CN101812496A

CN101812496A - 一种高纯度鱼鳞胶原蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN101812496A
Application number: CN 201010192216
Authority: CN
Inventors: 郭养浩; 郑允权; 石贤爱; 王阿万
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2010-06-07
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2030-06-07
Also published as: CN101812496B

Abstract

本发明提供了一种制备高纯度鱼鳞胶原蛋白的新工艺。本发明以鱼鳞为原料，经碱酸浸泡和胶体磨粉碎后，加入蛋白酶进行酶解。采用离子交换层析柱分离-膜分离组合技术，对提取出来的胶原蛋白进行分离纯化，得到纯度大于95%，分子量分布为1000-5000Da，或100,000-300,000Da的胶原蛋白产品，可用于保健品、化妆品及生物医学工程材料的制备。采用本项新工艺，废水产生量仅为传统工艺的50%。

Description

一种高纯度鱼鳞胶原蛋白的制备方法

技术领域

本发明属生化制品技术领域，具体涉及一种高纯度鱼鳞胶原蛋白的生产方法。

背景技术

胶原蛋白(Collagen)又称胶原，主要分布在人体的结缔组织中，作为皮肤、骨骼、肌腱、韧带、血管的构成材料。目前市场上生产的胶原蛋白制品原料大部分来源于猪、牛等陆生哺乳动物皮中提取，近年随着全球生态环境恶化导致疯牛病、口蹄疫等许多流行病的发生，使得从陆生哺乳动物体内提取胶原蛋白潜在危险性的增大。鱼胶原蛋白是近年来新兴的一类胶原蛋白，欧美、日本等国家相继出台一些限制从牛等哺乳动物提取胶原蛋白用于食品、医药和对人体有直接影响的产品中。而鱼胶原蛋白的主要原料则来自鱼鱼类，不存在这些潜在的威胁，具有极高的生物安全性。来源于鱼类胶原蛋白在许多方面明显优于哺乳动物来源得的胶原蛋白，比如低抗原性、低过敏性、分子结构较脆弱导致酶解较容易等，使得鱼胶原蛋白的应用范围逐渐扩大，大有取代哺育动物来源胶原蛋白的趋势。

目前国内外一般采用酸碱处理和酶解的方法制备鱼鳞胶原蛋白，需要使用大量的碱液或酸液进行多次的浸泡、去除杂质和清洗。由于传统工艺仅仅依靠酸碱浸泡的方式去除杂质，因此最终产品纯度不高，产品质量不稳定。传统工艺需要重复多次的碱泡和酸泡操作步骤，废水排放量大，约为固形物体积的50－60倍，造成严重的二次污染。发展低污染的、制备高纯度胶原蛋白的新型技术是十分必要的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高纯度鱼鳞胶原蛋白的制备工艺。

本发明以鱼鳞为原料，经酸碱浸泡、粉碎得到鱼鳞浆，然后进行酶水解，提取胶原蛋白；采用离子交换层析柱纯化-膜分离的组合技术，对所提取的胶原蛋白进行纯化，得到鱼鳞胶原蛋白。所述鱼鳞胶原蛋白分子量分布为1000-5000Da或100,000-300,000Da，纯度大于95%。本发明制备的鱼鳞胶原蛋白产品可用于制备保健品、化妆品及生物医学工程材料。

本发明通过使用酸碱浸泡－胶体磨粉碎的方法，获得鱼鳞浆液，再用蛋白酶处理鱼鳞浆，大幅度地提高了胶原蛋白的提取率，减少了碱液和酸液的用量，同时减少了浸泡时间。

本发明采用离子交换层析柱分离纯化技术，通过动态吸附和动态洗脱的优化操作，可大幅度提高胶原蛋白与杂蛋白以及其他杂质的分离效果，最终产品胶原蛋白的纯度高达95％。柱分离操作是工业化的单元操作过程，过程可控，可保证最终产品的高纯度。由于柱分离操作提供了高效的去除杂蛋白和金属离子的分离效果，可节省传统工艺中重复酸碱浸泡和清洗的步骤，可减少50％的废水产生量。

本发明的制备工艺与其他已经公开的发明专利（200310114500.X，200510044916.8，200510132208.X，200910194045.6，200810158087.X）相比，具有以下特点：

1.鱼鳞经碱酸浸泡-胶体磨粉碎后，得到鱼鳞浆液，再进行蛋白酶水解，可有效提高胶原蛋白提取率。此步骤中，碱泡和酸泡用液量显著减少，处理时间缩短。

2.采用离子交换层析柱分离纯化技术，有效去除杂蛋白与其他金属离子杂质，得到纯度高于95%的胶原蛋白，过程可控，最终产品质量可靠。

3.由于采用高效的分离纯化技术，避免了传统工艺中去除杂质所需的重复性的碱泡和酸泡以及清洗操作步骤，可减少50％的废水产生量。本专利提供了一种制备高纯度鱼鳞胶原蛋白的清洁生产技术。

附图说明

附图为高纯度鱼鳞蛋白的制备工艺流程示意图。

具体实施方式

以鱼鳞为原料，采用NaOH溶液（固液比1：6）浸泡洗净的鱼鳞2-4h，再采用醋酸或柠檬酸溶液（固液比1：8）浸泡鱼鳞6-12h，过滤取鱼鳞部分；采用胶体磨粉碎鱼鳞，得到鱼鳞浆。采用胃蛋白酶或其他蛋白酶水解鱼鳞浆，提取胶原蛋白；所述其他蛋白酶包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和组织蛋白酶等；可采用一步法进行酶水解，也可采用二步法进行酶水解。

所述一步法进行酶水解，酶的添加量占鱼鳞浆重量比为0.2-3.0%，调节pH值至1.5～8.0，反应温度为20～55℃，酶解时间6－24小时；所述二步法进行酶解，第一步酶解采用胃蛋白酶，酶的添加量占鱼鳞浆重量比为0.1-2.0%，调节pH值至1.5～5.0，反应温度为20～55℃，酶解时间3－12小时；第二步酶解采用高效蛋白酶（酸性或中性蛋白酶），酶的添加量占鱼鳞浆重量比为0.01-2.0%，调节pH值至1.5～8.0，反应温度为20～55℃，酶解时间5－12小时。

采用离子交换层析柱纯化-膜分离的组合技术，对所提取的胶原蛋白进行纯化，所述的离子交换层析柱的分离介质为阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，羟磷灰石材料和大孔网格树脂。将提取出来的胶原蛋白液pH值调整到3.0-8.5，使蛋白质分子呈离子状态，采用动态吸附、动态洗脱工艺，以不同pH值（3.0-8.5）和不同浓度（0.01-5.0%重量比）盐溶液为洗脱剂，利用特异性分离介质对胶原蛋白和杂蛋白结合力的差异，实现胶原蛋白的分离纯化；所述的膜分离是采用截留量为1000Da，5000Da，100,000Da和300,000Da的超滤膜组件，进行胶原蛋白的分子量切割，可分别得到1000-5000Da以及100,000-300,000Da的胶原蛋白产品。得到的鱼鳞胶原蛋白分子量分布为1000-5000Da或100,000-300,000Da，纯度大于95%。

以下为本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

取洗净的鱼鳞100公斤，加入600升0.5%NaOH溶液，浸泡4h。沥去碱液，用于下批次鱼鳞碱泡工序。在收集的鱼鳞固形物中，加入800升0.5%醋酸溶液，用胶体磨进行粉碎，磨成鱼鳞胶状物即鱼鳞浆。用10%的醋酸溶液调节pH，使最终pH达到3.5。采用二步酶解工艺。第一步酶解采用胃蛋白酶，酶的添加量为0.8%，调节pH值至3.0，反应温度为40℃，酶解时间8小时；第二步酶解采用高效蛋白酶，酶的添加量为0.7%，调节pH值至4.5，反应温度为40℃，酶解时间12小时。酶解产物经5000rpm,10min离心分离，收集上清液，即胶原蛋白粗提物。

将离心分离的上清液，调节pH至5.0，以1倍床层体积/小时的流速流经阴离子交换树脂柱（10×100cm），上柱液体积为3倍床层体积。采用0.1-2.0%氯化钠溶液进行动态梯度洗脱。收集胶原蛋白组分。采用膜过滤装置处理上述物料，收集的胶原蛋白分子量为1000-5000Da。收集的胶原蛋白纯度高于95%。收率达到85%以上。

实施例2

取洗净的鱼鳞100公斤，加入600升0.5%NaOH溶液，浸泡4h。沥去碱液，用于下批次鱼鳞碱泡工序。在鱼鳞固形物中，加入800升0.5%柠檬酸溶液，浸泡4h后，加入胶体磨，磨成胶状物即鱼鳞浆。用10%的柠檬酸溶液加入鱼鳞浆，充分混匀，调节pH，使最终pH达到3.5。加入1.0%的蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或组织蛋白酶等），35℃，在充分搅拌条件下，酶解6h。酶解产物经过5000rpm,10min离心分离，收集上清液，即胶原蛋白粗提物。

在上述收集的胶原蛋白粗提物中，加入10%的NaOH溶液，pH调节至3.5。以1倍床层体积/小时的流速流经阳离子交换树脂（10×100cm），上柱液体积为3倍胶层体积。采用氯化钠溶液进行动态洗脱，洗脱梯度为pH3.5－5.0、氯化钠浓度0.2－2.0%。采用膜过滤装置处理上述物料，收集胶原蛋白的分子量为100000-300000Da。收集胶原蛋白组分，其纯度高于95%，收率达85%。

Claims

1.一种鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其特征在于：以鱼鳞为原料，经酸碱浸泡、粉碎得到鱼鳞浆，然后进行酶水解，提取胶原蛋白；采用离子交换层析柱纯化-膜分离的组合技术，对所提取的胶原蛋白进行纯化，得到鱼鳞胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述鱼鳞胶原蛋白分子量分布为1000-5000Da或100,000-300,000Da，纯度大于95%。

3.根据权利要求1所述的鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其特征在于：采用NaOH溶液浸泡洗净的鱼鳞2-4h，再采用醋酸或柠檬酸溶液浸泡鱼鳞6-12h，过滤取鱼鳞部分；采用胶体磨粉碎鱼鳞，得到鱼鳞浆。

4.根据权利要求1所述的鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的酶水解采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或组织蛋白酶水解鱼鳞浆；采用一步法进行酶水解，或采用二步法进行酶水解。

5.根据权利要求3所述的鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述一步法进行酶水解，酶的添加量占鱼鳞浆重量比为0.2-3.0%，调节pH值至1.5～8.0，反应温度为20～55℃，酶解时间6－24小时；所述二步法进行酶解，第一步酶解采用胃蛋白酶，酶的添加量占鱼鳞浆重量比0.1-2.0%，调节pH值至1.5～5.0，反应温度为20～55℃，酶解时间3－12小时；第二步酶解采用高效蛋白酶，酶的添加量占鱼鳞浆重量比为0.01-2.0%，调节pH值至1.5～8.0，反应温度为20～55℃，酶解时间5－12小时。

6.根据权利要求1所述的鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的离子交换层析柱的分离介质为阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，羟磷灰石材料或大孔网格树脂；纯化过程是将提取出来的胶原蛋白液pH值调整到3.0-8.5，采用动态吸附、动态洗脱工艺，以不同pH值3.0-8.5和不同浓度为0.01-5.0%盐溶液为洗脱剂，进行胶原蛋白的分离纯化。

7.根据权利要求1所述的鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的膜分离是采用截留量为1000Da，5000Da，100,000Da和300,000Da的超滤膜组件，进行胶原蛋白的分子量切割，可分别得到1000-5000Da以及100,000-300,000Da的胶原蛋白产品。