CN107198015A - 双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法 - Google Patents

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Abstract

双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，属于生物工程技术领域。其包括以下步骤：脱脂米糠接双菌发酵；发酵后脱脂米糠提取过滤得到米糠蛋白质、米糠多糖和膳食纤维。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1.双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法下，改变了米糠蛋白和米糠多糖的成分，并提高了提取率。2.发酵后的米糠(包括底物、菌体及其代谢物)尽其用，既保留其活性成分又不会引起废液污染。3.两种菌发酵有利于各菌种协同作用于半干法基质上，往往比单独菌种作用效果更明显，使脱脂米糠活性物品质提高，物尽其用。

Description

双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法。
背景技术
米糠占整粒稻谷的8%，但却集中了稻米中64%的营养素和90%的人体必需元素，以及多种的功能活性物质，如维生素、γ-谷维素、角鲨烯、甾醇以及谷物多酚等，是稻米功效成分最密集的部位。米糠经过脱脂后，除部分脂溶性维生素等功能成分随米糠油被提走外，大部分水溶性多糖、氨基酸及膳食纤维等活性因子仍保留在糠粕内。米糠蛋白中的主要成分是清蛋白、球蛋白、谷蛋白以及醇溶蛋白，这4种蛋白的比例大概 为37：36：22：5。可溶性蛋白约70%，米糠蛋白具有低过敏性，极易吸收，营养价值较为理想。所具有的氨基酸组成接近FAO/WHO推荐模式，是作为婴幼儿断乳食品的理想原料。米糠多糖广泛存在于稻谷颖果皮层中，主要是由以a -1，6糖苷键为主要结构的多糖组成。 其中，水溶性多糖与一般聚糖不同，是一种结构复杂的杂聚糖，由木聚糖、甘露糖、鼠李糖、 半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖等组成。它们都具有显著的生物活性和保健功能，如抗肿瘤、免疫增强和降血糖等。
采用物理化学等方法提取的功能成分比较单一，微生物发酵在提升农产品及其加工副产物附加值中有着广泛的应用。随着发酵工艺的发展，微生物发酵的生产方式已从单一菌种发酵向多菌种协同发酵方向发展，并注重不同微生物之间的协同性和互补性，使其发挥正组合效应。由于多菌种发酵有利于各菌种协同作用于半干法基质上，往往比单独菌种作用效果更明显，使之成为当前研究的热点。酵母菌富含氨基酸、核酸、维生素等多种生理活性物质，其代谢能产生多种酶类，并易于与其他菌种协同发酵。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法的技术方案。
本发明是在多种复合菌配合下的大量筛选实验后，首次公开优选利用酵母菌和枯草芽孢杆菌双菌半干法发酵脱脂米糠，发酵后用于活性成分米糠蛋白与米糠多糖的提取，脱脂米糠经过双菌半干法发酵处理后，提高米糠蛋白与米糠水溶性多糖的产量，对其组成有改变。以往的微生物发酵，大多是2-3种菌对混合底料进行发酵，并且直接用为饲料，对利用酵母菌和枯草芽孢杆菌双菌半干法发酵脱脂米糠没见报道，由于单独基质如脱脂米糠的蛋白与多糖与其他的天然基质组成就不同，再用经过筛选的不同组合的菌发酵，获得蛋白与多糖的组成也不同，特别是我们还将他们分离出来，有利于食品、营养品和医药等的精致应用。步骤如下：
所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）取粉碎后的脱脂米糠加入水，使其含水量达到30%-50%，再将该脱脂米糠灭菌后进行发酵，发酵方式以0.2-2%的接种量按酵母菌和枯草芽孢杆菌质量比=1:1双菌接菌，28-40℃发酵3-6d；
2）取步骤1）得到的发酵后脱脂米糠与水按重量比1:10混合，调pH=11，超声提取10分钟，过滤，得到滤液1和滤渣1；滤液1调pH=4.5，过滤，得到滤渣2和滤液2，滤渣2冷冻干燥即为米糠蛋白质，滤渣1和滤液2备用；
3）将步骤2）得到的滤渣1，按液料的重量比1：10加水，pH值中性条件下超声萃取20分钟，过滤，得到滤液3和滤渣3，滤液2与滤液3合并浓缩至一半，用60%乙醇沉淀，获米糠多糖；
4）步骤3）得到的滤渣3经水洗涤、烘干，得到膳食纤维；
5）对双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的进行分析。
所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤1）中含水量为35-45%。
所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤1）中接种量为0.5-1.5%。
所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤1）中发酵温度30-35℃，发酵时间4-6d。
所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤1）中酵母菌为啤酒酵母菌，菌总数180亿/克，枯草芽孢杆菌菌总数200亿/克。
所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤2）中超声提取条件为超声功率50W、频率80KHZ。
所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤3）中超声萃取条件条件为超声功率50W、频率80KHZ。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法下，改变了米糠蛋白和米糠多糖的成分，并提高了提取率。2.发酵后的米糠(包括底物、菌体及其代谢物)尽其用，既保留其活性成分又不会引起废液污染。3. 两种菌发酵有利于各菌种协同作用于半干法基质上，往往比单独菌种作用效果更明显，使脱脂米糠活性物品质提高，物尽其用。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1
粉碎后的脱脂米糠50g加入适当的水，含水量以捏成团不能从指缝渗出水为宜，含水量为40%，放入250mL三角瓶中，塞上棉塞，12l℃灭菌15min。发酵方式以1%的接种量按酵母菌和枯草芽孢杆菌质量比=1:1双菌接菌，其中酵母菌为啤酒酵母菌，菌总数180亿/克，枯草芽孢杆菌菌总数200亿/克，35℃发酵5d。发酵后脱脂米糠不处理，直接与水按重量比1:10混合，调pH=11，超声提取（超声功率50W、频率80KHZ）10分钟，40℃，过滤，得到滤液1和滤渣1，滤液1调PH=4.5，有沉淀，过滤，得到滤渣2和滤液2，滤渣2冷冻干燥即为米糠蛋白质，获5g；米糠蛋白提取后的滤渣1和沉淀蛋白中和后滤液2备用。将米糠蛋白提取后的滤渣1，按液料的重量比1：10加水调，PH中性条件下超声萃取（超声功率50W、频率80KHZ）20分钟，过滤，得到滤液3和滤渣3，将滤液3和滤渣3分离，滤液2与滤液3合并浓缩一半，用60%乙醇沉淀，获米糠多糖4g；米糠多糖提取后的滤渣3经水洗涤、烘干后可作为膳食纤维38g。对双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的进行分析。
实施例2
粉碎后的脱脂米糠50g加入适当的水，含水量以捏成团不能从指缝渗出水为宜，含水量为40%，放入250mL三角瓶中，塞上棉塞，12l℃灭菌15min。发酵方式以1.5%的接种量按酵母菌和枯草芽孢杆菌质量比=1:1双菌接菌，其中酵母菌为啤酒酵母菌，菌总数180亿/克，枯草芽孢杆菌菌总数200亿/克,35℃发酵6d。发酵后脱脂米糠不处理，直接与水按重量比1:10混合，调pH=11，超声提取（超声功率50W、频率80KHZ）10分钟，40℃，过滤，得到滤液1和滤渣1，滤液1调Ph=4.5，有沉淀，过滤，得到滤渣2和滤液2，滤渣2冷冻干燥即为米糠蛋白质，获5.1g；米糠蛋白提取后的滤渣1和沉淀蛋白中和后滤液2备用。将米糠蛋白提取后的滤渣1，按液料的重量比1：10加水调，中性条件下超声萃取（超声功率50W、频率80KHZ）20分钟，过滤，得到滤液3和滤渣3，将滤液3和滤渣3分离，滤液2与滤液3合并浓缩一半，用60%乙醇沉淀，获米糠多糖3.8g；米糠多糖提取后的滤渣3经水洗涤、烘干后可作为膳食纤维37g。对双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的进行分析。
实施例3
对比实验1：不用双菌半干法发酵脱脂米糠，利用脱脂米糠直接提取蛋白质和多糖。对比实验2：双菌（2 : 1）半干法发酵脱脂米糠，然后提取发酵脱脂米糠蛋白质和多糖。对比实验3：双菌（1 : 2）半干法发酵脱脂米糠，然后提取发酵脱脂米糠蛋白质和多糖。
对比实验1：利用脱脂米糠直接提取蛋白质和多糖。脱脂米糠直接与水1:10（重量比）混合，调Ph=11，超声提取10分钟，40度，过滤，滤液1调Ph=4.5，有沉淀，过滤，滤渣冷冻干燥即为米糠蛋白质，获4g；米糠蛋白提取后的滤渣2和沉淀蛋白中和后滤液2备用。将米糠蛋白提取后的滤渣2，按液料的重量比1：10加水调，中性条件下超声萃取20分钟，过滤，滤液3和滤渣3分离，滤液2与滤液3合并浓缩一半，用60%乙醇沉淀，获米糠多糖3g；米糠多糖提取后的滤渣3经水洗涤、烘干后可作为膳食纤维39g。对脱脂米糠获得活性物的进行分析。
对比实验2：实验步骤参照实例1，双菌（1 : 1）半干法发酵脱脂米糠改为双菌（2 :1）半干法发酵脱脂米糠。双菌（2 : 1）指酵母菌：枯草芽孢杆菌质量比=2 : 1。
对比实验3：实验步骤参照实例1，双菌（1 : 1）半干法发酵脱脂米糠改为双菌（1 : 2）半干法发酵脱脂米糠。双菌（1 : 2）指酵母菌：枯草芽孢杆菌质量比=1 : 2。
表1：实例1与对比实验1～3获得米糠多糖的分析
从表1可见，利用我们优化的条件（实例1），获得的米糠多糖收率最多。在不用双菌发酵直接提取米糠多糖（对比实验1），及其他比例的双菌发酵提取米糠多糖（对比实验2，对比实验3），米糠多糖收率的收率都没有实例1的高。如果双菌发酵比例不妥，如对比实验3还不如对比实验1的收率也不是很理想。表中还原糖含量增加，是双菌发酵的结果；说明双菌对大分子多糖有酶解作用。
表2：实例1与对比实验1～3获得米糠蛋白质的分子量测定
由表2可见，双菌发酵提取的米糠蛋白质，由四大组分组成，但与不用双菌发酵直接提取米糠蛋白质（对比实验1）相比，每一组分的分子量相对都略变低。这是由于双菌发酵会产生许多其他酶，对细胞壁有酶解作用，不但提高了米糠蛋白的溶出效率，还使一些蛋白片段发生酶解。米糠蛋白质分子量变低，有利于米糠蛋白的利用吸收。
实施例4
实验1：提取米糠还原糖的测定
(1)样品的处理：准确称取5g发酵米糠提产物,于250mL容量瓶中(用100mL水分数次洗入容量瓶中)。慢慢加入5mL 21.9%的醋酸锌溶液及10.6%的亚铁氰化钾溶液5mL，振摇lmin,加水至刻度,摇匀。放置30min,干过滤,弃去初滤液,与滤液中加入少量的草酸钾固体，若有沉淀则过滤,滤液共测定用。(2)样品的预测、精确预测及滴定。
实验2：提取米糠总糖的测定
（1）样品的处理：同直接滴定测还原糖。(2)吸取处理后的样液50mL，放入100mL容量瓶中。加入5mL(1+l)盐酸溶液,置68-70℃水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,加两滴甲基红指示剂,用30%NaOH溶液中和至中性,加水至刻度,混匀。然后直接滴定。
采用激光光散射法对米糠多糖样品进行分子量分析，结果见表1。
实验3：
提取米糠蛋白质的分子量测定
实验方法：高效液相色谱分析：Agilent 1100 高效液相色谱仪及数据处理平台, 美国Agilent 公司产品, 包括自动进样器、光电二极管阵列检测器 ( DAD) 、柱温 箱、进 样瓶、涡漩振 荡器、针管过 滤器、0. 45μm尼龙滤膜; HPLC 色 谱柱: TSKgel G2000SW xl( 7. 8 mm × 300 mm)；流动相：乙腈：水：三氟乙酸，12：88：0.1（体积比）；检测波长：UV220nm；流速：1.0 mL/min；柱温：26℃；进样体积：10 μL。
（1）分子量校正曲线的确定
分别将标准的磷酸化酶B蛋白（97kDa）、牛血清蛋白（66.2kDa）和兔肌动蛋白（43kDa）用流动相配制成质量分数为0.1%的不同分子量蛋白标准品溶液，用孔径为0.45μm尼龙滤膜过滤后，分别取10μL上机进样，流动相：乙腈：水：三氟乙酸，12：88：0.1（体积比），流速为1.0mL/min，柱温 26 ℃，吸收波长为 243 nm 条件下，进行检测。
（2）目标产物分子量范围的确定
称取样品约 20.0mg于 10mL 容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡10min，使样品充分溶解混匀，用0. 45μm尼龙滤膜过滤后，上机进样。
实验结果：根据保留时间（min），米糠蛋白质有4大组分组成。根据分子量标准曲线判断出四种米糠分级蛋白分子量分布，分离组分经高效液相色谱法测定后，通过分子量分子量标准曲线确定出米糠蛋白组分的分子量范围见表2。
以上列举的仅是本发明的一些具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
项目资助：国家自然科学基金30870553；国家国际科技合作项目2010DFA34370；浙江省国际科技合作专项2013C14012。

Claims (7)

1.双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）取粉碎后的脱脂米糠加入水，使其含水量达到30%-50%，再将该脱脂米糠灭菌后进行发酵，发酵方式以0.2-2%的接种量按酵母菌和枯草芽孢杆菌质量比=1:1双菌接菌，28-40℃发酵3-6d；
2）取步骤1）得到的发酵后脱脂米糠与水按重量比1:10混合，调pH=11，超声提取10分钟，过滤，得到滤液1和滤渣1；滤液1调pH=4.5，过滤，得到滤渣2和滤液2，滤渣2冷冻干燥即为米糠蛋白质，滤渣1和滤液2备用；
3）将步骤2）得到的滤渣1，按液料的重量比1：10加水，pH值中性条件下超声萃取20分钟，过滤，得到滤液3和滤渣3，滤液2与滤液3合并浓缩至一半，用60%乙醇沉淀，获米糠多糖；
4）步骤3）得到的滤渣3经水洗涤、烘干，得到膳食纤维；
5）对双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的进行分析。
2.如权利要求1所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤1）中含水量为35-45%。
3.如权利要求1所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤1）中接种量为0.5-1.5%。
4.如权利要求1所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤1）中发酵温度30-35℃，发酵时间4-6d。
5.如权利要求1所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤1）中酵母菌为啤酒酵母菌，菌总数180亿/克，枯草芽孢杆菌菌总数200亿/克。
6.如权利要求1所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤2）中超声提取条件为超声功率50W、频率80KHZ。
7.如权利要求1所述的双菌半干法发酵脱脂米糠获得活性物的方法，其特征在于所述步骤3）中超声萃取条件条件为超声功率50W、频率80KHZ。
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