CN103504368A - 一种海带风味食品配料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海带风味食品配料及其制备方法。本发明海带风味食品配料的制备方法为：首先采用复合酶降解海带有效成分，然后采用谷氨酸棒杆菌及戊糖片球菌混合菌对海带酶解产物进行发酵，进一步降解海带有效成分并释放具有功能性的次生代谢产物，发酵产物经烘干或喷雾干燥得到具有浓郁海带特征风味、营养成分易吸收、并具有抗氧化活性及抑菌性的海带食品，从而提高产品的附加值。本发明突破了常规的海带深加工工艺，将复合酶解与食品级微生物发酵有机结合起来，解决了传统海带深加工工艺（常规单纯酶解或发酵）利用率低、产品风味不突出、营养价值不能有效利用、功能性差等缺点，显著提高了海带产品的应用领域及经济价值。
Description
技术领域
本发明属于食品配料技术领域，食品配料指的是公认的、安全的可食用物质，指用于生产制备某种食品并在成品中出现的任何物质（但不包括食品添加剂），具体涉及一种海带风味食品配料及其制备方法。
背景技术
海带是我国一种重要的经济型褐藻，产量多，分布范围广，食用历史悠久。海带营养丰富，内含大量的膳食纤维、褐藻胶、岩藻糖及碘、甘露醇等多种有效成分，具有抗病毒、抗癌、抗凝血、降血脂等多种药理活性功能。但是，海带质地坚硬，直接食用不易消化吸收，特别是内含的褐藻胶、岩藻糖等大分子多糖不能发挥其生理功能。因此，直接将海带原料加入食品中，不能很好发挥其功能。现有的海带深加工工艺主要是将海带洗净后切丝做成海带丝、海带结或者磨碎成海带粉制成海带酱等低端产品，存在利用率低、产品风味不突出、营养价值不能有效利用、功能性差等缺点。
发明内容
针对目前海带制品营养成分吸收差、功能性不突出的缺点，本发明提供了一种具有浓郁海带特征风味、营养成分易吸收、并具有抗氧化活性及抑菌性的海带风味食品配料。
本发明所提供的海带风味食品配料，其营养成分包括：
可溶性总糖≥13％（质量百分含量），
可溶性多糖≥8％，
总蛋白≥10％，
氨基酸≥2％。
所述可溶性总糖是指可溶性海带多糖和单糖，具体包括褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉、葡萄糖等。
所述可溶性多糖是指可溶性海带多糖，具体包括褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉等。
所述总蛋白是指海带中的蛋白及发酵产生的菌体蛋白。
所述氨基酸是指原料中的蛋白质经蛋白酶降解后产生的游离氨基酸。
本发明还提供了一种制备上述海带风味食品配料的方法。
本发明所提供的制备上述海带风味食品配料的方法，是以海带为原料，先用复合酶对海带中的有效成分（纤维素、褐藻胶等）进行降解，再利用食品级微生物对海带酶解产物进行发酵，发酵结束后对发酵液进行灭菌，发酵液经喷雾干燥或烘干，得到海带风味食品配料。
具体来讲，所述制备海带风味食品配料的方法，是先用复合酶对海带原料进行酶解，再用多种食品级微生物菌液分别进行发酵后得到海带风味食品配料。所述复合酶由纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶按质量比2∶1∶1混合而成。所述微生物菌液为谷氨酸棒杆菌菌液和戊糖片球菌菌液。
所述发酵依次为，先用谷氨酸棒杆菌对酶解液进行第一次发酵，再用戊糖片球菌对第一次发酵液进行第二次发酵；第二次发酵液在经过灭菌、干燥后得到海带风味食品配料。
所述海带原料为新鲜海带浆液或干海带粉，干海带粉酶解前加水。
更具体的海带风味食品配料的制备方法，可包括以下步骤：
1）海带原料预处理：
将新鲜海带洗净，用刀片式研磨仪进行粗粉碎，加入海带湿重15-20％的水进行研磨，再用胶体磨进行精细打浆研磨至60-120目（优选为100目）得到海带浆液；或者用晾干的海带，除杂、除尘后后采用超微粉碎机粉碎至60-120目（优选为100目）干海带粉，兑水10-20倍，混匀得到干海带粉液；
2）酶解：
将打浆研磨的海带浆液或干海带粉液升温至40-50℃，调节pH5.0-6.0，然后加入海带干重（新鲜海带烘干至恒重的干重,为新鲜海带重量的7-8％）1-2％的复合酶（纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶=2∶1∶1，质量比），搅拌酶解3-6小时，得到酶解液；
3）发酵：
将酶解结束后的酶解液升温至110℃保温10min，冷却至30℃，然后调节pH7.0-7.5，按酶解液体积2-5％接入谷氨酸棒杆菌菌液，于200-400rpm培养4-8h，得到第一次发酵液；
将第一次发酵液温度升温至37℃，然后按照第一次发酵液体积2-5％接入戊糖片球菌菌液继续发酵至pH降至5.0以下停止发酵，得到第二次发酵液；
4）灭菌：
发酵结束，对第二次发酵液升温至95℃灭菌10min；
5）干燥：
灭菌后发酵液经喷雾干燥或热风干燥，得到海带风味食品配料。
在上述海带风味食品配料的制备方法中，所述步骤2）酶解所用的复合酶（纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶）的主要功能是将海带原料中的纤维素、褐藻胶以及植物蛋白抽提出来并降解成可溶性多糖、寡糖及小分子肽；本发明所用的纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶均为市售产品。
所述步骤3）中谷氨酸棒杆菌菌液的制备方法为：从斜面平板中接种谷氨酸棒杆菌到种子培养基（种子培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，丙磺酸（MOPS）42g/L，葡萄糖20g/L，pH7.4的水溶液）中，30℃、200rpm条件下培养12小时，得到一级种子液，然后将一级种子液转接至新鲜种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养8h，得到谷氨酸棒杆菌二级种子液即谷氨酸棒杆菌菌液。
所述步骤3）中戊糖片球菌菌液的制备方法为：从斜面平板中接种戊糖片球菌到种子培养基（种子培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二铵2g/L，七水硫酸镁0.58g/L，七水硫酸锰0.19g/L，吐温80mL/L，pH6.0的水溶液）中，37℃条件下静置培养12小时，得到一级种子液，然后将一级种子液转接至新鲜种子培养基中，37℃条件下静置培养6h，得到戊糖片球菌二级种子液即戊糖片球菌菌液。
本发明提供了一种海带风味食品配料及其制备方法。本发明海带风味食品配料的制备方法中，采用复合酶降解海带有效成分（将海带原料中的有效成分降解成具体功能特性更强的多糖、寡糖、蛋白肽等），采用食用微生物（结合谷氨酸棒杆菌及戊糖片球菌混合发酵）对海带酶解产物进行发酵，进一步降解海带有效成分并释放具有功能性的次生代谢产物，提高发酵产品的抗氧化活性及抑菌性，从而提高产品的附加值，发酵产物经烘干或喷雾干燥得到具有浓郁海带特征风味、营养成分易吸收、并具有抗氧化活性及抑菌性的海带食品配料。本发明突破了常规的海带深加工工艺，将复合酶解与食品级微生物发酵有机结合起来，解决了传统海带深加工工艺（常规单纯酶解或发酵）利用率低、产品风味不突出、营养价值不能有效利用、功能性差等缺点，显著提高了海带产品的应用领域及经济价值。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为不同浓度的海带酶解液、发酵液以及酶解发酵液抗氧化活性测试结果
图2A为不同浓度的海带酶解发酵液对大肠杆菌生长的影响
图2B为不同浓度的海带单纯酶解液对大肠杆菌生长的影响
图2C为不同浓度的海带单纯发酵液对大肠杆菌生长的影响
具体实施方式
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
纤维素酶和果胶酶可购自诺维信（中国）生物技术有限公司，木瓜蛋白酶可购自天津诺奥生物技术有限公司。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、制备海带风味食品配料
谷氨酸棒杆菌和戊糖片球菌均可商业购买，本发明所用的菌株均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，谷氨酸棒杆菌菌株编号CICC 10133，戊糖片球菌菌株编号CICC 22738。纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶也均为商购。
1、谷氨酸棒杆菌菌液的制备：从斜面平板中接种谷氨酸棒杆菌到种子培养基（种子培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，丙磺酸（MOPS）42g/L，葡萄糖20g/L，pH7.4的水溶液）中，30℃、200rpm条件下培养12小时，得到一级种子液，然后将一级种子液转接至新鲜种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养8h，得到谷氨酸棒杆菌二级种子液即谷氨酸棒杆菌菌液。
2、戊糖片球菌菌液的制备方法为：从斜面平板中接种戊糖片球菌到种子培养基（种子培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二铵2g/L，七水硫酸镁0.58g/L，七水硫酸锰0.19g/L，吐温80mL/L，pH6.0的水溶液）中，37℃条件下静置培养12小时，得到一级种子液，然后将一级种子液转接至新鲜种子培养基中，37℃条件下静置培养6h，得到戊糖片球菌二级种子液即戊糖片球菌菌液。
3、制备海带风味食品配料，进行以下操作：
1）原料预处理：
将新鲜海带洗净，先采用刀片式研磨仪进行粗粉碎，研磨过程中加入海带湿重15-20％（按重量）的水，然后再采用胶体磨进行精细打浆研磨至60-120目（优选为100目）得到海带浆液；
2）酶解：
将打浆研磨的海带浆液3kg装入5L酶解反应釜中，升温至50℃（40-50℃均可），调节pH6.0（5.0-6.0均可），然后加入海带干重（取一定量同一批次的新鲜海带，烘干至恒重，计算海带的干重为新鲜海带重量的7-8％）1-2％（具体为2.4-4.8g）的复合酶，复合酶为纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶=2:1:1，质量比混合得到，搅拌酶解3小时（3-6小时均可）得到酶解液；
3）发酵：
将酶解结束后的酶解液倒入5L发酵罐中，升温至110℃保温10min，冷却至30℃，然后调节pH7.5（7.0-7.5均可），按酶解液体积2-5％接入谷氨酸棒杆菌菌液（具体为60-150mL），通气量6L/min，罐压维持0.05MPa，于200rpm（200-400rpm均可）培养8h（4-8h均可），得到第一次发酵液；
然后，将第一次发酵液温度升温至37℃，按照发酵液体积2-5％接入戊糖片球菌菌液（具体为60-150mL）继续发酵至pH降至5.0以下停止发酵，得到第二次发酵液；
4）灭菌：
发酵结束，将第二次发酵液升温至95℃灭菌10min；
5）干燥：
灭菌后发酵液经喷雾干燥（喷雾干燥条件为：进口温度180℃，出口温度100℃）或热风干燥（热风干燥条件为：热风温度80℃），得到海带风味食品配料。
实施例2、制备海带风味食品配料
步骤1和步骤2与实施例1相同。
3、本实施例制备海带风味食品配料，包括以下操作：
1）原料预处理：
采用晾干的海带，除杂、除尘后采用超微粉碎机粉碎至60-120目（优选为100目）得到干海带粉；
2）酶解：
取干海带粉240g，装入5L的酶解反应釜，加入纯水2760mL（兑水10-20倍），混匀得到干海带粉液，升温至40℃（40-50℃均可），调节pH5.0（5.0-6.0均可），然后加入海带干重1-2％（具体为2.4g-4.8g）的复合酶（纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶=2∶1∶1，质量比），搅拌酶解6小时（3-6小时均可）得到酶解液；
3）发酵：
将酶解结束后的酶解液（3L）倒入5L发酵罐中，升温至110℃保温10min，冷却至30℃，然后调节pH7.0（7.0-7.5均可），按酶解液体积2-5％接入谷氨酸棒杆菌菌液（具体为60-150mL），通气量5L/min，罐压维持0.05MPa，于400rpm（200-400rpm均可）培养4h（4-8h均可），得到第一次发酵液；
然后，将第一发酵液温度升温至37℃，按照第一次发酵液体积2-5％接入戊糖片球菌菌液（具体为60-150mL）继续发酵至pH降至5.0以下停止发酵，得到第二次发酵液；
4）灭菌：
发酵结束，将第二次发酵液升温至95℃灭菌10min；
5）干燥：
灭菌后发酵液经喷雾干燥（喷雾干燥条件为：进口温度180℃，出口温度100℃）或热风干燥（热风干燥条件为：热风温度为80℃），得到海带风味食品配料。
试验例1、不同浓度的海带酶解、发酵液抗氧化活性（抗氧化活性检测）
试验方法为：
用10mmol/L的磷酸盐缓冲液（称取2.90g十二水磷酸氢二钠，2.90g二水磷酸二氢钠，置于500mL的容量瓶中，用盐酸将其调节至7.4，用去离子水定容。）适量稀释ABTS自由基溶液得到ABTS自由基稀释液，移取3000μL ABTS自由基稀释液并加入50μL水使其位于734nm处的吸光值为0.7±0.02（说明：只有734nm处的吸光度值在0.7左右，该方法测得的结果才精确。前面提到“适量稀释”是指可用不同浓度的缓冲液稀释，再加水后测734nm处的吸光度值，所以具体加多少水稀释到什么程度，每批次配制的ABTS自由基溶液的稀释度可以不一样，以上仅为一种稀释方式。但吸光值为0.7±0.02为标准），吸光值记为Ablank。
ABTS自由基溶液的配制：称取ABTS（中文化学名称：2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐）19.2mg，转移至5mL的容量瓶中得到ABTS溶液，ABTS的浓度为7mmol/L。称取K2S2O477mg，溶于2mL水中，移取88μL至上述配制的ABTS溶液中得到混合溶液，混合溶液中K2S2O4的最终浓度为2.45mmol/L。加入K2S2O4后的ABTS溶液（混合溶液）于暗处放置12-16h，使ABTS与K2S2O4充分反应，产生ABTS自由基，得到ABTS自由基溶液。
移取3000μL ABTS自由基稀释液，加入50μL样品稀释液，置于暗处反应6min，测定反应液在734nm处的吸光值，记为Asample。
样品为：酶解液（经步骤3之2）的酶解液干燥粉水溶液的上清液）、发酵液（经步骤3之1）海带浆液或干海带粉液直接到步骤3之3）得到二次发酵液干燥粉水溶液的上清液）、酶解发酵液（经步骤3之3）的第二次发酵液干燥粉水溶液的上清液）。
样品稀释液是指将所述样品用去离子水进行适当稀释后的样品溶液。
计算ABTS自由基清除率(％)：
Ablank——以纯水代替样品(其余操作相同)测定的结果;Asanple——样品测定结果。
不同浓度的酶解发酵液、酶解液和发酵液抗氧化活性测试结果如图1所示，可以看出在相同浓度条件下，海带酶解发酵液抗氧化活性显著高于单纯的酶解液以及发酵液，随着浓度的增加，其抗氧化活性相应增强，表明海带经酶解后发酵，得到的产物的生理活性功能显著提高。
试验例2、不同浓度的海带酶解、发酵液对大肠杆菌生长的影响(抑菌性检测)
试验方法为：
采朋微量热法(微量热测定仪TAM III)，跟踪记录大肠杆菌在样品不同浓度下的P-t生长曲线。
样品为：酶解液(经步骤3之2)的酶解液干燥粉水溶液的上清液)、发酵液(经步骤3之1)海带浆液或干海带粉液直接到步骤3之3)得到二次发酵液干燥粉水溶液的上清液)、酶解发酵液(经步骤3之3)的第二次发酵液干燥粉水溶液的上清液)。
具体操作:
(1)移取0、40、80、120、160、2OOuL的2OOmg/mL样品至安瓿瓶中，均用无菌水补足至2OOuL；
(2)取活化后的大肠杆菌对数期菌液，用无菌水稀释10倍后从中取1OOuL，加入到1OOmL的LB液体培养基(LB培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0)，接种3.2mL于上述安瓿瓶中，海带样品终浓度分别为：0、2.35、4.71、7.06、9.41、11.76mg/mL。加瓶盖密封后，迅速放入微量热测定仪(TAM III)中；
(3)跟踪记录大肠杆菌在不同海带提取物浓度下的P-t生长曲线，当曲线重新返回基线时，实验结束。
生长速率常数k及抑制率的计算：
时间为0时，细胞数记为n0，时间为t，细胞数记为nt，则：nt＝n0×exp(k×t)，其中k为生长速率常数;当每个细胞释放的热功率为Pw时，ntPw＝n0×Pw×exp(k×t)；当时间为0时，释放的热功率为P0，时间为t时，释放的热功率为Pt，那么：Pt＝P0×exp(k×t)或者lnPt＝kt+lnP0。选择热功率-时间曲线对数期一系列热功率和时间点，通过指数律计算不同浓度下大肠杆菌的生长速率常数。
样品对大肠杆菌生长的抑制作用可以通过抑制率I来表示，其计算公式为：I=(k0-kc)/k0×100％，其中，k0为不添加任何海带成分的空白对照样品的大肠杆菌的生长速率，kc为不同添加浓度下大肠杆菌的生长速率。当抑制率为50％时，所需添加物浓度记为IC50。
不同浓度的海带酶解发酵液对大肠杆菌生长的影响如图2A所示，不同浓度的海带酶解液对大肠杆菌生长的影响如图2B所示，不同浓度的海带发酵液对大肠杆菌生长的影响如图2C所示，可以看出在相同浓度时，海带酶解发酵液对大肠杆菌生长抑制率明显高于单纯的酶解液和发酵液，表明将酶解与发酵结合起来可有效提高产品的抑菌性能。
试验例3、海带风味食品配料的营养成分检测
采用DNS法测定还原糖含量、采用苯酚硫酸法测定总糖含量，采用lowry法测定蛋白含量，采用氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。
检测样品：实施例1、2中步骤5）经干燥后得到的海带风味食品配料，粉体。
检测结果，本发明海带风味食品配料的营养成分包括：
可溶性总糖13％（质量百分含量）或以上；可溶性总糖是指可溶性海带多糖和单糖，具体包括褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉、葡萄糖等。
可溶性多糖8％或以上；可溶性多糖是指可溶性海带多糖，具体包括褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉等。
总蛋白10％或以上；总蛋白是指海带中的蛋白及发酵产生的菌体蛋白。
氨基酸2％或以上；氨基酸是指原料中的蛋白质经蛋白酶降解后产生的游离氨基酸。
Claims (10)
1.一种海带风味食品配料，其营养成分包括（按质量百分含量）：
可溶性总糖≥13％，
可溶性多糖≥8％，
总蛋白≥10％，
氨基酸≥2％。
2.根据权利要求1所述的海带风味食品配料，其特征在于：
所述可溶性总糖是指可溶性海带多糖和单糖，具体包括褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉、葡萄糖等。
所述可溶性多糖是指可溶性海带多糖，具体包括褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉等。
所述总蛋白是指海带中的蛋白及发酵产生的菌体蛋白。
所述氨基酸是指原料中的蛋白质经蛋白酶降解后产生的游离氨基酸。
3.一种制备海带风味食品配料的方法，先用复合酶对海带原料进行酶解，再用多种食品级微生物菌液分别进行发酵后得到海带风味食品配料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述复合酶由纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶按质量比2∶1∶1混合而成。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述微生物菌液为谷氨酸棒杆菌菌液和戊糖片球菌菌液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述发酵依次为，先用谷氨酸棒杆菌菌液对酶解液进行第一次发酵，再用戊糖片球菌菌液对第一次发酵液进行第二次发酵；第二次发酵液在经过灭菌、干燥后得到海带风味食品配料。
7.根据权利要求3或4或5或6所述的制备方法，其特征在于：所述海带原料为新鲜海带浆液或干海带粉，酶解前加水。
8.根据权利要求3至7任一所述的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1）海带原料预处理：
将新鲜海带洗净，用刀片式研磨仪进行粗粉碎，加入海带湿重15-20％的水进行研磨，再用胶体磨进行精细打浆研磨至60-120目（优选为100目）得到海带浆液；或者用晾干的海带，除杂、除尘后后采用超微粉碎机粉碎至60-120目（优选为100目）干海带粉，兑水10-20倍，混匀得到干海带粉液；
2）酶解：
将打浆研磨的海带浆液或干海带粉液升温至40-50℃，调节pH5.0-6.0，然后加入按海带原料干重的1-2％的复合酶（纤维素酶：果胶酶：木瓜蛋白酶=2∶1∶1，质量比），搅拌酶解3-6小时，得到酶解液；
3）发酵：
将酶解结束后的酶解液升温至110℃保温10min，冷却至30℃，然后调节pH7.0-7.5，按酶解液体积2-5％接入谷氨酸棒杆菌菌液，于200-400rpm培养4-8h，得到第一次发酵液；
将第一次发酵液温度升温至37℃，然后按照第一次发酵液体积2-5％接入戊糖片球菌菌液继续发酵至pH降至5.0以下停止发酵，得到第二次发酵液；
4）灭菌：
发酵结束，对第二次发酵液升温至95℃灭菌10min；
5）干燥：
灭菌后发酵液经喷雾干燥或热风干燥，得到海带风味食品配料。
9.根据权利要求5至8任一所述的制备方法，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌菌液的制备方法为：从斜面平板中接种谷氨酸棒杆菌到种子培养基（种子培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，丙磺酸（MOPS）42g/L，葡萄糖20g/L，pH7.4的水溶液）中，30℃、200rpm条件下培养12小时，得到一级种子液，然后将一级种子液转接至新鲜所述种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养8h，得到谷氨酸棒杆菌二级种子液即谷氨酸棒杆菌菌液；
所述戊糖片球菌菌液的制备方法为：从斜面平板中接种戊糖片球菌到种子培养基（种子培养基成分为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，磷酸氢二铵2g/L，七水硫酸镁0.58g/L，七水硫酸锰0.19g/L，吐温80mL/L，pH6.0的水溶液）中，37℃条件下静置培养12小时，得到一级种子液，然后将一级种子液转接至新鲜所述种子培养基中，37℃条件下静置培养6h，得到戊糖片球菌二级种子液即戊糖片球菌菌液。
10.权利要求3-9任一所述制备方法得到的海带风味食品配料，或权利要求8制备方法中步骤3）或步骤4）得到的第二次发酵液。
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