CN103789360B - 一种利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法，通过碱性双氧水对玉米芯预处理，能有效去除玉米芯中的木质素和半纤维素，提高了纤维素的纯度，还使纤维素结构疏松，更易水解，玉米芯的损失率减少到为26.85～27.16%；在此基础上，将经过预处理后的玉米芯原料，进行预酶解，原料中部分纤维素在此过程中转化为小分子糖，再接入戴尔根霉种子液，酶解和发酵同步进行，酶解过程中葡萄糖不断转化为富马酸，解除了后续酶解过程中的大量葡萄糖积累对酶的反馈抑制作用，提高了纤维素转化率和富马酸得率。本发明以玉米芯为原料，为富马酸的生产开辟了新途径，其工业化微生物转化生产经济意义重大。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，尤其涉及一种利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法。
背景技术
纤维质资源的主要成分是纤维、半纤维素和木质素。其中，纤维素、半纤维素是可发酵糖的来源，含量占木质纤维素的66～75%（纤维质原料的绝干重量）。纤维质原料的结构非常复杂，必须经过一定的处理，使其降解成为小分子糖，然后通过戴尔根霉发酵成富马酸。
最初的纤维素酶解发酵制备有机酸是酶解及发酵分步进行，天然木质纤维素原料经预处理后直接进行酶水解时，由于纤维素结构的特征，造成纤维酶解时间长，完全酶解需要72小时以上，同时由于酶解时产生的纤维二塘和葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制，使得纤维素酶解糖得率低，糖浓度低（约在12%以内）。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法，旨在解决现有纤维素酶解、发酵糖得率较低的问题。
本发明是这样实现的，一种利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法，包括以下步骤：
（1）将干燥玉米芯粉碎至40目后与碱性双氧水溶液按质量体积比1g：（1～15）mL混合，在85℃～95℃下处理18h～20h，水洗至中性，烘干，得到预处理玉米芯纤维素；其中，所述碱性双氧水溶液由质量浓度5%～7%的双氧水以及1.5mol/L氢氧化钠组成；
（2）将纤维素酶以1UI/g玉米芯纤维素的量加入到所述预处理玉米芯纤维素中，并用蒸馏水调节固液比为1：10后置于发酵罐中，在50℃温度、120r/min搅拌速度条件下水解16h，得到混合液；
（3）将发酵罐的温度降低并保持在37℃～38℃，将戴尔根霉种子液和发酵营养液加入到所述混合液中，在空气通气量3L/min～3.5L/min、搅拌速度为180r/min～200r/min条件下，通过流加无菌氢氧化钙乳液来控制发酵液pH5.5～6.0，并发酵66h～78h后，得到富马酸发酵液；其中，所述戴尔根霉种子液、发酵营养液以及混合液的体积比为1：1：18。
优选地，在步骤（2）中，所述纤维素酶为依照文献：“高星星，潘丽军，杨培周，王秀洋.里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的条件优化[J].食品科学，2012，33(19):193-198”所记载的制备方法制备得到。
优选地，在步骤（3）中，所述戴尔根霉种子液制备方法为：将浓度为（1～10）×105CFU/mL的戴尔根霉孢子液以体积比1:10接入种子培养基中，在30℃～32℃、180r/min～200r/min条件下培养16h～18h；其中，所述种子培养基组成为：葡萄糖30g/L～40g/L，(NH4)2SO48g/L～10g/L，酵母浸粉1.5g/L～2.0g/L，KH2PO41.0g/L～1.5g/L，MgSO40.3g/L～0.4g/L，MnSO40.3g/L～0.4g/L，FeSO40.02g/L～0.03g/L。
优选地，所述戴尔根霉菌种为产富马酸戴尔根霉（Rhizopusdelemar）CICC41341，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
优选地，在步骤（2）中，所述发酵营养液组成为：(NH4)2SO480.0g/L～100g/L，酵母粉5.0g/L～6.0g/L，KH2PO410g/L～12g/L，MgSO4·7H2O6.6g/L～7.2g/L，MnSO4·H2O6g/L～7g/L，FeSO4·7H2O0.40g/L～0.5g/L，以及CaCl240g/L～50g/L。
本发明克服现有技术的不足，提供一种利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法，通过将玉米芯用碱性双氧水预处理，将预处理玉米芯用纤维素粗酶液酶解，再加入戴尔根霉种子液和发酵营养液进行发酵后得到富马酸发酵液，所得富马酸发酵液中，富马酸含量达到53.24～56.37g/L，富马酸得率为0.46～0.53g/g玉米芯纤维素。
在本发明中，通过碱性双氧水对玉米芯预处理，能有效去除玉米芯中的木质素和半纤维素，提高了纤维素的纯度，还使纤维素结构疏松，更易水解，玉米芯的损失率减少到为26.85～27.16%。
此外，要提高纤维素酶解率，必须解决酶解过程中的纤维二塘及葡萄糖对酶的反馈抑制问题，在本发明中，将经过预处理后的玉米芯原料，进行预酶解，原料中部分纤维素在此过程中转化为小分子糖，再接入戴尔根霉种子液，酶解和发酵同步进行。酶解过程中葡萄糖不断转化为富马酸，解除了后续酶解过程中的大量葡萄糖积累对酶的反馈抑制作用，提高了纤维素转化率和富马酸得率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例所用材料来源：玉米芯来自安徽省北部徐淮地区；粉碎机为摇摆式粉碎机，型号HK-10B；；(NH4)2SO4、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2均为国药集团生产；戴尔根霉RhizopusdelemarCICC41341购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
纤维素酶的制备参考“高星星，潘丽军，杨培周，王秀洋.里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的条件优化[J].食品科学，2012，33(19):193-198;”的方法，具体制备过程如下：
（1）菌种：里氏木霉(TrichodermaresseiCGMCC3.03711)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，黑曲霉(AspergillusnigerCICC41254)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
原料：玉米秸秆，购自安徽省合肥市肥东县，将其粉碎至40目，碱性双氧水溶液浸泡30h，用自来水洗至中性，放入烘箱中烘干，作为发酵产酶基质备用。
（2）菌种保藏斜面培养基：马铃薯培养基(PDA)。
（3）Mandel’s菌丝体培养液配方：常量元素液：KH2PO42.0g，(NH4)2SO41.4g，MgSO40.3g，CaCl20.3g，加600mL蒸馏水使之溶解。微量元素液：FeSO4·7H2O5.0mg/L，MnSO4·H2O1.6mg/L，ZnSO4·7H2O1.4mg/L，CoCl22.0mg/L，加蒸馏水200mL使之溶解。将常量元素液与微量元素液混合后，用HCl调pH5.5，再以蒸馏水定容于1000ml即为Mandel’s无机盐营养液。都以0.1MpH4.8柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液配制。
（4）产纤维素酶培养基(g/L)：葡萄糖1，蒸汽爆破渣30(绝干)，(NH4)2SO42.20，尿素0.5，蛋白胨1，KH2PO42.0，CaCl20.30，MgSO4·7H2O0.08，FeSO4·7H2O0.005，MnSO4·H2O0.0016，ZnSO4·7H2O0.0014，CoCl20.0037，Tween802滴，初始pH值4.8，装液量50mL。
（5）里氏木霉和黑曲霉种子液制备：以洗孢子的形式将PDA培养基上的里氏木霉或黑曲霉接入到250mL三角瓶中，装液量100mL，接种量10%(v/v，孢子悬液浓度为1×106个/mL)，32℃、200r/min的条件下培养18h～24h。
（6）产酶条件：黑曲霉延迟接种时间36h，里氏木霉与黑曲霉接种比例5:1，发酵时间7d，固液比为2:50(g/mL)Tween-80浓度4mL/L、pH5.0和装液量50mL/250mL。
（7）粗酶液制备：将发酵液于4℃、6000r/min离心10min所得上清液即为纤维素酶粗酶液。
（8）纤维素酶滤纸酶活(FPA)的测定方法:取新华定性滤纸一条(60mm×10mm，约50mg)卷成筒状，投入试管底部，加1.4mLpH4.8的0.05M柠檬酸缓冲液，再加入适当稀释的酶液0.1mL，盖上塞子，将其置于50℃恒温水浴摇床中振荡保温30分钟（先将酶液预热5分钟）。取出试管迅速加入DNS试剂3mL，沸水中煮5分钟，冷却至室温，加蒸馏水定容至25mL，混合均匀。当滤纸沉降后，取上清液在540nm处测吸光度。根据事先做好的葡萄糖标准曲线计算出生成的还原糖量(mg)，并按下式计算酶活(IU/mL)：
FPA=生成的糖(mg)×1000×总稀释倍数/130×30×纤维素酶体积(mL)。
测得，自制纤维素酶滤纸酶活为1.224IU/mL。
实施例1
10L发酵罐规模下利用玉米芯预水解同步发酵产富马酸具体操作步骤如下：
（1）将晒干的1.5kg的玉米芯粉碎至40目后，加入到承有15kg的质量浓度为3%的双氧水、1.5mol/LNaOH的碱性双氧水溶液的半自动加热过滤桶中混匀，调节温度到90℃，时间为18h，进行预处理。处理后通过过滤装置回收碱性双氧水，并将滤渣洗至中性，烘干，获得预处理玉米芯纤维素。
（2）称取1kg所述预处理玉米芯纤维素，加入到10L发酵罐中，在121℃下灭菌15min。待冷却至50℃时，向发酵罐中加入纤维素酶液820mL，无菌水8.18L，控制温度为50℃，搅拌转速为120r/min，预水解16h。
（3）预水解完成后，将发酵罐的温度降低，并保持在发酵温度38℃。向发酵罐中接入500mL戴尔根霉（Rhizopusdelemar）CICC41341的种子液和500mL无菌发酵营养液，营养液组分为：(NH4)2SO480.0g/L，酵母粉5.0g/L，KH2PO410g/L，MgSO4·7H2O6.6g/L，MnSO4·H2O6g/L，FeSO4·7H2O0.40g/L，CaCl240g/L。调节空气通气量为3L/min，搅拌转速为180r/min，流加无菌氢氧化钙乳液来控制发酵液pH5.5～6.0，培养72h，最终发酵液中富马酸含量为55.64g/L。
实施例2
500L规模发酵罐下利用玉米芯预水解同步发酵产富马酸具体操作步骤如下：
（1）将晒干的75kg的玉米芯粉碎至40目后，加入到盛有750kg的3%双氧水、1.5mol/LNaOH的碱性双氧水溶液的半自动加热过滤桶中混匀，调节温度到90℃，时间为18h，进行预处理。处理后通过过滤装置回收碱性双氧水，并将滤渣洗至中性，烘干，获得预处理玉米芯纤维素。
（2）称取50kg玉米芯纤维素，加入到500L发酵罐中，在121℃下灭菌15min。待冷却至50℃时，向发酵罐接入纤维素酶液41L，无菌水409L，控制温度为50℃，搅拌转速为120r/min，预水解16h。
（3）预水解完成后，将发酵罐的温度降低，并保持在发酵温度38℃。向发酵罐中接入25L戴尔根霉（Rhizopusdelemar）CICC41341的种子液和25L无菌发酵营养液，营养液组分为：(NH4)2SO480.0g/L，酵母粉5.0g/L，KH2PO410g/L，MgSO4·7H2O6.6g/L，MnSO4·H2O6g/L，FeSO4·7H2O0.40g/L，CaCl240g/L。调节空气通气量为200L/min，搅拌转速为100r/min，流加无菌氢氧化钙乳液来控制发酵液pH5.5-pH6.0，培养72h，得到最终发酵液中富马酸含量为53.64g/L。
实施例3
实验室摇瓶下利用玉米芯预水解同步发酵产富马酸具体操作步骤如下：
（1）将晒干的15g的玉米芯粉碎至40目后，加入到盛有150g的3%双氧水、1.5mol/LNaOH的碱性双氧水溶液的烧杯中混匀，放置于水浴摇床中，调节温度到90℃，时间为18h，转速为100r/min，进行预处理，处理后用100目纱布过滤，回收碱性双氧水，将滤渣洗至中性，烘干，获得预处理玉米芯纤维素。
（2）称取10g玉米芯纤维素，倒入250mL三角瓶中，封口，在121℃下灭菌15min。待冷却至50℃时，向三角瓶中接入纤维素酶液8.2mL，无菌水81.8mL，控制水浴摇床温度为50℃，转速为150r/min，预水解16h。
（3）预水解完成后，将三角瓶降温至38℃，接入5mL戴尔根霉（Rhizopusdelemar）CICC41341的种子液和5mL无菌发酵营养液，营养液组分为：(NH4)2SO480.0g/L，酵母粉5.0g/L，KH2PO410g/L，MgSO4·7H2O6.6g/L，MnSO4·H2O6g/L，FeSO4·7H2O0.40g/L，CaCO3700g/L。然后置于恒温培养箱中，在38℃，转速为200r/min的条件下，培养72h，最终发酵液中富马酸含量为56.37g/L。
相比与现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明以玉米芯为原料，为富马酸的生产开辟了新途径；生物质转化发酵的方法不仅能够避免使用不可再生的化石原料，而且耗能少，污染小；富马酸作为一种重要的四碳平台化合物，其工业化微生物转化生产意义重大。
（2）本发明采用的碱性双氧水处理方法，该方法能有效去除木质素和半纤维素，提高纤维素的纯度，并且处理条件不剧烈，能耗小。
（3）本发明采用预酶解可有效提高发酵初始糖浓度，还可有效抑制纤维素酶中杂菌的生长，有利于戴尔根霉的培养；并且预水解阶段水解效率高，能有效缩短生产富马酸的时间，从而降低生产成本，提高经济效益。
（4）本发明采用同步发酵生产富马酸；同步发酵是水解和发酵同步进行，其优点在于纤维素酶水解速率相对较稳定，能够提供比较稳定、适中的糖浓度，适于菌株的持续发酵；在同步发酵过程中戴尔根霉不断将对纤维素酶具有反馈抑制作用的单糖转化为有机酸，保证了纤维素酶的活性，有效提高了纤维素的水解率和水解速度，从而提高富马酸的产量和产酸强度。
（5）菌株的发酵制备工艺稳定，有利于工业化生产。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将干燥玉米芯粉碎至40目后与碱性双氧水溶液按质量体积比1g：(1～15)mL混合，在85℃～95℃下处理18h～20h，水洗至中性，烘干，得到预处理玉米芯纤维素；其中，所述碱性双氧水溶液由质量浓度5％～7％的双氧水以及1.5mol/L氢氧化钠组成；
(2)将纤维素酶以1UI/g玉米芯纤维素的量加入到所述预处理玉米芯纤维素中，并用蒸馏水调节固液比为1：10后置于发酵罐中，在50℃温度、120r/min搅拌速度条件下水解16h，得到混合液；
(3)将发酵罐的温度降低并保持在37℃～38℃，将戴尔根霉种子液和发酵营养液加入到所述混合液中，在空气通气量3L/min～3.5L/min、搅拌速度为180r/min～200r/min条件下，通过流加无菌氢氧化钙乳液来控制发酵液pH5.5～6.0，并发酵66h～78h后，得到富马酸发酵液；其中，所述戴尔根霉种子液、发酵营养液以及混合液的体积比为1：1：18。
2.如权利要求1所述的利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述戴尔根霉种子液制备方法为：将浓度为(1～10)×105CFU/mL的戴尔根霉孢子液以体积比1:10接入种子培养基中，在30℃～32℃、180r/min～200r/min条件下培养16h～18h；其中，所述种子培养基组成为：葡萄糖30g/L～40g/L，(NH4)2SO48g/L～10g/L，酵母浸粉1.5g/L～2.0g/L，KH2PO41.0g/L～1.5g/L，MgSO40.3g/L～0.4g/L，MnSO40.3g/L～0.4g/L，FeSO40.02g/L～0.03g/L。
3.如权利要求2所述的利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法，其特征在于，所述戴尔根霉菌种为产富马酸戴尔根霉(Rhizopusdelemar)CICC41341，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
4.如权利要求1所述的利用玉米芯纤维素发酵制备富马酸发酵液的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述发酵营养液组成为：(NH4)2SO480.0g/L～100g/L，酵母粉5.0g/L～6.0g/L，KH2PO410g/L～12g/L，MgSO4·7H2O6.6g/L～7.2g/L，MnSO4·H2O6g/L～7g/L，FeSO4·7H2O0.40g/L～0.5g/L，以及CaCl240g/L～50g/L。
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