CN107586821A - 一种肉苁蓉多肽的提取方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肉苁蓉多肽的提取方法及用途，由以下步骤组成：将肉苁蓉粉碎，加入溶剂提取，滤过后将滤渣烘干，烘干的滤渣用水提取2次，滤过后合并滤液，调节pH值至6.5~7.5，然后加入复合蛋白酶酶解2~4小时，将酶解液于90℃灭活后，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液浓缩至浸膏，向浸膏中加入95%乙醇沉淀多糖，过滤后将滤液浓缩，烘干，得到肉苁蓉多肽提取物。本发明提供的制备方法具有使用溶剂简单、可回收利用，生产成本低、操作简便等特点，适合肉苁蓉多肽的工业化生产。所得肉苁蓉多肽提取物可用于制备保健食品，具有补充体力、消除疲劳的功效。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和植物提取领域，具体的涉及一种肉苁蓉多肽的提取方法，以及该肉苁蓉多肽在保健品方面的用途。
背景技术
肉苁蓉(Herba Cistanches)为列当科肉苁蓉属植物，为补肾壮阳、润肠通便之要药。始载于《神农本草经》，被列为上品，具有“沙漠人参”之称。目前已分离鉴定的肉苁蓉化学成分主要有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、木质素类、氨基酸、糖类等。现代药理研究证明肉苁蓉还具有抗疲劳、抗衰老、增强机体免疫力等作用，且没有发现不良反应。近年来，以肉苁蓉为原料的保健品大有兴起之势，肉苁蓉在营养保健方面具有很大的开发利用价值。
研究发现植物蛋白质的酶解产物中存在一些具有较高生物活性的短肽，如抗氧化肽、免疫促进肽等，这些生物活性肽的研究为蛋白质资源的利用提供了新的机遇，也为新功能性食品的开发提供了新的途径，是当前食品科学领域引人注目的研究方向之一。
中国专利CN104263790A公开了“一种肉苁蓉多肽提取物、制备方法及其用途”，该发明主要利用肉苁蓉渣，经烘干粉碎，再经过碱溶酸沉法处理，酶解，超滤纯化，最终得到分子量为500~10000Da的肉苁蓉多肽。但是该专利在提取多肽时，使用碱性溶液在pH值为9的环境下浸提，易导致蛋白质失活，造成肉苁蓉多肽的损失，没有明确提到肉苁蓉多肽的得率。
肉苁蓉中含有丰富的可溶性蛋白，本专利利用现代中药提取技术，将肉苁蓉蛋白质酶解制备生物活性肽并进行功效性应用开发。本工艺操作简便，时间短，适合于工业生产。得到的肉苁蓉多肽分子量小，纯度高，利于人体吸收，具有补充体力、消除疲劳等功效。本发明可以提高肉苁蓉的利用价值，增加其产品的附加值，产生巨大的经济效益，对于进一步拓宽肉苁蓉的应用领域具有重要意义。
发明内容
发明目的：提供一种新的肉苁蓉多肽的制备方法，该方法能有效地将肉苁蓉蛋白酶解成具有一定生物活性且更利于人体吸收的小分子多肽，提高其保健价值，实现肉苁蓉的高值化利用。
技术方案：一种肉苁蓉多肽的提取方法，包括以下步骤：
（1）取肉苁蓉，将其粉碎，用一定量的溶剂在适宜温度下提取1h，过滤，将滤渣烘干；
（2）向滤渣中加入一定量的水，在一定温度下提取2次，每次1h，滤过合并滤液；
（3）用一定浓度的碱溶液调节步骤（3）得到的滤液的pH值；
（4）向滤液中加入一定量的复合蛋白酶，在适宜温度下恒温搅拌酶解，得到酶解液；
（5）将酶解液置于90℃水浴灭活10min，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏；
（6）向浸膏中加入9倍重量的95%乙醇，静置沉淀，除去多糖沉淀；
（7）将滤液浓缩，烘干，得到肉苁蓉多肽提取物。
上述步骤（1）中，溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚中的任意一种，优选乙醇；溶剂与肉苁蓉的重量比为（4~8）:1；提取温度为40~90℃。本步骤的目的在于除去非极性杂质，减少后续纯化过程中的干扰杂质，提取所用的溶剂可回收再利用，减少成本，减少环境污染。
上述步骤（2）中，水与肉苁蓉的重量比为（8~12）:1；提取温度为85~95℃。
上述步骤（3）中，碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或者氨水的水溶液中的任意一种；碱溶液浓度为0.1~2mol/L；调节pH值至6.5~7.5。
上述步骤（4）中，复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和中性蛋白酶两种酶的混合物，两种蛋白酶质量比为1:0.5~3，优选为 1:1~2，最优选 1:1.5。蛋白酶包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等，本发明选择菠萝蛋白酶和中性蛋白酶两种酶的混合物并确定1:0.5~3的比例，主要是通过对水解过程的水解度的测定，发现与其他酶相比，用量接近的情况下，1:0.5~3比例的菠萝蛋白酶和中性蛋白酶的水解度最佳，且用量、成本优于其他酶。
上述步骤（4）中，复合蛋白酶用量为肉苁蓉重量的0.5%~2.0%。虽然随着蛋白酶用量的增加，水解度也渐渐增加，但用量超过2.0%时，水解度增加很少，因此，复合蛋白酶用量为肉苁蓉的0.5%~2.0%。
上述步骤（4）中，酶解温度为35~60℃，酶解时间为2~4h。
上述步骤（5）中，采用的纳滤膜浓缩，是以压力为推动力的膜分离技术之一。通过膜表面的微孔筛选可截留分子量为10000Da分子量的多肽，过滤去除小分子其他成分，从而实现多肽成分的浓缩和纯化效果，且具有无需加热，能耗低及操作压力低等优点。
有益效果：本发明先用溶剂提取，有效除去肉苁蓉中会抑制酶活性的因子和各种小分子杂质，再使用两种蛋白酶共同酶解，使蛋白质酶解更加充分，酶解完成后，水提醇沉除去提取液中的多糖，提高了多肽的得率。本工艺操作简便，时间短，适合工业生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
（1）取1kg肉苁蓉，将其粉碎；
（2）用4kg乙醇于70℃提取1h，过滤，将滤渣烘干；
（3）向滤渣中加入8kg水，于90℃提取2次，每次1h，滤过合并滤液；
（4）用1mol/L NaOH溶液调节步骤（3）得到的滤液的pH值至6.5；
（5）加入4g菠萝蛋白酶和2gAS1398中性蛋白酶，于35℃恒温搅拌酶解4h，得到酶解液；
（6）将步骤（5）得到的酶解液于90℃水浴10min使酶灭活，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏；
（7）向步骤（6）得到的浸膏中加入9倍重量的95%乙醇，静置沉淀，除去多糖沉淀；
（8）将滤液在70℃，0.02Mpa的条件下浓缩至干，得到肉苁蓉多肽提取物，得率为1.254%。
多肽含量测定
多肽含量测定采用分光光度法，使用紫外分光光度计，分析方法是首先绘制对照品的吸收标准曲线，将待测的样品稀释至一定浓度，测定其吸光度，利用标准曲线计算得到多肽的含量。
标准曲线制备：精密称取酪氨酸对照品适量，制成浓度为5mg/ml的对照品贮备液。取上述对照品贮备液分别置于5个10ml的量瓶中，加5%TCA制成浓度分别为0.0mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml的酪氨酸标准溶液。然后分别取6.0ml标准溶液，加入4.0ml 双缩脲试剂（1%硫酸铜溶液+10%NaOH溶液），于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min 离心10min，取上清液于238nm 下测定OD值（以第一管做空白对照）。以多肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD 值为纵坐标Y，制作标准曲线。得回归方程为Y＝0.0297X+0.0257，R2＝0.9996。
多肽含量的测定：按照以上方法测定待测溶液中多肽吸光度 A，由回归方程即可求得质量浓度。取待测肉苁蓉多肽提取物，制成浓度为0.2mg/ml 溶液。取样品溶液1mL，按照上述的制作方法，测定其吸光度，每个样品做三个平行试验，取平均值，计算得到样品中的多肽含量为62.13%。
实施例2：
（1）取1kg肉苁蓉，将其粉碎；
（2）用5kg乙酸乙酯于50℃提取1h，过滤，将滤渣烘干；
（3）向滤渣中加入10kg水，于90℃提取2次，每次1h，滤过合并滤液；
（4）用1mol/L NaOH溶液调节步骤（3）得到的滤液的pH值至7.5；
（5）加入6g菠萝蛋白酶和6gAS1398中性蛋白酶，于60℃恒温搅拌酶解2h，得到酶解液；
（6）将步骤（5）得到的酶解液于90℃水浴10min使酶灭活，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏；
（7）向步骤（6）得到的浸膏中加入9倍重量的95%乙醇，静置沉淀，除去多糖沉淀；
（8）将滤液在70℃，0.02Mpa的条件下浓缩至干，得到肉苁蓉多肽提取物，得率为1.744%。
多肽含量测定方法同实施例1，样品中的多肽含量为69.32%。
实施例3：
（1）取1kg肉苁蓉，将其粉碎；
（2）用6kg甲醇于60℃提取1h，过滤，将滤渣烘干；
（3）向滤渣中加入10kg水，于90℃提取2次，每次1h，滤过合并滤液；
（4）用1mol/L KOH溶液调节步骤（3）得到的滤液的pH值至7.2；
（5）加入5g菠萝蛋白酶和1gAS1398中性蛋白酶，于45℃恒温搅拌酶解3h，得到酶解液；
（6）将步骤（5）得到的酶解液于90℃水浴10min使酶灭活，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏；
（7）向步骤（6）得到的浸膏中加入9倍重量的95%乙醇，静置沉淀，除去多糖沉淀；
（8）将滤液在70℃，0.02Mpa的条件下浓缩至干，得到肉苁蓉多肽提取物，得率为2.302%。
多肽含量测定方法同实施例1，样品中的多肽含量为79.08%。
实施例4：
（1）取1kg肉苁蓉，将其粉碎；
（2）用8kg石油醚于40℃提取1h，过滤，将滤渣烘干；
（3）向滤渣中加入12kg水，于90℃提取2次，每次1h，滤过合并滤液；
（4）用1mol/L NaOH溶液调节步骤（3）得到的滤液的pH值至7.2；
（5）加入2g菠萝蛋白酶和3gAS1398中性蛋白酶，于45℃恒温搅拌酶解3h，得到酶解液；
（6）将步骤（5）得到的酶解液于90℃水浴10min使酶灭活，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏；
（7）向步骤（6）得到的浸膏中加入9倍重量的95%乙醇，静置沉淀，除去多糖沉淀；
（8）将滤液在70℃，0.02Mpa的条件下浓缩至干，得到肉苁蓉多肽提取物，得率为2.317%。
多肽含量测定方法同实施例1，样品中的多肽含量为79.38%。
实施例5：
（1）取1kg肉苁蓉，将其粉碎；
（2）用5kg乙醇于80℃提取1h，过滤，将滤渣烘干；
（3）向滤渣中加入10kg水，于90℃提取2次，每次1h，滤过合并滤液；
（4）用1mol/L NaOH溶液调节步骤（3）得到的滤液的pH值至7.2；
（5）加入5g菠萝蛋白酶和5gAS1398中性蛋白酶，于55℃恒温搅拌酶解3h，得到酶解液；
（6）将步骤（5）得到的酶解液于90℃水浴10min使酶灭活，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏；
（7）向步骤（6）得到的浸膏中加入9倍重量的95%乙醇，静置沉淀，除去多糖沉淀；
（8）将滤液在70℃，0.02Mpa的条件下浓缩至干，得到肉苁蓉多肽提取物，得率为1.825%。
多肽含量测定方法同实施例1，样品中的多肽含量为76.53%。
实施例6：
应用实施例1~5进行小鼠的抗疲劳试验
每天用10mg/kg剂量的按照上述实施例1至实施例5制备得到的肉苁蓉多肽对小鼠进行30天的喂养，一个月之后，按照《保健食品功能评价程序与检验方法》中“缓解体力疲劳检测方法”中的负重游泳试验测试，本发明的试验结果见下表。
表1 实施例1~5多肽小鼠抗疲劳数据
表1 实施例1~5多肽小鼠抗疲劳数据
| 试验组 | 游泳时间（min） |
| 实施例1 | 19.8 |
| 实施例2 | 21.0 |
| 实施例3 | 18.2 |
| 实施例4 | 20.2 |
| 实施例5 | 18.9 |
| 空白例 | 11.2 |
由表1可见，实施例1~5的小鼠负重游泳时间较空白组显著延长，说明本发明制备的肉苁蓉多肽提取物能够有效抵抗疲劳。
应当指出，以上具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
Claims (7)
1.一种肉苁蓉多肽的制备方法及用途，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取肉苁蓉，将其粉碎，用一定量的溶剂在适宜温度下提取1h，过滤，将滤渣烘干；
（2）向滤渣中加入一定量的水，在一定温度下提取2次，每次1h，滤过合并滤液；
（3）用一定浓度的碱溶液调节步骤（3）得到的滤液的pH值；
（4）向滤液中加入一定量的复合蛋白酶，在适宜温度下恒温搅拌酶解，得到酶解液；
（5）将酶解液置于90℃水浴灭活10min，用截留分子量为10000Da的纳滤膜过滤，滤液减压浓缩至浸膏；
（6）向浸膏中加入9倍重量的95%乙醇，静置沉淀，除去多糖沉淀；
（7）将滤液浓缩，烘干，得到肉苁蓉多肽提取物。
2.根据权利要求1所述一种肉苁蓉多肽的制备方法及用途，其特征在于：步骤（1）中所述溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚中的一种；所述溶剂与肉苁蓉的重量比为（4~8）:1；所述提取温度为40~90℃。
3.根据权利要求1所述一种肉苁蓉多肽的制备方法及用途，其特征在于：步骤（2）中所述水与肉苁蓉的重量比为（8~12）:1；所述提取温度为85~95℃。
4.根据权利要求1所述一种肉苁蓉多肽的制备方法及用途，其特征在于：步骤（3）中所述碱溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或者氨水的水溶液中的一种；所述碱溶液浓度为0.1~2mol/L；所述调节pH值至6.5~7.5。
5.根据权利要求1所述一种肉苁蓉多肽的制备方法及用途，其特征在于：步骤（4）中所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和中性蛋白酶两种酶的混合物；所述复合蛋白酶用量为肉苁蓉重量的0.5%~2.0%；所述酶解温度为35~60℃；所述酶解时间为2~4h。
6.根据权利要求5所述的一种肉苁蓉多肽的制备方法及用途，其特征在于：菠萝蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为1:0.5~3，优选为1:1~2，最优选 1:1.5。
7.根据权利要求1所述一种肉苁蓉多肽的制备方法及用途，其特征在于：步骤（7）中所述肉苁蓉多肽提取物可用于制备保健品，具有迅速补充体力、消除疲劳的功效。
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