CN101899479B - 利用农林废弃物制备木糖醇的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用农林废弃物制备木糖醇的生产方法，包括以下步骤：对农林废弃物原料进行粉碎、除尘、水洗预处理；对得到的农林废弃物颗粒进行浸泡处理；对处理过的农林废弃物颗粒进行高温蒸煮处理；对处理后得到的体系进行中和或过中和处理；对处理后得到的体系进行固液分离，得到的液体成分进行活性炭或离子交换树脂的脱色脱毒处理；对处理后的液体成分进行浓缩处理，得到较高浓度的蒸煮液用于木糖醇发酵；筛选和选育出以为底物发酵生产木糖醇的高产菌株；发酵生产木糖醇。本发明是一条生产木糖醇的新型清洁工艺，工艺较为简单，易于操作，有利于产品的纯化及产品质量的控制。

Description

利用农林废弃物制备木糖醇的生产方法

技术领域

本发明涉及一种利用农林废弃物制备木糖醇的清洁生产方法，尤其利用高温蒸煮新型工艺制备玉米芯等农林废弃物半纤维素水解液来发酵生产木糖醇的方法。 

背景技术

木糖醇分子式为C₅H₁₂O₅，分子量152.15。极易溶于水，溶解度1.6kg/L，微溶于乙醇和甲醇，熔点92-96℃且热稳定性较高，常压下沸点为216℃。木糖醇成品为白色结晶或结晶性粉末，味甜，甜度相当于蔗糖。1克木糖醇全部代谢产生为4.06卡的热量，与葡萄糖相当。溶解热为-145.6J/g，故以固体形式食用时在口中会产生愉快的清凉感。10％的木糖醇水溶液pH值5.0-7.0。酸稳定的pH范围较宽，玻璃化温度较低，适宜长时间储藏和保存。 

农林废弃物如玉米芯是生产木糖醇的原料，利用农业废弃物制备半纤维素水解液发酵生产木糖醇已经成为一个较新的生产工艺。我国的农林资源非常丰富，在生物法生产木糖醇中，使用的最多的是原料植物半纤维素的水解液，如玉米芯、硬木、秸秆、棉籽壳、甘蔗渣等的半纤维素制得的水解物。我国每年产的玉米芯达到1000多万吨，尤其适合作为生产木糖醇的原料。但目前我国的农林废弃物利用率却十分低，基本被焚烧或扔掉，造成资源极大的浪费。利用农林废弃物如玉米芯资源开发木糖醇深加工项目，通过深加工增值，把农林副产品的深度开发引入市场经济的良性循环轨道，促进市场的繁荣和发展。它不仅有较高的直接经济效益，而且具有非常可观的社会效益。 

目前，传统的木糖醇工业化生产均采用传统的化学法，由于化学法需要利用纯净的木糖为底物，在高温高压下，利用对纯度要求很高的镊催化剂以及易 燃易爆的高压氢气下进行的，其过程工艺复杂、安全性差、成本高、环境污染严重，每生产1吨木糖醇，废水排放量为300-500吨，且处理难度大。该行业与我国发展可持续、可循环、节能减排的工业目标不相符，成为目前国家严格限制发展的行业。鉴于化学法生产木糖醇高耗电、高耗气、高耗水、高排污的情况。自1966年，Onishi和Suzuki首次报道了酵母菌能够将D-木糖转化为木糖醇后，国际上许多学者开展了发酵法生产木糖醇的研究，利用生物法生产木糖醇已成为未来木糖醇工业发展的必然趋势，在一定范围内降低了化学法生产木糖醇的污染和能耗。但该生产工艺中木糖的生产过程，国内外工业生产主要采用酸或碱水解半纤维素原料的方法来制备，每生产1吨木糖要排放超过300吨的废水，废水排放量未见显著降低，所以利用该生产工艺生产木糖醇仍然受到国家环保指标的严格限制。并且该工艺结晶制备木糖过程中，木糖收率约为50％，木糖损失量较大，采用发酵法省去了木糖结晶工序，提高了木糖利用度。 

发明内容

为了解决目前木糖醇制备方法中存在的上述问题，本发明采用高温蒸煮法降解玉米芯等农林废弃物中的半纤维素原料来生产木糖液，进而通过微生物产酶催化加氢将粗木糖液直接转化为木糖醇，极大的提高农产品的附加值，增加农民收入，把农林资源优势转化为商品经济优势。该方法能高效地利用玉米芯或棉籽壳等农林废弃物来生产木糖醇，同时也能有效解决现有木糖醇工业生产中存在的高污染，高能耗，回收率不高等问题。 

本发明玉米芯蒸煮液发酵生产木糖醇的方法包括以下步骤： 

(1)对农林废弃物原料进行粉碎、除尘、水洗预处理； 

(2)对(1)得到的农林废弃物颗粒进行浸泡处理； 

(3)对(2)处理过的农林废弃物颗粒进行高温蒸煮处理； 

(4)对(3)处理后得到的体系进行中和或过中和处理；对处理后得到的体系进行固液分离，得到的液体成分进行活性炭或离子交换树脂的脱色脱毒处理； 

(5)对(4)处理后的液体成分进行浓缩处理，得到较高浓度的蒸煮液用于木糖醇发酵； 

(6)筛选和选育出以(6)为底物发酵生产木糖醇的高产菌株； 

(7)发酵生产木糖醇 

将(6)获得的菌株以(5)为底物进行多批次的木糖醇发酵生产。 

其中所述的农林废弃物可以是玉米芯，玉米秸秆，小麦秸秆，高粱秸秆，棉籽壳，稻杆，甘蔗渣，桦木等，其中优选为玉米芯。 

1.将农林废弃物在粉碎机内进行粉碎并筛至目数为5-50目的固体颗粒，之后将农林废弃物颗粒中的杂质及表面层泥沙尘土等进行除尘处理，以减轻后工序负担。将除尘处理后的农林废弃物颗粒进行水洗除去其纤维中部分的蛋白质、色素、果胶质、灰份，单宁茶类等杂质。预处理的三步工序是提高后期产品的质量，降低成本的重要措施。 

2.浸泡处理的方法包括稀酸浸泡、稀碱浸泡以及水浸泡中的某一种方式，其中浸泡液与农林废弃物的质量比为4-8∶1。浸泡处理农林废弃物所使用的浸泡液为用稀酸、稀碱液或自来水。其中所使用的稀酸浸泡液为质量分数为0.05-0.5％的稀硫酸，稀盐酸或者稀磷酸其中的一种或者混合，在30-100℃下浸泡农林废弃物颗粒8-48h，然后通过水洗调节体系的pH值至5.0-6.0，或通过加入质量分数为0.5-2％的氨水或氢氧化钠其中的一种或者混合进行中和来调节体系pH值至6.0-7.0。水洗调节体系pH值的目的是减少酸性体系对加热仪器的腐蚀和损坏。所使用的稀碱浸泡液为质量分数为0.5-4％的氨水或氢氧化钠其中 的一种或者混合，在30-100℃下浸泡农林废弃物颗粒8-48h，然后通过水洗调节体系pH值至7.5-8.5，或通过加入质量分数为0.5-2％稀硫酸，稀盐酸或者稀磷酸其中的一种或者混合进行中和来调节体系pH值至6.0-7.0。水洗调节体系pH值的目的是为了消除碱性体系下对蒸煮效果的不良影响。或使用自来水浸泡，在30-100℃下浸泡农林废弃物颗粒8-48h，经过浸泡处理后的玉米芯表面电镜照片见图1。 

该工艺可以农林废弃物颗粒中的纤维素和半纤维素物质在浸泡的过程中得到了充分溶胀，使半纤维素初步得到了破坏，使半纤维素在之后进行的高温蒸煮过程中的水解的能力得到了大大提高，同时浸泡处理能进一步清除玉米芯或棉籽壳等农林废弃物颗粒中所含的部分胶质、色素等不可发酵物质。 

3.浸泡处理过的农林废弃物经过水洗方式来调节体系pH值的需经过固液分离农林废弃物与浸泡液后方可进行蒸煮处理，经过中和方式来调节体系pH值的无需经过固液分离处理即可进行蒸煮处理，固液分离方法可以采取离心分离、板框过滤方式中的一种或两种。 

本发明将步骤2)经过水洗方式来调节pH值的体系固液分离后得到的农林废弃物或经中和方式调节pH值的体系置入反应装置后加入水，使液体与固体比为5-20并调节初始pH为4.0-7.0，蒸煮，蒸煮温度为140℃-200℃，最佳为150-170℃，搅拌转速为80-150rpm，时间为0.5-3h，工作压力为0.6-1.2Mpa。高温蒸煮的水解原理是玉米芯或棉籽壳等农林废弃物中的半纤维素是比较容易水解的物质，亦称易水解多糖，它的主要成分是多缩戊糖(C5H8O4)n，n指的是聚合度，一般半纤维素的聚合度是60-150。多缩戊糖可看成是一个环戊糖分子的半缩醛基与另一环戊糖分子的第四个碳原子上的羟基经脱水缩合而成的多聚物，其结构式为： 

半纤维素在高温下能加水分解成为很多单分子的戊糖。多缩戊糖水解生成的戊糖，有木糖和阿拉伯糖两种。玉米芯的多缩戊糖，一般水解后生成的戊糖中90％左右是木糖，这是生产木糖醇的基本原料。多缩戊糖在高温条件下脱乙酰形成乙酸，体系pH值降低。体系pH值降低后长链木聚糖在酸性(pH3.2-3.6)和高温条件下阿拉伯糖侧链和木聚糖主链均发生水解，木聚糖从其它木质纤维成分中游离出来并且聚合度下降，溶解度提高，进入到提取液中。然后在高温的条件下，体系中的氢离子可以催化断裂D-吡喃木糖之间的β-1，4糖苷键生成木糖。下图为经过高温蒸煮处理后玉米芯表面的电镜照片见图2。 

根据本发明的方法得到的高温蒸煮液中总糖的产率为0.23-0.28g/g(均以玉米芯干重计)，其中木糖的产率为0.19-0.23g/g。高温蒸煮水解过程完毕后，断开反应釜电源，趁热将反应釜的排气装置缓慢打开至蒸汽量为每分钟0.1Kg，使高温蒸汽从管路中排出至储罐；收集排出的蒸汽测量其成分有水蒸气、糠醛、苯酚、乙酸等易于挥发的物质；大量的蒸汽可以为浸泡处理工艺或其他需热设备提供热能。此步骤能除去蒸煮液中一部分易挥发性的杂质，如糠醛、苯酚、乙酸。也使蒸煮液进行了一定程度的浓缩，同时蒸汽也可提供热能，当蒸煮体系冷却至40℃以下时，将蒸煮液连同水解渣一并从反应釜底部排出收集。 

4.蒸煮结束后收集出来的蒸煮液和水解渣需要进行中和至6.0-7.0或过中和至8.0-9.0再用浓度为1M的磷酸或盐酸中的一种或几种回调至6.0-7.0的两 种处理方式中的一种。中和或过中和采用浓度为1M的石灰乳、碳酸钙、氨水或氢氧化钠溶液其中的一种或者几种，优选石灰乳对蒸煮后收集的体系进行中和或过中和处理。处理时需要注意的是要均匀较快速的搅拌该体系，避免局部pH过大以导致木糖损失严重的现象发生。在中和的过程中能去除其中的单宁、重金属离子及硫酸根离子。对体系进行中和处理时始终保持pH小于7，可以减少糖的破坏，但不能有效去除蒸煮体系中乙酸及由木质素水解产生的酚类化合物，而这些物质对后期木糖醇发酵过程中酵母细胞生长具有较强的抑制性。对体系进行过中和处理至pH大于9.5时，可较彻底地去除蒸煮体系中乙酸及部分的酚类化合物，但会导致木糖的破坏降低蒸煮液木糖的含量。因此采取过中和处理蒸煮混合液至pH在8.0-9.0之后同时采用浓度为1M的磷酸或盐酸中的一种或几种，优选磷酸对过中和后的体系进行回调至pH为6.0-7.0，不仅有利于后期木糖醇发酵时适宜的pH环境，也可有效除去蒸煮液中存在的部分抑制微生物发酵的物质。中和或过中和处理后的体系加入亚硫酸钠可以改善水解液的氧化还原电势，提高体系在后期发酵时的性能。 

高温蒸煮处理玉米芯或棉籽壳等农林废弃物得到的蒸煮液中含有较多的杂质，不仅会对后期木糖醇发酵过程中产生不利影响，还对后续木糖醇发酵液的纯化以及结晶工艺带来不利因素，严重影响产品的质量。所以可考虑在以蒸煮液为底物发酵生产木糖醇过程之前首先对蒸煮液进行有效的脱色脱毒处理。蒸煮液中的杂质主要为有机杂质(糠醛，苯酚，乙酸等)，无机离子(K⁺，Na⁺，Ca²⁺，Mg²⁺等)和色素类物质。在制糖工业中，较常用的脱色脱毒方式为活性炭和离子交换树脂处理。 

经过中和或过中和处理后固液分离得到的蒸煮液将灵活采用活性炭或离子交换树脂脱色脱毒工艺中的某一种或两种结合的处理方式进行。在活性 炭种类上选择制糖工艺经常使用的几类活性炭，活性炭的粒度为细粒型。对于活性炭脱色脱毒处理蒸煮液的过程中分为两种工艺方式。第一种方式是，调节蒸煮液的pH为2.0-6.0，细粒活性炭的加入量为0.5-1.5％(以蒸煮液质量计)，在50-70℃的条件下，转速为80-200rpm搅拌下保温20-120min，以吸附蒸煮液体中的色素、含氮物、有机物和胶体。第二种方式是，活性炭板式过滤装置的应用。考虑到将活性炭直接加入到蒸煮液中恒温搅拌脱色会对蒸煮液中的低聚木糖造成很大损失，所以采用加热并趁热过滤的方式来降低活性炭对蒸煮液中糖分的吸附效果，最大限度的保留蒸煮液中的有效成分，吸附除去蒸煮液中的杂质。具体方法是，首先将活性炭抽滤并水洗至中性，制成厚的为5-20cm，面积为0.4-0.6m2的板式过滤装置，调节蒸煮液的pH为3.0-6.0并加热至接近沸腾，趁热经过制得的活性炭板式过滤装置，调节过滤速度为5-10L/min，处理量为100-200倍蒸煮液(以活性炭质量计)，经过处理后蒸煮液的温度为50-80℃。在两种方式下，经活性炭脱色脱毒处理后的体系的蒸煮液通过板框过滤装置进行过滤，将吸附的杂质连同活性炭一并滤去，得到的蒸煮液再经过0.45μm的精密液体过滤器过滤以澄清。 

离子交换树脂单独使用或与活性炭结合使用时能使蒸煮液的脱色脱毒效果更加明显。经过对中和或过中和后固液分离得到的蒸煮液进行离子交换树脂脱毒处理的工艺为：首先选择阳离子交换树脂，其型号为001×7型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，其型号为D201和D301分别为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂和弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。活化处理后的阴阳离子交换树脂，优选732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和D201强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂先后串联处理蒸煮液，树脂柱径高比为1∶3-4.5，树脂柱的材质为玻璃钢或碳钢塑料，进料量为每小时1-1.5个柱体积，工作温度为 室温，出料电导率＜5μs/cm。 

5.浓缩工艺分为膜浓缩或真空旋转蒸发浓缩工艺两部分中的一种或者两种结合。膜浓缩本工序包括超滤、纳滤、反渗透三道工序。超滤方式是将蒸煮液通过中空式纤维膜的超滤装置以除去蒸煮液中大分子的杂质如蛋白质，色素等。纳滤方式是利用合适的纳滤膜对蒸煮液进行选择性的浓缩并进行进一步的有效的脱盐脱色处理，以减轻后序木糖醇结晶工艺前离子交换处理时的负担。反渗透方式是对纳滤透过液进行脱盐回收，以得到纯水进行回复利用，从而节省水资源。真空旋转蒸发浓缩工艺是利用多效真空蒸发罐对蒸煮液进行高效浓缩的工艺，真空旋转蒸发浓缩的过程中保持真空度500mmHg以上，控制真空浓缩后的蒸煮液中的木糖浓度控制在300g/L，最高处理温度为65℃。在浓缩开始时加入适量亚硫酸氢钠，能起到漂白的作用，浓缩过程中的蒸发冷凝水可回复利用，避免污水的排放。 

对浓缩过后蒸煮液用水稀释至其中总糖浓度为100-200g/L时用作木糖醇发酵时的底物浓度要求，其中蒸煮液中木糖浓度为80-160g/L，低聚木糖浓度为15-30g/L，其他糖类如阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖等含量为10-20g/L，抑制物如苯酚糠醛乙酸的浓度分别控制在2-6g/L，具体见表1。 

表1玉米芯水解制备木糖液主要成分含量 

标准偏差小于2.4％. 

6.本发明在转化木糖制备木糖醇的过程是利用微生物细胞里木糖还原酶，催化木糖还原为木糖醇来实现的，还原氢来源于细胞里还原型辅酶中的氢原子和水中的氢离子，不必单独制氢。 

本发明优选使用假丝酵母菌单一菌种发酵，特别是热带假丝酵母(购买自中科院微生物研究所)。由于蒸煮液中存在着很多抑制菌体生长的成份，如苯酚、糠醛、乙酸、色素等，原始菌株不能很好的利用蒸煮液中的木糖转醇，因此有必要对菌体进行蒸煮液发酵适应性驯化。首先将原始菌种从保存斜面上接入液体驯化培养基中(含体积10％的本发明(5)步骤的蒸煮液和90％的纯木糖溶液混合)，待菌体生长良好后(最终细胞干重约7.0g/L)，再采用上次驯化液转接至下次驯化液的方式接种，采用体积为10％的菌体转接量到下一批液体驯化培养基(含20％体积(5)步骤蒸煮液和80％的纯木糖溶液)中，照此方式不断提高液体驯化培养基中蒸煮的含量(每批增加蒸煮液体积含量0-10％)，直至菌种在液体驯化培养基(100％蒸煮液和0％的纯木糖溶液)中能进行良好的生长至最终细胞干重约7.0g/L和正常的发酵生产木糖醇产率60％-70％。其过程为将某一阶段驯化好的菌液稀释涂平板，挑取较大的菌落各5个，在斜面培养基上划线进行保存，并对保存的菌种进行下一步的发酵验证。对每次发酵结果取样进行色谱分析同 时进行在线的活细胞显微镜检得到最新的信息和反馈，对优良的菌种着重培养并进行多轮次的驯化，对结果不好的菌种提早淘汰。 

菌体经适应蒸煮液发酵适应性驯化后，还需要进一步的进行高浓度蒸煮液底物驯化以提高其对高浓度木糖蒸煮液的利用能力，以高效发酵生产木糖醇并节省生产成本。方法是菌种从保存斜面上接入底物浓度驯化培养基中(含木糖80g/l蒸煮液)，在30℃，转速为200rpm下培养24h，待菌体在驯化培养基中生长良好后(最终细胞干重约7.0g/L)，再采用上次驯化液转接至下次驯化液的方式接种(10％左右的菌体转接量)到下一批驯化培养基(含木糖90g/l的蒸煮液)中，照此方式不断提高驯化培养基中蒸煮液的底物浓度的含量(每批增加底物浓度0-10g/l)，直至菌种在驯化培养基(含木糖140g/l的蒸煮液)中能进行的良好的生长(最终细胞干重约7.0g/L)和正常的发酵生产木糖醇。将某一阶段驯化好的菌液稀释适当梯度涂平板，挑取较大的菌落各5个，在斜面培养基上划线进行保存，并对保存的菌种进行下一步的发酵验证。对每次发酵结果取样进行色谱分析同时进行在线的活细胞显微镜检得到最新的信息和反馈，对优良的菌种着重培养并进行多轮次的驯化，对结果不好的菌种提早淘汰。 

上述过程中需要添加酵母粉6-10g/L，KH₂PO₄：3-6g/l，MgSO₄·7H₂O：0.3-0.6g/l。(NH₄)₂HPO₄：2-4g/l。 

7.本发明涉及到的木糖醇发酵过程包括以下内容。 

1)摇瓶种子培养：摇瓶种子培养基在115℃的条件下蒸汽灭菌30min。待摇瓶内种子培养基的温度降至30℃左右时，从斜面培养基上挑取发酵菌种接入到摇瓶中进行种子培养。摇瓶内种子培养的最优工艺为：装液量为80～100/500mL，35～45/250mL，温度为30℃，初始pH为自然(5.5～6.5)，转速为200rmp，培养时间为18～22h，此时细胞的干重为3-5g/L。 

种子罐种子培养：在容积为2.5L，装液量在1.2-1.5L的发酵罐内进行。将种子罐种子培养基在115℃的条件下蒸汽灭菌30min。待罐内种子培养基的温度降至30℃时，将经过摇瓶培养的种子液接种到种子罐中进行种子扩大培养，摇瓶转入种子罐内的接种量为5-15％(体积分数)，30℃进一步培养15-25h，此时细胞的干重为3-5g/L，通气量为0.5-1.0vv^-1m^-1，搅拌转速150-300rpm。 

摇瓶发酵过程：将处理后玉米芯蒸煮液中加入碳源和氮源、无机盐等营养物质配置成发酵培养基，在115℃的条件下高压蒸汽灭菌30min。待摇瓶内发酵培养基的温度降至30℃左右时，将摇瓶内的种子液接到发酵培养基中，装液量为40-80ml/250ml，优选50-60ml/250ml，接种量为5-15％(体积分数)，在30℃的摇床内培养40-50h。在发酵过程中可采用恒定溶氧调控、两步溶氧调控和三步溶氧调控方式其中的一种对摇瓶内溶氧水平的进行控制。恒定溶氧调控是在整个发酵过程中，维持摇床转速在150-250rpm，优选200rpm，直至40-46h后发酵结束。两部溶氧调控是在发酵的前期维持摇床转速在180rpm-250rpm中的某一值，优选210rpm，当菌体湿重达到20-30g/L即发酵时间为18-24h时，调节摇床转速在100-200rpm中的某一值，优选160rpm，直至42-48h发酵结束。三步溶氧调控是在发酵的前期维持摇床转速在180rpm-250rpm中的某一值，优选210rpm，当菌体浓度达到15-25g/L即发酵时间为14-20h时，调节摇床转速在120-200rpm中的某一值，优选170rpm，当菌体浓度达到20-30g/L即发酵时间为28-34h时，调节摇床转速在100-170rpm中的某一值，优选140rpm，直至44-50h发酵结束。 

或2)发酵罐发酵过程：将发酵罐发酵培养基在115℃的条件下蒸汽灭菌30min，待罐内发酵培养基的温度降至30℃左右时，将种子罐内的种子液泵入到发酵罐中，接种体积为发酵体积的5-15％。维持发酵罐内温度25-35℃；添加缓 冲盐调节罐内发酵液pH在4.0-6.0范围内；在发酵过程中可采用三种溶氧调节方式其中的一种进行发酵罐的溶氧调节，分别为恒定溶氧调控、两步溶氧调控、三步溶氧调控。恒定溶氧调控是控制发酵罐内的溶氧水平在发酵的整个过程中采取某一个不变的通气量的方式进行，通气量恒定为0.8vv^-1m^-1，转速为200-300rpm，发酵时间为36-42h。两步法溶氧调控是控制发酵罐内的溶氧水平在发酵的整个过程中分时段采取两种通气量的方式进行。在发酵前期调节罐内通气量为0.8-1.2vv^-1m^-1，转速为200-300rpm，发酵16-24h；当菌体湿重达到20-35g/L时，调节罐内通气量为0.2-0.6vv^-1m^-1，转速为150-250rpm，36-44h时发酵结束。三步法溶氧调控是控制发酵罐内的溶氧水平在发酵的整个过程中分时段采取三种通气量的方式进行。在发酵前期调节罐内通气量为1.0-1.2vv^-1m^-1，转速为200-300rpm，发酵12-16h；当菌体湿重达到20-35g/L时，调节罐内通气量为0.5-0.8vv^-1m^-1，转速为200-250rpm，发酵时间为8-14h；当菌体湿重达30-40g/L时，调节罐内通气量为0.2-0.4vv^-1m^-1，转速为150-200rpm，38-44h时发酵结束。 

其中斜面培养基成分为：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积10％，葡萄糖：20g/L，酵母膏：5g/L，玉米浆5g/L，琼脂20g/L，其余为水。 

摇瓶种子培养基成分为：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积10％，葡萄糖：20g/L，酵母膏：5g/L，玉米浆5g/L，KH₂PO₄：2.5g/L，MgSO₄·7H₂O：0.5g/L，其余为水。 

种子罐培养基成分为：含木糖浓度300g/L的蒸煮液：占培养基体积10％，葡萄糖：10g/L，酵母膏：3g/L，玉米浆3g/L，KH₂PO₄：2.5g/L，MgSO₄·7H₂O：0.5g/L，其余为水。 

摇瓶或发酵罐发酵培养基：步骤(5)的蒸煮液：占培养基体积40％-60％，酵母膏：8-10g/L，玉米浆4-5g/L，KH₂PO₄：2-4g/L，(NH₄)₂HPO₄：2-4g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4-0.8g/L，其余为水。其中调节pH所使用到的缓冲盐选自乙酸、氢氧化钙、氢氧化钠、氨水、磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或几种组合，发酵过程中体系的pH调控在4.0-7.0之间，其中发酵的初始pH为5.0-6.0。经过上述发酵过程后，对所得发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为90g/L-115g/L，残留木糖浓度控制在5-10g/L以内，木糖醇转化率在60％-70％。 

木糖转化为木糖醇的过程是利用微生物细胞里的木糖还原酶，催化木糖还原为木糖醇，还原氢来源于细胞里还原型辅酶中的氢原子。木糖还原酶(XR)以NADPH或NADH为辅酶，将D-木糖还原为木糖醇。木糖醇既可以作为主要产物分泌进入培养基内，也可以被以NAD⁺为辅酶的木糖醇脱氢酶(XDH)催化氧化成D-木酮糖，最后进入磷酸木酮糖代谢途径。酵母菌中木糖还原酶既可以NADPH为辅酶，也可以NADH为辅酶。采用两步溶氧调控或三步溶氧调控发酵工艺，都能使发酵后期的溶氧相对更低，在维持细胞最低限度的新陈代谢的同时减少底物的过多消耗。同时在根本上也可以抑制酵母呼吸链中的辅酶NADH进一步氧化成NAD⁺，提高NADH/NAD⁺比值，抑制辅酶NAD⁺相关的木糖醇脱氢酶的酶活，从而减少木糖醇被进一步代谢为木酮糖。并且此时采用相对小的溶氧，可限制呼吸链中部分能量因子ATP的合成，这也抑制了木酮糖被木酮糖激酶代谢为5-磷酸木酮糖进入HMP途径。本发明中采用的全新的三步溶氧调控工艺与两步溶氧调控工艺的最大特点就是前者在发酵的中期安排了一个溶氧调控的过渡期。过渡期是提供发酵环境由好氧向微氧环境过渡的半好氧的阶段。此阶段的过渡，菌体的生理特性基本没有发生较大改变，保证了细胞维持正长的木糖还原酶的生产及生理代谢。虽然三步溶氧调控工艺的程序和发酵调控的难度有所增加，但优势却非常显著。 8.本发明涉及到的多批次发酵生产木糖醇的内容如下。 

摇瓶批次发酵过程：本发明根据单一批次的发酵结果，对发酵结束后的酵母进行回复利用连续发酵生产木糖醇，一方面可以大大减少前期进行种子培养时所耗费的生产成本，同时还能缩短每批次发酵周期，另一方面可以保存大量的底物木糖不被菌体在前期的生长阶段作为碳源而被大量的消耗，从而使更多的木糖醇的到了积累和生产。批次发酵所采取的方法可采取如下两种方法中的一种：一种是先把空的三角瓶和要进行批次的新鲜培养基放入超净台中，紫外杀菌15-20分钟，在此过程中要将批次完成的摇瓶静置10-20分钟左右，使菌体自然沉降至瓶底，然后在超净台内进行无菌操作，倒出上批发酵结束的发酵液的上清70-80％左右，然后倒入等体积的新鲜培养基进行下一批次的发酵，注意在倾倒的过程中尽量要小心，不要剧烈晃动以免倒出大量的菌体。另一种方法是取一些灭过菌的离心管，在超净台内将上批发酵结束的发酵液从摇瓶中倒入离心管内，4000-6000rpm下离心5-10min，在超净台内将经过紫外灭菌的新鲜培养基倒入离心管内，充分震荡混合，进行下一批次的发酵。 

加入的新鲜的发酵培养基中成分为上述的摇瓶或发酵罐发酵培养基，其中培养基的木糖浓度为130-150g/L；维持发酵温度25-35℃；添加磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲盐控制初始发酵液pH在4.0-6.0，装液量为40-80ml/250ml；第一批发酵过程采用三部溶氧调节法，后几批发酵过程采用以三步溶氧调节法中的第三步的方法进行的恒定溶氧调节。发酵批次以8-10批为宜，前几个批次发酵时间为42-46h，中间批次发酵时间为40-44h，后几个批次的发酵时间为44-50h。待每批发酵液中木糖浓度降到5g/L以下时即40-48h时，终止此批发酵。每一批次的发酵时间随着装液量的增长适当的延长。 

发酵罐批次发酵过程：本发明可采用如下两种发酵方式中的一种进行发酵 罐批次发酵调控。一种是连续发酵，即以一定的速度向发酵罐内添加新鲜的发酵培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。如上述单批发酵罐发酵所述，在容积为20L，装液量在12-15L的发酵罐内进行发酵，新鲜的发酵培养基中成分为上述的摇瓶或发酵罐发酵培养基，在一批发酵结束后，通过出料口，放出相当于装液量40％-60％的发酵液，再补充等体积无菌新鲜的发酵培养基进行新一轮的发酵。发酵过程中维持发酵罐内温度25-35℃；流加缓冲盐调节罐内发酵液pH在4.0-6.0范围内；第一批发酵过程采用三步溶氧调节法，后几批发酵过程采用以三步溶氧调节法中的第三步进行的恒定溶氧调节法，发酵批次以8-12批为宜，前几个批次发酵时间为42-46h，中间批次发酵时间为40-44h，后几个批次的发酵时间为44-50h。另一种方式是补料发酵，即称半连续发酵，是定期从发酵罐中排出一定量的发酵液同时不断地以一定的流速补加新鲜物料的方法。这样不仅有利于解除底物浓度过高对于代谢产物收率和菌体生长速率的影响，而且能够通过装液量的变化控制溶氧条件向着早期好氧后期微好氧的发酵要求转变，在容积为20L，装液量在11-14L的发酵罐内进行发酵，在第一批发酵结束后，以1ml/min的流速向发酵罐内加入新鲜的发酵培养基，每隔一段时间通过出料口放出大约2L左右的发酵液，第一批发酵时间为40h，之后批次发酵时间随着装液量的增长适当的延长。发酵过程中维持发酵罐内温度25-35℃；加入的新鲜的发酵培养基中成分为上述的摇瓶或发酵罐发酵培养基，其中蒸煮液的木糖浓度为130-150g/L；流加缓冲盐调节罐内发酵液pH在4.0-6.0范围内；第一批发酵过程采用三部溶氧调节法，后几批发酵过程采用以三步溶氧调节法中的第三步进行的恒定溶氧调节法，发酵批次以8-12批为宜。 

本发明中采用高温蒸煮工艺降解玉米芯或农林废弃物中的半纤维素原料来生产木糖液，进而通过微生物转化将粗木糖液直接转化为木糖醇是一条生产木糖醇的新型清洁工艺，工艺较为简单，易于操作。每生产1吨木糖醇的废水排放量由300吨大幅度降为100吨一下，能够解决现有木糖醇工业生产中存在的污染问题，同时生物法可选择性地将木糖转化为木糖醇，阿拉伯糖等其他单糖不发生转化，有利于产品的纯化及产品质量的控制。 

附图说明

图1经过浸泡处理后的玉米芯表面电镜照片 

图2经过高温蒸煮处理后玉米芯表面的电镜照片。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步的描述，但下述实施例并非用来限制本发明的范围。 

实施实例1. 

玉米芯的预处理工艺 

经过粉碎、除尘、水洗预处理后的玉米芯颗粒经风干后称重为10Kg，加入质量分数为0.2％的硫酸溶液50L，在50℃水浴浸泡24小时，可静置也可适当搅拌，使色素溶出，颗粒溶胀；板式过滤收集稀酸液以再次回复利用，过滤得到玉米芯固体，用一定量的去离子水冲洗玉米芯，洗掉沾附的酸液，以调节玉米芯表面及内部的离子强度。 

高温蒸煮制备水解液 

经过预处理并稀酸浸泡处理后的颗粒玉米芯(干重6Kg)加入高温反应釜内加入75L自来水，密闭高压加热，温度设定为165℃，在搅拌转速为60-150rmp下保温1.5h。高温蒸煮水解过程完毕后，断开反应釜电源，趁热将反应釜的排 气装置缓慢打开至蒸汽量为每分钟0.1Kg，使高温蒸汽从管路中排出至储罐；收集排出的蒸汽测量其成分有水蒸气、糠醛、苯酚、乙酸等易于挥发的物质；大量的蒸汽可以为浸泡处理工艺或其他需热设备提供热能。此步骤能除去蒸煮液中一部分易挥发性的杂质，如糠醛、苯酚、乙酸的去除率大约为15-25％。同时也能也使蒸煮液进行了一定程度的浓缩，浓缩倍数为10-15％，得到的高温蒸汽也可提供热能。当蒸煮体系冷却至40℃以下时，将蒸煮液连同水解渣一并从反应釜底部排出收集。蒸煮液中木糖的产率为0.19-0.23g/g(以玉米芯干重计)。高温蒸煮反应釜产自大连通达反应釜厂，不锈钢材质，电子控制板路，冷却水装置，蒸汽排放管路，电加热升温系统，反应釜最大加热温度为350℃，最大耐受压力为2.2mpa，锚式可调转速搅拌，转速为20-250rpm，反应釜的最大容积为100L，料液排放出口为下出口。 

蒸煮液的中和和过中和 

收集出来的蒸煮液和水解渣需要进行中和或过中和再回调的处理。采用浓度为1M的石灰乳溶液对体系进行调节至pH值为6.0-7.0的中和处理，或者对体系进行调节至pH值为8.0-9.0的过中和后用浓度为1M的磷酸对体系进行回调至pH为6.0左右的过中和处理。中和或过中和处理时需要注意的是要均匀较快速的搅拌该体系，避免局部pH过大以导致木糖损失过大的现象发生。中和和过中和再回调处理能有效去除体系中的单宁、重金属离子及硫酸根离子和部分乙酸及由木质素水解产生的酚类化合物，不仅有利于后期木糖醇发酵时所需的适宜pH环境，也可除去蒸煮液中存在的部分抑制微生物发酵的物质。中和或过中和处理后的体系加入亚硫酸钠可以改善水解液的氧化还原电势，提高体系在后期发酵时的性能。 

蒸煮液中和后的固液分离 

经过中和或过中和处理后的蒸煮混合物体系通过传送管道运送到分离离心机中，离心机转鼓中安装有滤袋，离心机的最高转速为2500rpm，并且变频可调，转速直径为600mm，最大装液量为50kg。在离心机转速为500rpm时，开始缓慢加入中和后的蒸煮混合物，让蒸煮液离心出，木糖渣以及中和后的絮凝物在转鼓中均匀分布，降低离心机的震动。当50kg的料全部加入后，盖上离心机盖，慢慢使离心机升至2500rpm，维持10min，直到没有液体排出为止，然后在洗液口加入50℃水3L，对固体进行洗涤，重复洗涤2次，直到排液中无水排出为止，停机，清理余渣。 

经过中和或过中和处理后的蒸煮混合物体系通过传送管道运送到板框压滤机中，板框压滤机由交替排列的滤板和滤框构成一组滤室。滤板的表面有沟槽，其凸出部位用以支撑滤布。滤框和滤板的边角上有通孔，组装后构成完整的通道，能通入蒸煮混合物、洗涤水和引出滤液。适合的蒸煮混合物的固体颗粒浓度为10％，操作压力为0.5～1.5mpa，板框为正方形，滤框的内边长为1000毫米，框厚为50毫米，过滤面积为600m²。板与框用电动螺旋方式压紧。板和框用不锈钢材料制造。最大过滤量为100kg。由供料泵将蒸煮混合物压入滤室，在滤布上形成滤渣，直至充满滤室。滤液穿过滤布并沿滤板沟槽流至板框边角通道，集中排出，直到没有液体排出为止，然后加入50℃水10L，对固体进行洗涤，重复洗涤2次，停机，随后打开压滤机卸除滤渣，清洗滤布，重新压紧板、框，开始下一工作循环。 

活性炭和离子交换树脂对蒸煮液脱毒脱色处理 

经过中和和固液分离得到的蒸煮液灵活采用活性炭或离子交换树脂脱色脱毒工艺中的某一种或两种结合的脱色脱毒处理方式。选择制糖工艺经常使用的几类活性炭，其粒度为细粒型。对于蒸煮液活性炭脱毒处理中分为两种 工艺方式。第一种方式是，调节蒸煮液的pH为4.0，加入1％(以蒸煮液质量计)活性炭，在60℃的条件下，保温30min，搅拌吸附蒸煮液体中的色素、含氮物、有机物和胶体。第二种方式是，活性炭板式滤装置的应用。采用加热并趁热过滤的方式来降低活性炭对蒸煮液中糖分的吸附效果，吸附除去蒸煮液中的杂质。具体方法是，首先将活性炭抽滤并水洗至接近中性，制成厚的约为10cm，面积为0.5m²的板式过滤装置，调节蒸煮液的pH为4.0并加热至接近沸腾，趁热经过制得的活性炭板式过滤装置，调节过滤速度为8L/min，处理量为150倍蒸煮液(以活性炭质量计)，经过处理后蒸煮液的温度为65℃。在两种方式下，经活性炭脱色脱毒处理后的体系的蒸煮液通过板框过滤装置进行过滤，将吸附的杂质连同活性炭一并滤去，得到的蒸煮液再经过0.45μm的精密液体过滤器过滤以澄清。对于活性炭前处理方法为称取一定数量的活性炭，放入一定的容器中，用30％的盐酸浸泡24h，然后抽滤除去体系中浸泡的盐酸，滤除液回收并再次使用，活性炭部分再用至少三倍于盐酸浸泡液体积的去离子水抽滤清洗，之后放入烘箱内45℃干燥24h，干燥后封存循环待用。 

蒸煮液通过阳离子交换和阴离子交换后，蒸煮液中的杂质阳离子和杂质阴离子都被吸附到离子交换树脂上被去除，离子交换树脂还能除去蒸煮液中存在的大部分色素以及部分有机物质，当其与活性炭结合使用时能相互补充对蒸煮液的脱毒效果更加明显。经过中和和固液分离得到的蒸煮液离子交换树脂脱毒处理的工艺为：优选732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和D201强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂先后串联处理蒸煮液，树脂柱径高比为1∶4，树脂柱的材质为玻璃钢或碳钢塑料，进料量为每小时1个柱体积，工作温度为室温，出料电导率＜5μs/cm。其次对树脂活化方法可根据污染情况和条件而定，一般阳树脂在软化中易受Fe³⁺污染，可用盐酸浸泡后逐步稀释。阴树脂易受有机物污 染，可用10％NaCl+2-5％NaOH混合溶液浸泡或淋洗。必要时可用1％双氧水溶液浸泡数分钟，也可采用酸、碱交替处理法，漂白处理法，酒精处理法和各种灭菌法进行处理。 

蒸煮液的浓缩 

浓缩工艺包括膜浓缩和真空旋转蒸发浓缩工艺两部分中的一种或者两种结合。膜浓缩本工序包括超滤、纳滤、反渗透三道工序。真空旋转蒸发浓缩的过程中保持真空度500mmHg以上，控制真空浓缩后的蒸煮液中的木糖浓度控制在300g/L，最高处理温度为65℃。在浓缩开始时加入适量亚硫酸氢钠，能起到漂白的作用，浓缩过程中的蒸发冷凝水可回复利用，避免污水的排放。 

发酵制备木糖醇菌株的驯化 

热带假丝酵母菌体首先要进行适应蒸煮液驯化，方法是将原始菌种从保存斜面上接入液体驯化培养基中(含体积10％步骤(5)玉米芯蒸煮液和90％的纯木糖溶液混合)，待菌体生长良好后(最终细胞干重约7.0g/L)，再以10％接种量接种到下一批液体驯化培养基(含20％蒸煮液和80％的纯木糖溶液)中，照此方式不断提高液体驯化培养基中蒸煮的含量(每批增加蒸煮液含量0-10％)，直至菌种在液体驯化培养基(100％蒸煮液和0％的纯木糖溶液)中能进行良好的生长和正常的发酵生产木糖醇。将某一阶段驯化好的菌液稀释涂平板，挑取较大的菌落各5个，在斜面培养基上划线进行保存，并对保存的菌种进行下一步的发酵验证。对每次发酵结果取样进行色谱分析同时进行在线的活细胞显微镜检得到最新的信息和反馈，对优良的菌种着重培养并进行多轮次的驯化，对结果不好的菌种提早淘汰。 

菌种对蒸煮液发酵适应性驯化的培养基为木糖浓度为100g/L的蒸煮液与纯木糖溶液，分别按体积比为(1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，∶2， 9∶1，10∶0)的方式配置成不同抑制物浓度梯度的驯化培养基，在驯化的过程中依次增加蒸煮液在培养基成分中所占的体积百分含量，其中酵母粉6-10g/L，KH₂PO₄：3-6g/l，MgSO₄·7H₂O：0.3-0.6g/l。(NH₄)₂HPO₄：2-4g/l。 

进行高浓度蒸煮液底物驯化：将上述菌种从保存斜面上接入底物浓度驯化培养基中(含木糖8％蒸煮液)，在30℃，转速为200rpm下培养24h，待菌体在驯化培养基中生长良好后(最终细胞干重约7.0g/L)，再采用上次驯化液转接至下次驯化液的方式接种(10％左右的菌体转接量)到下一批驯化培养基(含木糖9％的蒸煮液)中，照此方式不断提高驯化培养基中蒸煮液的底物浓度的含量(每批增加底物浓度0-1％)，直至菌种在驯化培养基(含木糖14％的蒸煮液)中能进行的良好的生长和正常的发酵生产木糖醇。将某一阶段驯化好的菌液稀释适当梯度涂平板，挑取较大的菌落各5个，在斜面培养基上划线进行保存，并对保存的菌种进行下一步的发酵验证。对每次发酵结果取样进行色谱分析同时进行在线的活细胞显微镜检得到最新的信息和反馈，对优良的菌种着重培养并进行多轮次的驯化，对结果不好的菌种提早淘汰。 

上述过程中还加入：酵母膏：6-10g/L，玉米浆4-5g/L，KH₂PO₄：3.0-5.0g/L，(NH₄)₂HPO₄：3.0-4.0g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4-0.8g/L。 

发酵种子的制备 

摇瓶种子培养：将种子培养基在115℃的条件下高压蒸汽灭菌30min。待摇瓶内种子培养基的温度降至30℃左右时，从斜面培养基上挑取发酵菌种接入到摇瓶中进行种子培养。摇瓶内种子培养的最优工艺为：装液量为90/500mL，40/250mL，温度为30℃，初始pH为自然，转速为200rmp，培养时间为22h，此时细胞的干重为4g/L。 

种子罐种子培养：在容积为2.5L，装液量在1.4L的发酵罐内进行。种子培 养基在115℃的条件下蒸汽灭菌30min，待罐内种子培养基的温度降至30℃左右时，将经过摇瓶培养的种子液接种到种子罐中进行种子扩大培养，摇瓶转入种子罐内的接种量为10％(体积分数)，30℃进一步培养20h，此时细胞的干重为5g/L，通气量为0.8vv^-1m^-1，搅拌转速200rpm。 

斜面培养基成分为：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积10％，葡萄糖：20g/L，酵母膏：5g/L，玉米浆5g/L，琼脂20g/L，其余为水。摇瓶种子培养基成分为：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积10％，葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，玉米浆5g/L，KH₂PO₄2.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，其余为水。种子罐培养基成分为：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积10％，葡萄糖：10g/L，酵母膏：3g/L，玉米浆3g/L，KH₂PO₄：2.5g/L，MgSO₄·7H₂O：0.5g/L，其余为水。 

蒸煮液摇瓶发酵制备木糖醇 

将培养好的种子液以接种量为7％(体积分数)加入到摇瓶培养基中，维持发酵温度30℃；流加磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲盐控制发酵液初始pH在6.0，装液量为50-60ml/250ml；采用三步法溶氧调控方式对摇瓶内溶氧水平的进行控制：在发酵的前期维持摇床转速在220rpm，当菌体浓度达到18g/L即发酵时间为16h时，调节摇床转速为170rpm，当菌体浓度达到25g/L即发酵时间为30h时，调节摇床转速在为140rpm，直至46h发酵结束。 

发酵培养基：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积45％，酵母膏：8g/L，玉米浆4g/L，KH₂PO₄：3.5g/L，(NH₄)₂HPO₄：3g/L，MgSO₄·7H₂O：0.5g/L，其余为水。经过上述发酵过程，对所得发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为88g/L，残留木糖浓度控制在6g/L以内，木糖醇转化率在67％。 

实施例2.蒸煮液发酵罐发酵制备木糖醇 

将实施例1种子罐中培养好的种子液泵入到发酵罐中，接种量为10％(体积分数)，维持发酵罐内温度30℃；流加磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲盐控制罐内发酵液pH在6.0；通气量采用三步法溶氧调控法：控制发酵罐内的溶氧水平在发酵的整个过程中分时段采取三种通气量的方式进行。在发酵前期调节罐内通气量为1.1vv^-1m^-1，转速为250rpm，当菌体湿重达到25g/L时即发酵时间为16h时，调节罐内通气量为0.6vv^-1m^-1，转速为210rpm，当菌体湿重达到32g/L时即发酵时间为26h时，调节罐内通气量为0.3vv^-1m^-1，转速为160rpm，注意保持此时罐内溶氧浓度为0％-10％，待发酵液中木糖浓度降到5g/L以下时，发酵终止，发酵周期＜40h。 

发酵培养基：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积50％，酵母膏：8.5g/L，玉米浆4g/L，KH₂PO₄：3.0g/L，(NH₄)₂HPO₄：3.0g/L，MgSO₄·7H₂O：0.6g/L，其余为水。经过上述发酵过程，对所得发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为96g/L，残留木糖浓度控制在5g/L以内，木糖醇转化率在68％。 

实施例3.摇瓶多批次发酵制备木糖醇 

将实施例1根据单一批次的发酵结果，对发酵结束后的酵母进行回复利用连续发酵生产木糖醇。批次发酵所采取的方法可采取如下两种方法：一种是先把空的三角瓶和要进行批次的新鲜培养基放入超净台中，紫外杀菌15分钟，在此过程中要将批次完成的摇瓶静置15分钟左右，使菌体自然沉降至瓶底，然后在超净台内进行无菌操作，倒出上批发酵结束的发酵液的上清75％左右，然后倒入等体积的新鲜培养基进行下一批次的发酵，注意在倾倒的过程中尽量要小心，不要剧烈晃动以免倒出大量的菌体。另一种方法是取一些灭过菌的离心管，在超净台内将上批发酵结束的发酵液从摇瓶中倒入离心管内，5000rpm下离心5min，在超净台内将经过紫外灭菌的新鲜培养基倒入离心管内，充分振荡混合， 进行下一批次的发酵。 

加入的新鲜的发酵培养基中成分为上述的摇瓶或发酵罐发酵培养基，其中蒸煮液的木糖浓度为140g/L；维持发酵温度30℃；添加磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲盐控制初始发酵液pH在6.0，装液量为50-60ml/250ml；第一批发酵过程采用三部溶氧调节法，后几批发酵过程采用以三步溶氧调节法中第三步的方法进行的恒定溶氧调节。发酵批次以10批为宜，前几个批次发酵时间为42-46h，中间批次发酵时间为40-44h，后几个批次的发酵时间为44-50h。待每批发酵液中木糖浓度降到5g/L以下时即40-48h时，终止此批发酵。经过上述发酵过程，对所得发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为90g/L-115g/L，残留木糖浓度控制在5-10g/L以内，木糖醇平均转化率在60％-70％。 

实施例4.发酵罐多批次发酵制备木糖醇 

将实施例1采用两种发酵方式进行发酵罐批次发酵调控。一种是连续发酵，以一定的速度向发酵罐内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。如上述单批发酵罐发酵所述，在容积为20L，装液量在12L的发酵罐内进行发酵，在一批发酵结束后，通过出料口，放出相当于装液量50％的发酵液，再补充等体积无菌新鲜的发酵培养基进行新一轮的发酵。发酵过程中维持发酵罐内温度30℃；流加缓冲盐调节罐内发酵液pH在5.5范围内；前几个批次发酵时间为46-50h，中间批次发酵时间为44-48h，后几个批次的发酵时间为48-52h。另一种是补料发酵，即称半连续发酵，是定期从发酵罐中排出一定量的发酵液同时不断地以一定的流速补加物料的方法。在容积为20L，装液量在13L的发酵罐内进行发酵，在第一批发酵结束后，以1ml/min的流速向发酵罐内加入新鲜的发酵培养基，每隔一段时间通过出料口放出大约2L左右的发酵液，第一批发酵时间为40h，之后批次发酵 时间随着装液量的增长适当的延长。 

发酵过程中维持发酵罐内温度30℃；流加缓冲盐调节罐内发酵液pH在5.0-6.0范围内；加入的新鲜的发酵培养基中成分为上述的摇瓶或发酵罐发酵培养基，其中培养基的木糖浓度为140g/L；第一批发酵过程采用三部溶氧调节法，后几批发酵过程采用以三步溶氧调节法中的第三步进行的恒定溶氧调节法。发酵批次以10批为宜，待每批发酵液中木糖浓度降到5g/L以下时，终止此批发酵。经过上述发酵过程，对所得发酵液进行成分分析，其中木糖醇浓度为90g/L-115g/L，残留木糖浓度控制在5-10g/L以内，木糖醇平均转化率在60％-70％。 

Claims (4)

1.利用农林废弃物制备木糖醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对农林废弃物原料进行粉碎、除尘、水洗预处理；

2)对1)得到的农林废弃物颗粒进行浸泡处理方法一使用稀酸浸泡：所使用的稀酸浸泡液为质量分数为0.05-0.5％的稀硫酸、稀盐酸或者稀磷酸其中的一种或者混合，在30-100℃下浸泡农林废弃物颗粒8-48h，然后通过水洗调节体系的pH值至5.0-6.0，或通过加入质量分数为0.5-2％的氨水或氢氧化钠其中的一种或者混合进行中和来调节体系pH值至6.0-7.0；

方法二使用稀碱浸泡：所使用的稀碱浸泡液为质量分数为0.5-4％的氨水或氢氧化钠其中的一种或者混合，在30-100℃下浸泡农林废弃物颗粒8-48h，然后通过水洗调节体系pH值至7.5-8.5，或通过加入质量分数为0.5-2％稀硫酸，稀盐酸或者稀磷酸其中的一种或者混合进行中和来调节体系pH值至6.0-7.0；方法三使用水浸泡使用自来水浸泡，在30-100℃下浸泡农林废弃物颗粒8-48h；

3)对2)处理过的农林废弃物颗粒进行高温蒸煮处理

步骤2)经过水洗方式来调节pH值的体系固液分离后得到的农林废弃物或经中和方式调节pH值的体系置入反应装置后加入水，使液体与固体比为5-20并调节初始pH为4.0-7.0，蒸煮，蒸煮温度为140℃-200℃，搅拌转速为80-150rpm，工作压力为0.6-1.2Mpa，时间为0.5-3h，趁热蒸汽放出，蒸汽量为每分钟0.1Kg，当蒸煮体系冷却至40℃以下时，将蒸煮液连同水解渣一并从反应釜底部排出收集；

4)对3)处理后得到的体系进行中和至pH6.0-7.0或过中和至pH8.0-9.0再用浓度为1M的磷酸或盐酸中的一种或两种调回至pH6.0-7.0，中和或过中和采 用浓度为1M的石灰乳、碳酸钙、氨水或氢氧化钠溶液其中的一种或者几种；对处理后得到的体系进行固液分离，得到的液体成分进行活性炭或/和离子交换树脂的脱色脱毒处理；

5)对4)处理后的液体成分进行浓缩处理，得到木糖浓度300g/L的蒸煮液；

6)用热带假丝酵母筛选和选育出以5)为底物发酵生产木糖醇的高产菌株

(1)首先菌体对蒸煮液发酵适应性驯化

将原始热带假丝酵母菌种从保存斜面上接入含步骤(5)10％体积蒸煮液和90％的纯木糖溶液混合液体驯化培养基中，待菌体生长至最终细胞干重7.0g/L，再采用上次驯化液转接至下次驯化液的方式接种，采用体积为10％的菌体转接量到下一批含体积20％步骤(5)的蒸煮液和80％的纯木糖溶液液体驯化培养基中，照此方式不断提高液体驯化培养基中蒸煮液的含量，每批增加蒸煮液含量0-10％，直至菌种在含100％蒸煮液和0％的纯木糖溶液液体驯化培养基中能进行良好的生长至最终细胞干重约7.0g/L和正常的发酵生产木糖醇产率60％-70％；

(2)对高浓度蒸煮液底物发酵适应性驯化

将菌种从保存斜面上接入底物浓度驯化培养基即含木糖80g/l蒸煮液中，在30℃，转速为200rpm下培养24h，待菌体在驯化培养基中使最终细胞干重7.0g/L，再采用上次驯化液转接至下次驯化液的方式接种10％的菌体转接到下一批驯化培养基即含木糖90g/l的蒸煮液中，照此方式不断提高驯化培养基中蒸煮液的底物浓度的含量，每批增加底物浓度0-10g/l，直至菌种在驯化培养基含木糖140g/l的蒸煮液中使最终细胞干重7.0g/L；

上述过程中需要添加酵母粉6-10g/L，KH₂PO₄：3-6g/l，MgSO₄·7H₂O：0.3-0.6g/l，(NH₄)₂HPO₄：2-4g/l；

7)木糖醇发酵过程 

(1)摇瓶种子培养：摇瓶种子培养基在115℃的条件下蒸汽灭菌30min，待摇瓶内种子培养基的温度降至30℃时，从斜面培养基上挑取发酵菌种接入到摇瓶中进行种子培养，摇瓶内种子培养的工艺为：装液量为80～100/500mL或35～45/250mL，温度为30℃，初始pH为自然的5.5～6.5，转速为200rmp，培养时间为18～22h，此时细胞的干重为3-5g/L；

或种子罐种子培养：在容积为2.5L，装液量在1.2-1.5L的发酵罐内进行；将种子罐种子培养基在115℃的条件下蒸汽灭菌30min，待罐内种子罐种子培养基的温度降至30℃时，将上述经过摇瓶培养的种子液接种到种子罐中进行种子扩大培养，摇瓶转入种子罐内的接种量为体积分数5-15％，30℃进一步培养15-25h，此时细胞的干重为3-5g/L，通气量为0.5-1.0vv^-1m^-1，搅拌转速150-300rpm；

(2)摇瓶发酵过程：将发酵培养基在115℃的条件下蒸汽灭菌30min，待摇瓶内发酵培养基的温度降至30℃时，将摇瓶内的种子液接到发酵培养基中，装液量为40-80ml/250ml，接种量为体积分数5-15％，在30℃的摇床内培养40-50h；在发酵过程中采用恒定溶氧调控、两步溶氧调控或三步溶氧对摇瓶内溶氧水平进行控制，恒定溶氧调控维持摇床转速在150-250rpm，直至40-46h后发酵结束；两步溶氧调控在发酵的前期维持摇床转速在180rpm-250rpm，当菌体湿重达到20-30g/L，调节摇床转速在100-200rpm，直至42-48h发酵结束；三步溶氧调控是在发酵的前期维持摇床转速在180rpm-250rpm，当菌体浓度达到15-25g/L，调节摇床转速在120-200rpm，当菌体浓度达到20-30g/L，调节摇床转速在100-170rpm，直至发酵结束；

或发酵罐发酵过程：将发酵培养基在115℃的条件下蒸汽灭菌30min，待罐内发酵培养基的温度降至30℃时，将种子罐内的种子液泵入到发酵罐中，接种体积为发酵体积的5-15％，维持发酵罐内温度25-35℃，添加缓冲盐调节罐内发 酵液pH在4.0-6.0；在发酵过程中可采用恒定溶氧调控、两步溶氧调控或三步溶氧调控，恒定溶氧调控控制通气量恒定为0.8vv^-1m^-1，转速为200-300rpm，发酵时间为36-42h；两步法溶氧调控在发酵前期调节罐内通气量为0.8-1.2vv^-1m^-1，转速为200-300rpm，当菌体湿重达到20-35g/L时，调节罐内通气量为0.2-0.6vv^-1m^-1，转速为150-250rpm，36-44h时发酵结束；三步法溶氧调控控制在发酵前期调节罐内通气量为1.0-1.2vv^-1m^-1，转速为200-300rpm，当菌体湿重达到20-35g/L时，调节罐内通气量为0.5-0.8vv^-1m^-1，转速为200-250rpm，当菌体湿重达30-40g/L时，调节罐内通气量为0.2-0.4vv^-1m^-1，转速为150-200rpm，38-44h时发酵结束；

上述斜面培养基成分为：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积10％，葡萄糖：20g/L，酵母膏：5g/L，玉米浆5g/L，琼脂20g/L，其余为水；

摇瓶种子培养基成分为：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积10％，葡萄糖：20g/L，酵母膏：5g/L，玉米浆5g/L，KH₂PO₄：2.5g/L，MgSO₄·7H₂O：0.5g/L，其余为水；

种子罐种子培养基成分为：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积10％，葡萄糖：10g/L，酵母膏：3g/L，玉米浆3g/L，KH₂PO₄：2.5g/L，MgSO₄·7H₂O：0.5g/L，其余为水；

发酵培养基：含木糖浓度为300g/L的蒸煮液：占培养基体积40％-60％，酵母膏：8-10g/L，玉米浆4-5g/L，KH₂PO₄：2-4g/L，(NH₄)₂HPO₄：2-4g/L，MgSO₄·7H₂O：0.4-0.8g/L，其余为水；

缓冲盐选自乙酸、氢氧化钙、氢氧化钠、氨水、磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或几种组合。 

2.权利要求1的利用农林废弃物制备木糖醇的方法，其特征在于，将7)步骤中的菌株以发酵培养基为底物进行多批次的木糖醇发酵生产。

3.权利要求1或2的利用农林废弃物制备木糖醇的方法，其特征在于，所述农林废弃物是玉米芯、玉米秸秆、小麦秸秆、高粱秸秆、棉籽壳、稻杆、甘蔗渣或桦木。

4.权利要求3的利用农林废弃物制备木糖醇的方法，其特征在于，所述农林废弃物为玉米芯或棉籽壳。 

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