得白色粉末，真空干燥，得到的烷氧基醇活化酯可置于0～10℃下避光备用。

步骤(2)中，木聚糖酶与步骤(1)得到的烷氧基醇活化酯，木聚糖酶酶活力IU(国际标准单位IU定义：在25℃下，每分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量定义为一个酶活力单位IU)与烷氧基醇活化酯质量g比值为20～2000∶1，优选800～1400∶1，反应在磷酸盐缓冲溶液中进行，磷酸盐缓冲液的pH值为4.0～8.0，优选4.5～6.5，反应温度为0～80℃，优选15～40℃，反应时间为0.5～48小时，优选10～30小时。

利用上述拟水相载体固定化木聚糖酶制备低聚木糖的方法，包括如下步骤：

(1)在磷酸盐缓冲溶液中加入粗木聚糖，搅拌条件下使体系混合均匀；

(2)向步骤(1)得到的体系中加入拟水相载体固定化木聚糖酶，拟水相载体固定化木聚糖酶的加入量为10～100IU/g粗木聚糖，优选30～80IU/g粗木聚糖，再向上述体系中加入聚乙二醇使得聚乙二醇的质量百分比浓度为5～50％，优选8～20％，固定化酶水解反应2～24小时，优选4～16小时；

(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入柠檬酸三钠，使柠檬酸三钠的质量百分比浓度为5～50％，优选10～25％，搅拌均匀后，静置或离心，使体系形成液体-液体-固体的上、中、下三相体系；

(4)三相分离后，中相液体经超滤膜回收残留的拟水相载体固定化木聚糖酶和聚乙二醇，超滤透过液经纳滤膜脱盐和浓缩，干燥后，得到聚合度为2～10的低聚木糖成品。

步骤(1)中，所述的磷酸盐缓冲溶液pH值为4.0～8.0，优选4.5～6.5，粗木聚糖的重量百分比浓度为0.5～10％，优选1～5％，混合温度为40～80℃，优选45～65℃，搅拌条件优选为80～500r/min，搅拌15min。

步骤(1)中，聚乙二醇的分子量范围为1000～6000，聚乙二醇的分子量与拟水相载体固定化木聚糖酶制备过程中使用的单甲氧基聚乙二醇的分子量相同。

步骤(3)中，静置时间为6小时以上，离心条件为1500～10000r/min离心15～60分钟。

步骤(4)中，超滤膜的截留分子量为1000～6000，纳滤膜的截留分子量为100～300。

本发明所用的木聚糖酶可采用如下方法制备得到，但本发明不限于该方法制备得到的木聚糖酶，通过任何现有的技术手段制备得到的木聚糖酶或者市场上直接购买得到的木聚糖酶都可以实现本发明。

本发明优选的一种方式是：所采用的木聚糖酶来源于重组毕赤酵母菌(CCTCC NO：M 209148)，其制备方法为：重组毕赤酵母菌经平板活化后，接种单菌落于摇瓶培养基中，在20～40℃、100～200r/min摇瓶培养12～72小时，至OD₆₀₀达到2～10，得到种子液。将此种子液以5％～20％(v/v)接种至灭菌的甘油培养基中，在20～40℃，400～800r/min条件下，发酵约12～48小时至溶解氧上升大于50％。向罐中流加甘油培养基，流速15～35mL/(L·h)持续10～28小时，然后停止流加1～3小时，pH值控制在4.0～8.0左右，温度维持20～40℃。然后向罐中流加甲醇，流速1～10mL/(L·h)持续24～72小时，温度维持20～40℃，最后离心收集得到木聚糖酶粗酶液。摇瓶培养基组成(g/mL)：葡萄糖0.5％～5％，蛋白胨1％～5％，酵母膏0.5％～5％。甘油培养基组成：甘油30％～70％，CaSO₄·2H₂O0.1％～5％，MgSO₄·7H₂O 0.5％～10％，K₂SO₄ 0.5％～10％，KOH 0.1％～5％，氨水调pH值为4.0～8.0。

本发明所用的粗木聚糖可采用如下方法制备得到，但本发明不限于该方法制备得到的粗木聚糖，通过任何现有的技术手段制备得到的粗木聚糖或者市场上直接购买得到的粗木聚糖都可以实现本发明。

本发明优选的一种方式是：所采用的粗木聚糖制备方法如下：将木质纤维原料经干燥、粉碎、过筛，留0.1～1厘米左右颗粒，在20～40℃下，边加入碱溶液边搅拌；在70～100℃下，蒸煮1～5小时；过滤去除固形物，收集蒸煮液；蒸煮液采用强酸中和至pH低于8.0，得固体沉淀，水洗至中性后，干燥，得粗木聚糖。其中，所述的木质纤维原料为玉米芯、玉米秸杆、麦秆、桦木、杨木；所述的碱溶液可以为1～6mol/L的NaOH；所述的强酸为可以为1～6mol/L盐酸或硫酸。

本发明的思路为：将木聚糖酶共价固定于高亲水性的烷氧基醇(单甲氧基聚乙二醇)，制备成拟水相载体固定化木聚糖酶，利用该固定化酶的高亲水性及亲水性高分子聚合物稳定酶分子空间构象的特征，提高了固定化酶与不溶性木聚糖之间的有效接触(即可及性问题)和固定化酶的稳定性，避免了常规的水不溶性载体固定化酶与不溶性底物之间难于接触和固定化酶易失活的问题。同时，高亲水性的烷氧基醇与柠檬酸三钠之间的相互作用，在一定浓度条件下呈现盐析效应，易形成两不相容水相，上相富含亲水性高分子聚合物，下相富含柠檬酸三钠。基于此原理，调节体系中烷氧基醇和柠檬酸三钠的浓度，使拟水相载体固定化酶富集中于上相中，水解产物富集于中相中，而不溶性木聚糖形成以固体为主的下相，实现了拟水相载体固定化酶的自萃取回收，与产物和不溶性木聚糖之间的高效分离。

有益效果：本发明将木聚糖酶固定于拟水相载体上，利用拟水相载体固定化的木聚糖酶水解源于木质纤维原料的粗木聚糖制备低聚木糖，利用拟水相载体固定化酶的自萃取性质，实现固定化酶、产物和不溶性底物的有效分离。本发明所提供的拟水相载体固定化酶及其自萃取生物转化制备低聚木糖的方法，具有提高固定化酶与不溶性底物之间的可及性，维持固定化酶的稳定性，提高木聚糖酶的回收利用率，合理分布不同聚合度成分，降低生产成本，简化工艺过程等优点。

附图说明

图1为经本发明方法制备得到的聚合度分布合理的低聚木糖的HPLC图。其中，X1-木糖；X2-木二糖；X3-木三糖；X4-木四糖；X5-木五糖；X6-木六糖；X7-木七糖；X8-木八糖；X9-木九糖；X10-木十糖。

图2为固定化酶回收利用10次的酶活力回收率统计。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：木聚糖酶的制备。

本发明所采用的木聚糖酶来源于重组毕赤酵母菌(CCTCC NO：M 209148)。其制备方法为：重组毕赤酵母菌经平板活化后，接种单菌落于50mL摇瓶培养基中，在30℃、150r/min摇瓶培养48小时，至OD₆₀₀达到2-6，得到种子液。将此种子液以10％(v/v)接种至灭菌的甘油培养基中，在28℃，600r/min条件下，发酵培养约20小时至溶解氧上升大于50％。向罐中流加甘油溶液，流速20mL/(L·h)持续12小时，然后停止流加3小时，pH值控制在5.0左右，温度维持28℃。然后向罐中流加甲醇，流速3mL/(L·h)持续30小时，温度维持28℃，最后离心收集得到木聚糖酶粗酶液。摇瓶培养基组成：葡萄糖1％(w/v)，蛋白胨1％(w/v)，酵母膏0.5％(w/v)。50％(w/v)甘油溶液组成：甘油50％(w/v)，CaSO₄·2H₂O 0.1％(w/v)，MgSO₄·7H₂O 1％(w/v)，K₂SO₄ 1.5％(w/v)，KOH 0.3％(w/v)，氨水调pH值为5.0。

实施例2：粗木聚糖的制备。

将玉米芯经干燥、粉碎、过筛，留0.5厘米左右颗粒，在25℃下，边加入碱溶液边搅拌；在90℃下，蒸煮3小时；过滤去除固形物，收集蒸煮液；蒸煮液采用强酸中和至pH值为8.0，得固体沉淀，水洗至中性后，干燥，得粗木聚糖。

实施例3：烷氧基醇活化酯的制备。

将单甲氧基聚乙二醇(分子量4000)与N，N’-羰基二咪唑按质量比1∶90混合，加入四氢呋喃溶解，通入氮气去除反应体系中的氧气，在40℃条件下，反应24小时，加入冰冻乙醚沉淀，加入氯仿溶解，重复溶解、沉淀3次，得到白色粉末，真空干燥3h。在4℃下，真空干燥、避光保存。

实施例4：烷氧基醇活化酯的制备。

将单甲氧基聚乙二醇(分子量1000)与N，N’-羰基二咪唑按质量比1∶1混合，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，通入氮气去除反应体系中的氧气，在5℃条件下，反应48小时，加入冰冻乙醚沉淀，加入氯仿溶解，重复溶解、沉淀2次，得到白色粉末，真空干燥3h。在10℃下，真空干燥、避光保存。

实施例5：烷氧基醇活化酯的制备。

将单甲氧基聚乙二醇(分子量6000)与N，N’-羰基二咪唑按质量比1∶100混合，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，通入氮气去除反应体系中的氧气，在100℃条件下，反应1小时，加入冰冻乙醚沉淀，加入二氯甲烷溶解，重复溶解、沉淀3次，得到白色粉末，真空干燥3h。在0℃下，真空干燥、避光保存。

实施例6：拟水相载体固定化木聚糖酶的制备。

将木聚糖酶与实施例3制备得到的烷氧基醇活化酯按酶活力(IU)质量(g)比20∶1混合于pH值为4.0的磷酸盐缓冲溶液中。温度在0℃，反应48小时，经Sephadex G75凝胶层析纯化，冷冻干燥后，得到白色的拟水相载体固定化木聚糖酶。

实施例7：拟水相载体固定化木聚糖酶的制备。

将木聚糖酶与实施例3制备得到的烷氧基醇活化酯按酶活力(IU)质量(g)比1000∶1混合于pH值为5.6的磷酸盐缓冲溶液中。温度在25℃范围内，反应24小时，经SephadexG75凝胶层析纯化，冷冻干燥后，得到白色的拟水相载体固定化木聚糖酶。

实施例8：拟水相载体固定化木聚糖酶的制备。

将木聚糖酶与实施例3制备得到的烷氧基醇活化酯按酶活力(IU)质量(g)比2000∶1混合于pH值为8.0的磷酸盐缓冲溶液中。温度在80℃范围内，反应0.5～1小时，经Sephadex G75凝胶层析纯化，冷冻干燥后，得到白色的拟水相载体固定化木聚糖酶。

实施例9：拟水相载体固定化木聚糖酶自萃取生物转化制备低聚木糖。

在pH值为4.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入粗木聚糖，使体系中木聚糖质量百分浓度为0.5％，在40℃，80r/min条件下，搅拌15min，使体系混合均匀；加入实施例8制备得到的拟水相载体固定化木聚糖酶，固定化酶的加入量为10IU/g粗木聚糖，再向上述体系中加入聚乙二醇(分子量4000)使得聚乙二醇的质量百分比浓度为5％，固定化酶水解反应2小时；反应结束后，向体系中加入柠檬酸三钠，使柠檬酸三钠的质量百分比浓度为50％，搅拌均匀后，在1500r/min条件下，离心30分钟，使体系形成液体-液体-固体的上、中、下三相系统；三相分离后，中相液体经截留分子量为3000的超滤膜回收残留的固定化酶和聚乙二醇，超滤透过液经截留分子量为150的纳滤膜脱盐和浓缩，喷雾干燥后，得到聚合度为2～10的低聚木糖成品。低聚木糖得率为34％，酶活力回收率为98.5％(酶活力回收率是基于酶水解开始时，加入到反应体系中的总酶活，以下相同)。

实施例10：拟水相载体固定化木聚糖酶自萃取生物转化制备低聚木糖

在pH值为5.6的磷酸盐缓冲溶液中，加入粗木聚糖，使体系中木聚糖质量百分浓度为5％，在50℃，250r/min条件下，搅拌15min，使体系混合均匀；加入实施例7制得的拟水相载体固定化木聚糖酶，固定化酶的加入量为40IU/g木聚糖，再向上述体系中加入聚乙二醇(分子量4000)使得聚乙二醇的质量百分比浓度为13％，固定化酶水解反应12小时；反应结束后，向体系中加入柠檬酸三钠，使柠檬酸三钠的质量百分浓度为18％，搅拌均匀后，静置24小时，使体系形成液体-液体-固体的上、中、下三相系统；三相分离后，中相液体经截留分子量为3000的超滤膜回收残留的固定化酶和聚乙二醇，超滤透过液经截留分子量为150的纳滤膜脱盐和浓缩，喷雾干燥后，得到聚合度为2～10的低聚木糖成品，成品中各低聚木糖的分布见图1。低聚木糖得率为38％，酶活力回收率为99.7％。

实施例11：拟水相载体固定化木聚糖酶自萃取生物转化制备低聚木糖

在pH值为8.0的磷酸盐缓冲溶液中，加入粗木聚糖，使体系中木聚糖质量百分浓度为10％，在80℃，500r/min条件下，搅拌15min，使体系混合均匀；加入实施例6制得的拟水相载体固定化木聚糖酶，固定化酶的加入量为100IU/g木聚糖，再向上述体系中加入聚乙二醇(分子量4000)使得聚乙二醇的质量百分比浓度为50％，固定化酶水解反应24小时；反应结束后，向体系中加入柠檬酸三钠，使柠檬酸三钠的质量百分浓度为5％，搅拌均匀后，在10000r/min条件下，离心60分钟，使体系形成液体-液体-固体的上、中、下三相系统；三相分离后，中相液体经截留分子量为3000的超滤膜回收残留的固定化酶和聚乙二醇，超滤透过液再经截留分子量为150的纳滤膜脱盐和浓缩，喷雾干燥后，得到聚合度为2～10的低聚木糖成品。低聚木糖得率为36％，酶活力回收率为99.1％。

实施例12：

实施例10中，三相分离后，中相液体经截留分子量为3000的超滤膜回收残留的固定化酶和聚乙二醇。将截留液体与上相液体充分混合后，加入粗木聚糖，使体系中木聚糖质量百分浓度为5％，在50℃，250r/min条件下，搅拌15min，使体系混合均匀，进行固定化酶水解反应；反应结束后，向体系中加入柠檬酸三钠，使柠檬酸三钠的质量百分浓度为18％，搅拌均匀后，静置24小时，使体系形成液体-液体-固体的上、中、下三相系统，以此再重复9次固定化酶的回收，每次酶活力回收率见图2。

比较例：

在pH值为5.6的磷酸盐缓冲溶液中，加入粗木聚糖，使木聚糖质量百分浓度为5％，在50℃，250r/min条件下，搅拌15min，使体系混合均匀；加入游离木聚糖酶，游离木聚糖酶的加入量为40IU/g木聚糖，酶水解反应12小时；反应结束后，在10000r/min条件下，离心60分钟，固液分离。上清液喷雾干燥后，得低聚木糖成品。低聚木糖得率为40％。因游离酶与低聚木糖混合在一起，故无法实现酶回收，酶活力回收率为0。

Claims (10)

1.一种拟水相载体固定化木聚糖酶，其特征在于，其由如下步骤制备得到：

(1)将单甲氧基聚乙二醇与活化剂反应，得到烷氧基醇活化酯；

(2)将木聚糖酶与步骤(1)得到的烷氧基醇活化酯反应制备拟水相载体固定化木聚糖酶，再经凝胶过滤色谱纯化、冷冻干燥即得。

2.根据权利要求1所述的拟水相载体固定化木聚糖酶，其特征在于，步骤(1)中，所述的单甲氧基聚乙二醇分子量范围为1000～6000。

3.根据权利要求1所述的拟水相载体固定化木聚糖酶，其特征在于，步骤(1)中，所述的活化剂为N，N’-羰基二咪唑。

4.根据权利要求1所述的拟水相载体固定化木聚糖酶，其特征在于，步骤(1)中，单甲氧基聚乙二醇与活化剂的质量比为1∶1～100，反应在有机溶剂中进行，反应温度为5～100℃，反应时间为1～48小时。

5.根据权利要求1所述的拟水相载体固定化木聚糖酶，其特征在于，步骤(2)中，木聚糖酶与步骤(1)得到的烷氧基醇活化酯，木聚糖酶酶活力(IU)与烷氧基醇活化酯质量(g)比值为20～2000∶1，反应在磷酸盐缓冲溶液中进行，反应温度为0～80℃，反应时间为0.5～48小时。

6.利用权利要求1所述的拟水相载体固定化木聚糖酶制备低聚木糖的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)在磷酸盐缓冲溶液中加入粗木聚糖，搅拌条件下使体系混合均匀；

(2)向步骤(1)得到的体系中加入拟水相载体固定化木聚糖酶，拟水相载体固定化木聚糖酶的加入量为10～100IU/g粗木聚糖，再向上述体系中加入聚乙二醇使得聚乙二醇的质量百分比浓度为5～50％，固定化酶水解反应2～24小时；

(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入柠檬酸三钠，使柠檬酸三钠的质量百分比浓度为5～50％，搅拌均匀后，静置或离心，使体系形成液体-液体-固体的上、中、下三相体系；

(4)三相分离后，中相液体经超滤膜截留残留的拟水相载体固定化木聚糖酶和聚乙二醇，超滤透过液经纳滤膜脱盐和浓缩，干燥后，得到聚合度为2～10的低聚木糖成品。

7.根据权利要求6所述的利用拟水相载体固定化木聚糖酶制备低聚木糖的方法，其特征在于，步骤(1)中，粗木聚糖的重量百分比浓度为0.5～10％，混合温度为40～80℃。

8.根据权利要求6所述的利用拟水相载体固定化木聚糖酶制备低聚木糖的方法，其特征在于，步骤(1)中，聚乙二醇的分子量范围为1000～6000，聚乙二醇的分子量与拟水相载体固定化木聚糖酶制备过程中使用的单甲氧基聚乙二醇的分子量相同。

9.根据权利要求6所述的利用拟水相载体固定化木聚糖酶制备低聚木糖的方法，其特征在于，步骤(3)中，静置时间为6小时以上，离心条件为1500～10000r/min离心15～60分钟。

10.根据权利要求6所述的利用拟水相载体固定化木聚糖酶制备低聚木糖的方法，其特征在于，步骤(4)中，超滤膜的截留分子量为1000～6000，纳滤膜的截留分子量为100～300。

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