CN105039453B - 一种具有提高的抗氧化性的米糠多糖的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种具有提高的抗氧化性的米糠多糖的制备方法。该方法包括以稻米加工副产物米糠粕为原料，通过微波沸水提取，淀粉酶和糖化酶酶解处理制得米糠粕水提液，对所述米糠粕水提液进行乳酸菌发酵，将发酵液进行乙醇沉淀，沉淀冷冻干燥即得。通过本发明的方法所制得的米糠多糖与发酵前相比抗氧化性有明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有提高的抗氧化性的米糠多糖的制备方法及应用，更具体地，涉及利用乳酸菌发酵米糠粕水提液提高米糠多糖抗氧化性的方法和制备发酵饮料方面的应用。
背景技术
我国是稻米生产大国，稻谷加工副产物资源丰富。米糠是稻米加工成大米过程中产生的主要副产物，富含脂类、碳水化合物、蛋白质、维生素E及谷维素等营养成分，具有较高的应用价值。米糠经浸出、脱脂处理后得到的脱脂米糠称为米糠粕，米糠粕含有50％以上的膳食纤维，20％～30％的淀粉，20％左右蛋白质以及10％左右的植酸钙，蛋白质和膳食纤维含量较高，并且与米糠相比保质期更长。米糠多糖是米糠粕中重要的功能性成分，是一类结构复杂的杂聚糖，具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖、降脂、抗菌、抗辐射、保鲜等多种功效。米糠多糖的功效与其结构有着重要关系，天然米糠多糖中的某些组分存在分子量大、溶解度小、活性糖基未暴露等问题，使其不能很好的发挥活性作用，因此可通过物理、化学或者生物的方法对米糠多糖进行适当修饰，改善其生物活性。
现关于米糠多糖的研究多集中于多糖的提取和活性检测，对于多糖的结构修饰、修饰产物的活性变化及相关应用研究较少，多糖的生物法修饰也主要集中于利用真菌发酵对米糠多糖进行改性，真菌发酵存在着生长周期长、真菌自身代谢产生的多糖干扰米糠多糖后续的分离纯化等问题，因此寻找一种快速有效的米糠多糖生物修饰方法和简便高效的应用技术，对于提高米糠的利用率，推广米糠多糖的使用具有重要意义。
发明内容
针对目前缺乏快速有效的对米糠多糖进行生物修饰来提高其活性的方法及相关实际应用技术，本发明的一个目的在于提供一种具有提高的抗氧化性的米糠多糖的制备方法，该方法制备的米糠多糖与未经发酵处理的米糠多糖相比具有提高的抗氧化性。
本发明的另一个目的在于提供一种含有提高的抗氧化性的米糠多糖的发酵饮料的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供了一种具有提高的抗氧化性的米糠多糖的制备方法，该方法包括以稻米加工副产物米糠粕为原料，通过微波沸水提取，淀粉酶和糖化酶酶解处理制得米糠粕水提液，对所述米糠粕水提液进行乳酸菌发酵，将发酵液进行乙醇沉淀，将沉淀冷冻干燥得到米糠多糖。通过本发明的方法所制得的米糠多糖与发酵前相比抗氧化性有明显提高。发酵72小时后1mg/mL米糠多糖对·OH自由基清除率为100％，并且此时EC50值与发酵前相比降低20％以上。
进一步地，上述方法中所述微波沸水提取包括：将米糠粕与水按照料液比为1:5～1:10(g/mL)混合，在微波频率为300～500W条件下，辐射1～6分钟，然后，100℃条件下煮沸提取20～40分钟。
所述淀粉酶和糖化酶酶解处理包括：向微波沸水提取获得的提取液中加入淀粉酶和糖化酶，酶解反应4～6小时，其中，淀粉酶的加入量为米糠粕重量的0.25～1％(W/W)，糖化酶的加入量为米糠粕重量的0.1～0.4％(V/W)。在本发明中，优选地，所使用的淀粉酶活力为2000～4000U/mg，糖化酶活力为100000～150000U/mL。
本发明可以使用卫生部颁发的《可用于食品的菌种名单》(卫办监督发〔2010〕65号)中所列的乳酸菌菌株，包括但不限于，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)或其组合。
优选地，进行乳酸菌发酵时，乳酸菌的接种量为1～3％。本文所使用的接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。在本发明的一个实施方案中，将乳酸菌接种至液体MRS种子培养基，培养12小时，培养温度为37℃，摇床转速为200转/分，最后将培养后的种子培养液按照体积百分比1～3％的接种量接种。
进一步地，乳酸菌的发酵时间为72～84小时。
进一步地，发酵液进行乙醇沉淀时，乙醇用量为发酵液体积的3～5倍。优选地，4℃乙醇沉淀18～24小时，离心，沉淀进行冷冻干燥。
本发明还提供了一种含提高的抗氧化性的米糠多糖的发酵饮料的制备方法，该方法包括以稻米加工副产物米糠粕为原料，通过微波沸水提取，淀粉酶和糖化酶酶解处理制得米糠粕水提液，所述米糠粕水提液进行乳酸菌发酵，对发酵液后熟，然后进行糖酸含量和稳定剂配比调配，制得发酵饮料。其中，微波沸水提取，淀粉酶和糖化酶酶解处理的方法如前面所描述的。
进一步地，为了获得适宜口感并且稳定性良好的发酵饮料，优选，后熟时间为36～60小时。优选，用白砂糖和柠檬酸对发酵液进行糖酸调配，更优选地，白砂糖的加入量为8～10％(W/V)，柠檬酸加入量为0.01～0.03％(W/V)。所述稳定剂优选为黄原胶和羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，更优选地，所述黄原胶的加入量为0.03～0.05％(W/V)，所述羧甲基纤维素钠的加入量为0.03～0.05％(W/V)。
本发明的有益效果如下：
利用生物安全的乳酸菌发酵米糠粕水提液，发酵后米糠多糖抗氧化活性与发酵前相比有明显提高，多糖性质得到改善，同时通过简单调配利用该发酵液制备口感良好风味独特的发酵饮料，操作方法简便可行，对于提高米糠利用率、挖掘米糠多糖的应用价值具有重要意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为植物乳杆菌LP-Z01和干酪乳杆菌LC-G01发酵处理米糠粕水提液前后米糠多糖对OH自由基清除率的变化。
图2为植物乳杆菌LP-Z01和干酪乳杆菌LC-G01在MRS培养基中发酵处理前后多糖对OH自由基清除率的变化。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1 抗氧化性提高的米糠多糖的制备
1.米糠粕水提液的制备，具体步骤如下：
取20g米糠粕，加入200mL蒸馏水混匀，在微波频率400W下辐射2分钟，然后100℃下煮沸提取20分钟，冷却至60℃。加入0.1g淀粉酶(3000U/mg)和0.04mL糖化酶(100000U/mL)处理4小时，于100℃煮沸10分钟灭活，4000转/分离心20分钟取上清，115℃灭菌30分钟备用。
2.植物乳杆菌和干酪乳杆菌分别发酵处理米糠粕水提液，步骤如下：
所使用的植物乳杆菌和干酪乳杆菌来源于购买的商业菌株，植物乳杆菌菌株编号为LP-Z01，干酪乳杆菌菌株编号为LC-G01。将植物乳杆菌LP-Z01和干酪乳杆菌LC-G01接种至新鲜固体MRS培养基活化12小时，活化温度为37℃，摇床转速为200转/分。将培养后的种子培养液按照体积百分比3％的接种量接种于120mL步骤1制备的米糠粕水提液中，培养72小时，培养温度为37℃，摇床转速为120转/分，植物乳杆菌LP-Z01和干酪乳杆菌LC-G01在上述培养基中生长状态良好。
3.植物乳杆菌和干酪乳杆菌发酵处理前后米糠粕水提液中多糖的提取和定量
各取100mL上述两种乳杆菌发酵处理后的米糠粕水提液和未经发酵处理的米糠粕水提液，加入400mL无水乙醇，4℃沉淀24小时，4000转/分钟离心20分钟收集沉淀，冷冻干燥，所得固体即为多糖。利用苯酚硫酸法(NY-T1676-2008,食用菌中粗多糖含量的测定[S].北京:中国农业出版社出版,2008)检测多糖含量，结果如表1所示。结果显示两种乳酸菌发酵处理后米糠粕水提液中的多糖含量与未经发酵处理相比有所下降，可能是因为乳酸菌生长过程中代谢产生的胞外酶对米糠粕水提液中的多糖进行了水解。
表1.微生物发酵处理前后米糠多糖含量
4.植物乳杆菌LP-Z01和干酪乳杆菌LC-G01处理后和未经发酵处理的米糠粕水提液中多糖的抗氧化性分析，具体步骤如下：
取步骤3中制备的多糖，配成浓度梯度为0.05、0.1、0.25、0.5和1.0mg/mL的待检测溶液，取1mL待检测溶液、1mL浓度为6mM的FeSO4溶液和1mL浓度为6mM的H2O2溶液混匀静置10分钟，然后加入1mL浓度为6mM的水杨酸溶液，摇匀静置30分钟后于510nm处测定吸光值，计算·OH自由基清除率和EC50。计算公式如下：
清除率＝[1-(样品吸光值/空白吸光值)]×100％；
EC50＝清除率为50％时的多糖或维生素C溶液的浓度，EC50值反映抗氧化能力的大小，EC50值越低，抗氧化能力越强。
从实验结果可以看出(图1)，利用植物乳杆菌LP-Z01和干酪乳杆菌LC-G01对米糠粕水提液进行发酵处理，在实验浓度范围内，两株乳杆菌处理后米糠多糖对·OH自由基的清除率都高于未经发酵处理的米糠多糖，处理72h后的米糠多糖在浓度为1mg/mL时，植物乳杆菌LP-Z01对·OH自由基的EC50值为0.3mg/mL，与处理前的EC50值0.38mg/mL相比清除能力上升了21.05％，干酪乳杆菌LC-G01对·OH自由基的EC50值为0.2mg/mL，与处理前的EC50值0.38mg/mL相比清除能力上升了47％，说明微生物的发酵处理有助于多糖抗氧化性的提高。
实施例2 植物乳杆菌LP-Z01和干酪乳杆菌LC-G01在MRS培养基中的发酵及发酵前后多糖的抗氧化性分析
1.将植物乳杆菌LP-Z01和干酪乳杆菌LC-G01接种至新鲜固体MRS培养基中活化12小时，活化温度为37℃，摇床转速为200转/分。将培养后的种子培养液按照体积百分比2％的接种量接种于120mL MRS液体培养基中，培养72小时，培养温度为37℃，摇床转速为120转/分。
2.各取100mL上述两种乳杆菌处理后的MRS培养基，加入400mL无水乙醇，4℃沉淀24小时，4000转/分钟离心20分钟收集沉淀，冷冻干燥，所得固体即为多糖。
3.取步骤2中制备的多糖，配成浓度梯度为0.05、0.1、0.25、0.5和1.0mg/mL的待检测溶液，取1mL待检测溶液、1mL浓度为6mM的FeSO4溶液和1mL浓度为6mM的H2O2溶液混匀静置10分钟，然后加入1mL浓度为6mM的水杨酸溶液，摇匀静置30分钟后于510nm处测定吸光值，计算·OH自由基清除率和EC50。计算公式如下：
清除率＝[1-(样品吸光值/空白吸光值)]×100％；
EC50＝清除率为50％时的多糖或维生素C溶液的浓度，EC50值反映抗氧化能力的大小，EC50值越低，抗氧化能力越强。
如图2所示，植物乳杆菌LP-Z01和干酪乳杆菌LC-G01发酵处理MRS培养基，处理前后微生物胞外多糖抗氧化性变化较小，并明显低于米糠粕水提液发酵处理后获得的米糠粕多糖的抗氧化性。结合实施例1中处理后米糠粕水提液中的多糖含量与发酵前相比有所下降，说明乳酸菌发酵处理米糠粕水提液提高多糖抗氧化性主要是因为微生物发酵对米糠多糖的改造，并非微生物自身生长代谢或其代谢产物所致。
该液体MRS培养基成分为：酪蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺2g/L，吐温801g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，pH6.8，115℃灭菌30分钟。
实施例3 植物乳杆菌LP-Z01米糠粕发酵液制备发酵饮料
1.米糠粕水提液的制备，具体步骤如下：
取15g米糠粕，加入200mL蒸馏水混匀，在微波频率300W下辐射6分钟，然后100℃下煮沸提取40分钟，冷却至60℃。加入0.1g淀粉酶(3000U/mg)和0.04mL糖化酶(100000U/mL)处理6小时，于100℃煮沸10分钟灭活，4000转/分离心20分钟取上清，115℃灭菌30分钟备用。
2.将活化后的植物乳杆菌LP-Z01种子培养液按照体积百分比3％的接种量接种于100mL上述米糠粕水提液37℃条件下培养72小时后取出冷却，4℃下后熟48小时，然后于3000转/分离心15分钟取上清，即为米糠粕发酵饮料原液。选用白砂糖和柠檬酸对发酵饮料进行糖酸调配，向发酵饮料原液中加入9g白砂糖和0.02g柠檬酸，然后加入0.0375g黄原胶和0.0375g CMC-Na做为稳定剂，最终获得适宜口感并且稳定性良好的发酵饮料。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (9)
1.一种具有提高的抗氧化性的米糠多糖的制备方法，其特征在于，该方法包括以稻米加工副产物米糠粕为原料，通过微波沸水提取，淀粉酶和糖化酶酶解处理制得米糠粕水提液，对所述米糠粕水提液进行乳酸菌发酵，将发酵液进行乙醇沉淀，沉淀冷冻干燥即得；
所述微波沸水提取包括：将米糠粕与水按照料液比g:mL为1:5～1:10混合，在微波频率为300～500W条件下，辐射1～6分钟，然后，100℃条件下煮沸提取20～40分钟；
所述淀粉酶和糖化酶酶解处理包括：向微波沸水提取获得的提取液中加入淀粉酶和糖化酶，酶解反应4～6小时，其中，淀粉酶的加入量为米糠粕重量的0.25～1%（W/W），糖化酶的加入量为米糠粕重量的0.1～0.4%（V/W）；所述淀粉酶活力为2000～4000U/mg，所述糖化酶活力为100000～150000U/mL；
所述乳酸菌包括植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）或其组合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，进行乳酸菌发酵时，乳酸菌的接种量为1～3%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵时间为72～84小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，乙醇用量为发酵液体积的3～5倍。
5.一种含提高的抗氧化性的米糠多糖的发酵饮料的制备方法，其特征在于，该方法包括以稻米加工副产物米糠粕为原料，通过微波沸水提取，淀粉酶和糖化酶酶解处理制得米糠粕水提液，所述米糠粕水提液进行乳酸菌发酵，对发酵液后熟，然后进行糖酸含量和稳定剂配比调配，制得发酵饮料，
其中，所述微波沸水提取包括：将米糠粕与水按照料液比g:mL为1:5～1:10混合，在微波频率为300～500W条件下，辐射1～6分钟，然后，100℃条件下煮沸提取20～40分钟；
所述淀粉酶和糖化酶酶解处理包括：向微波沸水提取获得的提取液中加入淀粉酶和糖化酶，酶解反应4～6小时，其中，淀粉酶的加入量为米糠粕重量的0.25～1%（W/W），糖化酶的加入量为米糠粕重量的0.1～0.4%（V/W）；所述淀粉酶活力为2000～4000U/mg，所述糖化酶活力为100000～150000U/mL；
所述乳酸菌包括植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）或其组合。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于后熟时间为36～60小时。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，用白砂糖和柠檬酸对发酵液进行糖酸含量调配，所述稳定剂为黄原胶和羧甲基纤维素钠。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，白砂糖的加入量为8～10%（W/V），柠檬酸加入量为0.01～0.03%（W/V）。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述黄原胶的加入量为0.03～0.05％（W/V），所述羧甲基纤维素钠的加入量为0.03～0.05％（W/V）。
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