CN101423855B - 一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法，其是以海带下脚料为原料，将该原料将其经过纤维素酶酶解后灭酶，离心，取上清液入发酵罐，接种深层发酵的灵芝菌种，在好氧条件下快速发酵，发酵后经过滤得到发酵液和灵芝菌丝体，将发酵液进行乙醇沉淀，得到海带多糖、灵芝多糖组合物，将灵芝菌丝体进行烘干，提取灵芝多糖。本发明采用酶处理和灵芝菌种发酵相结合的方法对海带下脚料进行处理，缩短了发酵时间，同时得到了灵芝胞内及胞内多糖以及海带多糖，该制备工艺合理有效，开创了一新的工艺路线，实现了海带下脚料的综合利用，降低了生产成本，提高了经济效益，同时减少了对环境的污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖类的制备，尤其是一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法。
背景技术
我国是海洋大国，海带产量占世界总产量的一半，位居世界首位。我国目前已经形成了以褐藻胶、甘露醇、碘为主要的海藻化工产品体系。但是，按干物质计，海带的工业利用率仅为30％，还有约2/3的海带下脚料尚未得到利用，不但浪费了大量的自然资源，而且还带来一系列环境污染问题。另外，海藻化工生产企业大多分布于沿海地区，大量富含有机质和营养盐的废弃物已成为水体富营养化和赤潮诱发的潜在化学因素，给海洋渔业经济和生态带来破坏和影响。
目前，对海带下脚料的产品加工主要是以化学方法为主，如酸或碱提取下脚料中具有生理活性的某些有效物质如海带多糖、褐藻胶、有机碘等。例如：在2007年3月21日公告的CN1305885C中国发明专利说明书中公开的“海带中L-褐藻糖的制备方法”、2006年10月4日公开的CN1840469A中国发明专利申请公开说明书中公开的“一种从海带中提取碘的方法”、CN1840518A中国发明专利申请公开说明书中公开的“一种从海带中提取甘露醇的方法”、CN1840548A中国发明专利申请公开说明书中公开的“一种以鲜海带为原料生产褐藻胶的方法”，上述公开文件中所公开的工艺方法均是采用化学法，这种化学法制备海带产品存在着得率低的不足，并且具有二次污染，且酸或碱对于终端食品安全存在潜在的危害性。
灵芝是食药两用菌，其具有较高的营养价值。另外，它还具有抗衰老，提高人体免疫力，抑制肿瘤等功效，它包含多种生理活性物质，其中最主要的是灵芝多糖。随着生物培养条件的日益成熟，灵芝与其他微生物一样具有了适应型强、周期短、可再生等优点。
在公开的文件中，只见到海带多糖或灵芝多糖的单一制备方法。如2008年3月5日公开的CN101134783C中国发明专利申请公开说明书中公开的“一种海带多糖的制备方法”，其包括原料处理、粉碎、乙醇脱脂脱色、超声波破壁、酶处理与真空提取，以及真空冷冻干燥技术的工艺步骤。如2007年3月28日公告的CN1307314C中国发明专利说明书中公开了一种“酶解制备灵芝多糖的方法”，它是采用斜面菌种逐级扩培获得灵芝真菌发酵液，调节含有菌丝体的发酵液pH值及温度，借助灵芝菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灵芝菌丝体进行酶解，再向发酵液中加入纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶及中性蛋白酶，进行酶解，再经灭酶、过滤、浓缩、醇沉及分离等步骤得到灵芝多糖。2006年6月14日公开的CN1786033A中国发明专利申请公开说明书中公开的“灵芝多糖的制备方法”，其是将灵芝子实体经前处理、微滤、冷冻分离、膜分离、膜浓缩、减压浓缩、减压干燥而得到的灵芝多糖产品。2007年3月21日公开的CN1931880A中国发明专利申请公开说明书中公开的“灵芝多糖的制备方法及应用”，其是采用渗透的原理，使孢子内活性物质通过渗透交换平衡，以使孢子内的活性物质充分释放。同时本发明还将用中性盐溶液提取后的残渣再采用有机酸和微碱性的溶剂进行提取，通过不同溶剂提取后的多糖组合成复合多糖。
目前，还未见到过利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备海带灵芝多糖、灵芝多糖的报道。
发明内容
为了克服现有技术中海带产品采用化学法制备存在得率低、具有二次污染、且酸或碱对于终端食品安全存在潜在的危害性及制备的多糖产品品种单一的不足，本发明提供一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法。本发明充分利用海带加工产生的下脚料，通过灵芝分泌的酶类和海带下脚料中复杂的有机化合物，合成富含灵芝多糖的菌体细胞，同时获得富含海带多糖及灵芝胞外多糖的发酵液，提取得到了灵芝胞内、胞外多糖以及海带多糖，增加了海带产品的附加值，同时减少了对环境的污染。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法，其特征在于：是以海带下脚料为原料，将该原料采用纤维素酶酶解处理后灭酶，离心，取海带酶解上清液入空消的发酵罐中，灭菌后接种深层发酵的灵芝菌种，在好氧条件下快速搅拌发酵，发酵后经过滤得到发酵液和灵芝菌丝体，该发酵液中富含海带多糖和灵芝胞外多糖，该灵芝菌丝体富含灵芝胞内多糖及少量粘附菌丝表面的胞外多糖，将发酵液进行乙醇沉淀，得到海带多糖和灵芝胞外多糖组合物；将灵芝菌丝体进行烘干，提取灵芝多糖。
所述的将海带下脚料采用纤维素酶酶解，是将海带下脚料按1：40—60的比例加水，充分吸胀后，加入纤维素酶进行酶解，所述的纤维素酶酶活为40000uI/g，纤维素酶用量为200—400uI/g海带下脚料干物质，用柠檬酸或醋酸调节pH值为4.0—6.0，酶解温度45℃—65℃，酶解时间6—12小时，酶解结束后用碳酸氢钠调节至中性，90℃-100℃灭酶10-20分钟。
所述的将置入发酵罐的海带酶解上清液接种的深层发酵灵芝菌种为30℃、160rpm液体深层二级培养共7天而成，接种量为海带酶解上清液的4—8％，所述的在好氧条件下快速搅拌发酵，是将海带酶解上清液pH值控制在6.0—7.0，发酵温度为28±2℃，搅拌转速在0—24小时为250rpm，24小时—60小时为150rpm，发酵罐内压力0.03—0.05MPa，D03—4L/分钟。
所述的与乙醇沉淀的发酵液，其在沉淀前进行真空浓缩，控制温度为60—75℃，浓缩至原体积的1/5—1/3，所述的发酵液在与乙醇进行沉淀，其乙醇用量与浓缩液间按1∶1—3∶1的比例。
所述的将灵芝菌丝体进行烘干，提取灵芝多糖，是将灵芝菌丝体进行真空烘干，温度为55℃—65℃，至恒重为止，再用0.5M的NaOH溶液进行提取，碱液与菌丝体(体积：质量)为3∶1—4∶1，提取温度60℃—75℃，提取时间4-5小时，得到灵芝多糖。
所述的海带酶解上清液入空消的发酵罐灭菌，是将置入空消的发酵罐的海带酶解上清液进行实消，所述的空消和实消的温度均为121℃，时间均为20分钟。
本发明的有益效果是，本发明的发酵制备工艺合理有效，开创了灵芝发酵海带下脚料制备灵芝多糖的工艺路线，实现了海带下脚料的综合利用，降低了生产成本，提高了经济效益，同时减少了对环境的污染；采用酶处理和发酵相结合的方法进行海带下脚料处理，缩短了发酵时间，同时得到了灵芝胞内及胞内多糖以及海带多糖；利用海带酶解处理后的残渣可以用来加工饲料，进一步拓宽了海带残渣的利用率；采用的真空干燥，避免热力过高对多糖生理活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
称取海带热水浸提海带汁后的海带下脚料140kg，加水7000kg，充分吸胀后，加入纤维素酶1kg，利用1M的柠檬酸调节pH值5.0，50℃水解10小时，酶解结束后用1M的碳酸氢钠溶液调节至中性，控制温度为100℃处理10分钟灭酶，利用台式离心机4000rpm，离心10分钟，得到沉淀物和海带酶解液。沉淀物烘干粉碎后作为饲料。取海带酶解液的上清液直接入经过空消的发酵罐，然后进行实消，空消和实消的温度均为121℃，时间均为20分钟，待罐温降低至30℃左右接入二级灵芝菌种，该二级灵芝菌种为30℃、160rpm液体深层二级培养共7天而成，接种量为海带酶解上清液的8％，pH值控制在6.5，发酵温度为28℃，搅拌转速在0-24小时为250rpm，24小时-60小时为150rpm，发酵罐内压力0.05MPa，D03L/分钟，得到发酵液，发酵液进行300目筛网过滤，得滤液和滤渣。滤液进行抽真空浓缩，温度60℃，浓缩至原体积的1/5，乙醇与浓缩液按2∶1用量进行沉淀，得到沉淀物即为海带多糖及灵芝胞外多糖的组合物。而滤渣主要为灵芝菌丝体，则将其进行真空干燥，温度为55℃，至恒重为止，粉碎，再用0.5M的NaOH溶液进行提取，碱液与菌丝体(体积：质量)为4∶1，提取温度65℃，提取时间4.5小时，得到灵芝多糖。
实施例2
称取海带热水浸提海带汁后的海带下脚料160kg，加水9600kg，充分吸胀后，加入纤维素酶1.5kg，利用1M的醋酸调节pH值6.0，60℃水解6小时，酶解结束后用1M的碳酸氢钠调溶液节至中性，控制温度为100℃处理10分钟灭酶，利用台式离心机4000rpm，离心10分钟，得到沉淀物和海带酶解液。沉淀物烘干粉碎后作为饲料。取海带酶解液的上清液直接入经过空消的发酵罐，然后进行实消，空消和实消的温度均为121℃，时间均为20分钟，待发酵罐罐温降低至30℃左右接入二级灵芝菌种，该二级灵芝菌种为30℃、160rpm液体深层二级培养共7天而成，接种量为海带酶解上清液的5％，pH值控制在6.0，发酵温度为27℃，搅拌转速在0-24小时为250rpm，24小时-60小时为150rpm，发酵罐内压力0.04MPa，DO4L/分钟，得到发酵液，发酵液进行300目筛网过滤，得滤液和滤渣。滤液进行抽真空浓缩，温度65℃，浓缩至原体积的1/4，乙醇与浓缩液按2∶1用量进行沉淀，得到沉淀物即为海带多糖及灵芝胞外多糖的组合物。而滤渣主要为灵芝菌丝体，则将其进行真空干燥，温度为62℃，至恒重为止，粉碎，再用0.5M的NaOH溶液进行提取，碱液与菌丝体(体积：质量)为3∶1，提取温度75℃，提取时间4小时，得到灵芝多糖。
实施例3
称取海带热水浸提海带汁后的海带下脚料100kg，加水4000kg，充分吸胀后，加入纤维素酶1kg，利用1M的醋酸调节pH值4.5，45℃水解12小时，酶解结束后用1M的碳酸氢钠溶液调节至中性，95℃处理15分钟灭酶，利用台式离心机4000rpm，离心10分钟，得到沉淀物和海带酶解液，沉淀物烘干粉碎后作为饲料，取海带酶解液的上清液直接入经过空消的发酵罐，然后进行实消，空消和实消的温度均为121℃，时间均为20分钟，待罐温降低至30℃左右接入二级灵芝菌种，该二级灵芝菌种30℃、160rpm液体深层二级培养共7天而成，接种量为海带酶解上清液的6％，pH值控制在7.0，发酵温度为26℃，搅拌转速在0-24小时为250rpm，24小时-60小时为150rpm，发酵罐内压力0.03MPa，DO3.5L/分钟，得到发酵液，发酵液进行300目筛网过滤，得滤液和滤渣。滤液进行抽真空浓缩，温度75℃，浓缩至原体积的1/4，乙醇与浓缩液按3∶1用量进行沉淀，得到沉淀物即为海带多糖及灵芝胞外多糖的组合物。而滤渣主要为灵芝菌丝体，则将其进行真空干燥，温度为65℃，至恒重为止，粉碎，再用0.5M的NaOH溶液进行提取，碱液与菌丝体(体积：质量)为3.5∶1，提取温度60℃，提取时间5小时，得到灵芝多糖。
实施例4
称取海带热水浸提海带汁后的海带下脚料200kg，加水9000kg，充分吸胀后，加入纤维素酶1.2kg，利用1M的柠檬酸调节pH值4.0，55℃水解8小时，酶解结束后用1M的碳酸氢钠溶液调节至中性，控制温度为90℃处理20分钟灭酶，利用卧式离心机控制转速3000rpm离心15分钟，得到沉淀物和海带酶解液。沉淀物烘干粉碎后作为饲料。取海带酶解液的上清液直接入经过空消的发酵罐，然后进行实消，空消和实消的温度均为121℃，时间均为20分钟。待罐温降低至30℃左右接入二级灵芝菌种，该二级灵芝菌种为30℃、160rpm液体深层二级培养共7天而成，接种量为海带酶解上清液的4％，pH值控制在6.0，发酵温度为30℃，搅拌转速在0-24小时为250rpm，24小时-60小时为150rpm，发酵罐内压力0.05MPa，DO4L/分钟，得到发酵液，发酵液进行300目筛网过滤，得滤液和滤渣。滤液进行抽真空浓缩，温度70℃，浓缩至原体积的1/3，乙醇与浓缩液按1∶1用量进行沉淀，得到沉淀物即为海带多糖及灵芝胞外多糖的组合物。而滤渣主要为灵芝菌丝体，则将其进行真空干燥，温度为60℃，至恒重为止，粉碎，再用0.5M的NaOH溶液进行提取，碱液与菌丝体(体积：质量)为3∶1，提取温度70℃，提取时间4.5小时，得到灵芝多糖。
Claims (4)
1.一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法，其特征在于：是以海带下脚料为原料，将海带下脚料按1∶40-60的比例加水，充分吸胀后，加入纤维素酶进行酶解，所述的纤维素酶酶活为40000uI/g，纤维素酶用量为200-400uI/g海带下脚料干物质，用柠檬酸或醋酸调节pH值为4.0-6.0，酶解温度45℃-65℃，酶解时间6-12小时，酶解结束后用碳酸氢钠调节至中性，90℃-100℃灭酶10-20分钟，离心，取海带酶解上清液入空消的发酵罐中，灭菌后接种深层发酵的灵芝菌种，该深层发酵的灵芝菌种为30℃、160rpm液体深层二级培养共7天而成，接种量为海带酶解上清液的4-8％，在将海带酶解上清液pH值控制在6.0-7.0，发酵温度为28±2℃，搅拌转速在0-24小时为250rpm，24小时-60小时为150rpm，发酵罐内压力0.03-0.05MPa，DO3-4L/分钟的条件下搅拌发酵，发酵后经过滤得到发酵液和灵芝菌丝体，该发酵液中富含海带多糖和灵芝胞外多糖，该灵芝菌丝体富含灵芝胞内多糖及少量粘附菌丝表面的胞外多糖，将发酵液进行乙醇沉淀，得到海带多糖和灵芝胞外多糖组合物；将灵芝菌丝体进行烘干，提取灵芝多糖。
2.根据权利要求1所述的一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法，其特征在于：所述的与乙醇沉淀的发酵液，其在沉淀前进行真空浓缩，控制温度为60-75℃，浓缩至原体积的1/5-1/3，所述的发酵液再与乙醇进行沉淀，其乙醇用量与浓缩液间按1∶1-3∶1的比例。
3.根据权利要求1所述的一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法，其特征在于：所述的将灵芝菌丝体进行烘干，提取灵芝多糖，是将灵芝菌丝体进行真空烘干，温度为55℃-65℃，至恒重为止，再用0.5M的NaOH溶液进行提取，碱液与菌丝体(体积∶质量)为3∶1-4∶1，提取温度60℃-75℃，提取时间4-5小时，得到灵芝多糖。
4.根据权利要求1所述的一种利用灵芝菌种发酵海带下脚料制备多糖的方法，其特征在于：所述的海带酶解上清液入空消的发酵罐灭菌，是将置入空消的发酵罐的海带酶解上清液进行实消，所述的空消和实消的温度均为121℃，时间均为20分钟。
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