CN104651434A - 一种骨肽溶液的制备方法 - Google Patents

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沈飞
杨文革
李栋芸
冯旌
李向东
程丽民
朱文俊
殷晶晶
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Abstract

本发明公开了一种骨肽溶液的制备方法，属于生物工程领域，该工艺包括以下步骤：(1)将动物新鲜四肢骨破碎入反应釜减压提取、超声波处理，提取浓缩液，固液分离得滤液；(2)酶解消化：向浓缩液中分别加入蛋白酶进行酶解；(3)将酶解液升温灭酶后进行超滤，收集超滤液，即得骨肽溶液。本发明方法采用减压提取辅助超声波破碎细胞，提高了提取率；运用酶解法生产，提高了降解效率，减少了常规提取方法中酸碱等的大量使用，能更好地保存骨肽中的活性多肽，提高产品的质量。本发明提取的骨肽产品质量好，出品率高，疗效显著，易操作、适合工业化生产。

Description

一种骨肽溶液的制备方法
技术领域
本发明涉及一种骨肽溶液的制备方法，具体利用减压和超声提取、酶解法从哺乳动物四肢骨中提取骨肽，属于生物工程领域。
背景技术
骨肽是一类从动物骨骼中提制、含有钙磷铁等无机元素和氨基酸片断以及多种骨生长因子的多肽混合物，含骨质蛋白肽、骨血蛋白肽和骨胶原蛋白肽以及游离氨基酸等成分。由于合理的钙磷铁比例以及多种骨生长因子的存在，骨肽具有调节骨代谢、刺激成骨细胞增值、促进新骨形成，以及调节钙磷代谢、增加骨钙沉积、防治骨质疏松等功能，并且有良好的镇痛、消炎作用。在临床主要用于治疗风湿、类风湿性关节炎、骨质增生、骨折等病症，疗效确切。
目前，已公开了一些有关骨肽的提取工艺，多数工艺仅采用酸、碱和醇分别沉淀酸性蛋白、碱性蛋白和中性蛋白。这些工艺中由于酸碱醇的大量使用，不可避免的对骨多肽中的活性成分造成伤害，影响产品的疗效。同时存在提取率低、成本高等问题，对规模化生产有一定的限制作用。
公开号为CN 101366729A(发明名称：一种骨肽提取物的制备方法及其产品)的中国专利申请公开了一种骨肽提取物的制备方法，该方法将猪四肢骨经热压提取，去脂肪，分别采用酸沉、碱沉、醇沉去除酸性蛋白、碱性蛋白和中性蛋白，超滤去除杂蛋白等步骤制得四肢骨提取物。该发明通过热压提取，可提高骨肽的得率，但该发明中酸沉、碱沉、醇沉等工艺中稀盐酸、氢氧化钠和乙醇的使用，会破坏骨肽提取物中活性成分结构，造成骨肽活性一定程度的下降。
公开号为CN 1843502A(发明名称：一种预防、治疗骨质疏松症的活性骨肽及其制备方法)的中国专利申请公开了一种骨活性肽的制备方法，该方法取动物四肢骨清洗破碎后用蛋白酶水解，得上清液进行脱脂，浓缩，乙醇提取，滤出上清液。上清液脱醇后离心超滤，收集滤液得活性骨肽。该发明用酶水解骨蛋白来制备活性骨肽，由于工艺中避免了酸碱使用，减少了提取过程对骨肽活性成分的损伤。但酶解法生产骨肽，骨中的有效成分不能最大限度的提取出来，造成骨肽的提取率不高，生产成本上升。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供了一种骨肽溶液的制备方法，减少对骨肽中活性成分的影响，提高产品疗效。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种骨肽溶液的制备方法，其具体步骤如下：
(1)取新鲜的动物四肢骨洗涤后粉碎，加水煮沸、静置脱脂，然后移入高压釜，升温至110-125℃，压力维持在2.7-3.0kg/cm2，保持1.5-2.0小时，然后减压；再用超声波辅助破碎细胞后进行固液分离得滤液；将滤液蒸发浓缩，得浓缩液；
(2)将步骤(1)中所得浓缩液维持在30-40℃，添加酸至pH值2.5-3.0，加入浓缩液重量2.0-3.0％的胃蛋白酶或糜蛋白酶消化6-8小时，得消化液，命名为消化液A；
(3)向步骤(2)所得消化液A中添加碱液至pH值7.5-8.0，加入浓缩液重量0.5-1.5％的胰蛋白酶消化6-8小时，温度维持在30-40℃，得消化液，命名为消化液B；
(4)将步骤(3)所得消化液B升温灭酶处理，然后冷却，静置分层，除去上层悬浮物和底层沉淀，取中间澄清液过滤得提取液；
(5)将步骤(4)所得提取液超滤，收集超滤液，即得骨肽溶液。
优选步骤(1)中所述的动物四肢骨为猪、牛或羊四肢骨中任一种或几种混合物；粉碎后四肢骨头粒径为0.5-1.5cm的骨块。优选步骤(1)中加入的水量为粉碎后的动物四肢骨重量的3-4.5倍。
优选步骤(1)中静置脱脂的时间为1-2小时除去上层油脂；所述的减压为压力从2.7-3.0kg/cm2减到0.5-0.8kg/cm2，减压时间为2.0-2.5小时；所述的滤液蒸发浓缩为浓缩到原滤液体积的50-60％；所述的超声波辅助破碎细胞条件：超声波频率为26-30kHz，超声波功率为290-330w，温度为40-45℃，时间为15-20min；使用管道过滤器进行固液分离得滤液。
优选步骤(2)所述酸为盐酸或磷酸；酸的浓度为1.5-2.0mol/L。优选步骤(3)所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；碱的浓度为2.0-2.5mol/L。
优选步骤(4)中升温除酶的温度为87-100℃，处理时间15-20min；冷却至1-5℃。
优选步骤(5)中所述的超滤条件为：超滤膜为PS-10聚砜膜或聚丙烯(PP)中空纤维膜；超滤膜的截留量为9000-10000Da；超滤操作压力为0.07-0.09MPa；超滤温度为30-40℃；超滤时间为35-45min。
有益效果：
本发明方法采用减压提取辅助超声波破碎细胞，提高了提取率；运用酶解法生产，提高了降解效率，减少了常规提取方法中酸碱等的大量使用，能更好地保存骨肽中的活性多肽，提高产品的质量。本发明提取的骨肽产品质量好，出品率高，疗效显著，易操作、适合工业化生产。本发明制备的骨肽溶液，经检测骨肽提取率可高达6.401g/kg，比现有技术提高13.8％。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
取健康新鲜的猪四肢骨20kg，温水洗净后粉碎成直径0.5cm的骨块放入容器，添加蒸馏水，加入3倍骨重量的蒸馏水，蒸煮，静置后1小时后除去上层油脂。将其移入高压反应釜中，升温至110℃，压力维持在2.7kg/cm2，保持1.5小时，然后减压处理，使釜内压力从2.7kg/cm2减到0.5kg/cm2，减压过程时间2小时，然后对其进行超声波处理，超声条件：超声波频率为26kHz，超声波功率为300w，温度为40℃，时间为20min。目的为破坏骨细胞结构，使骨细胞中的蛋白溶出，提高产率。使用管道过滤器进行固液分离得滤液。将滤液浓缩为原体积的50％得浓缩液。
将浓缩液温度保持在30℃恒温，添加1.5mol/L的盐酸至pH值2.5左右，加入底物重量2％的胃蛋白酶，酶解6小时。再将酶解液加2.5mol/L的氢氧化钠溶液调至pH值7.5，加入底物重量0.5％的胰蛋白酶酶解6小时。
酶解完成后升温至87℃处理15min。将灭酶后的溶液进行超滤，超滤条件：选用截留量为10000Da的PS-10聚砜膜，操作压力为0.07MPa，温度为35℃，时间为45min。即得骨肽溶液。经检测骨肽提取率为6.181g/kg。
实施例2
取健康新鲜的牛四肢骨40kg，温水洗净后粉碎成直径1.5cm的骨块放入容器，添加蒸馏水，加入4倍骨重量的蒸馏水，蒸煮，静置后1.5小时后除去上层油脂。将其移入高压反应釜中，升温至120℃，压力维持在2.9kg/cm2，保持1.7小时，然后减压处理，使釜内压力从2.7kg/cm2减到0.8kg/cm2，减压过程时间2小时，然后对其进行超声波处理，超声条件：超声波频率为30kHz，超声波功率为290w，温度为42℃，时间为15min。,使用管道过滤器进行固液分离，得滤液。将滤液浓缩为原体积的50％，得浓缩液。
将浓缩液温度保持在37℃恒温，添加2mol/L的盐酸至pH值2.5左右，加入底物重量3％的糜蛋白酶，酶解7小时。再将酶解液加2.5mol/L的氢氧化钾溶液调至pH值7.8，加入底物重量1.5％的胰蛋白酶酶解8小时。
酶解完成后升温至95℃处理20min。将灭酶后的溶液进行超滤，超滤条件：选用截留量为9000Da的聚丙烯(PP)中空纤维膜，操作压力为0.08MPa，温度为30℃，时间为35min。即得骨肽溶液。经检测骨肽提取率为6.276g/kg。
实施例3
取健康新鲜的猪、羊四肢骨各15kg共30kg，温水洗净后粉碎成直径1.0cm的骨块放入容器，添加蒸馏水，加入5倍骨重量的蒸馏水，蒸煮，静置后2.0小时后除去上层油脂。将其移入高压反应釜中，升温至120℃，压力维持在3.0kg/cm2，保持2小时，然后减压处理，使釜内压力从3.0kg/cm2减到0.5kg/cm2，减压过程时间2.5小时，然后对其进行超声波处理，超声条件：超声波频率为28kHz，超声波功率为330w，温度为45℃，时间为18min。使用管道过滤器进行固液分离，得滤液。将滤液浓缩为原体积的60％，得浓缩液。
将浓缩液温度保持在40℃恒温，添加1.5mol/L的磷酸至pH值3.0左右，加入底物重量3％的胃蛋白酶，酶解8小时。再将酶解液加2.0mol/L的氢氧化钠溶液调至pH值8.0，加入底物重量1.5％的胰蛋白酶酶解7小时。
酶解完成后升温至100℃处理18min。将灭酶后的溶液进行超滤，超滤条件：选用截留量为10000Da的PS-10聚砜膜，操作压力为0.09MPa，温度为40℃，时间为40min。即得骨肽溶液。经检测骨肽提取率为6.401g/kg。

Claims (8)

1.一种骨肽溶液的制备方法，其具体步骤如下：
(1)取新鲜的动物四肢骨洗涤后粉碎，加水煮沸、静置脱脂，然后移入高压釜，升温至110-125℃，压力维持在2.7-3.0kg/cm2，保持1.5-2.0小时，然后减压；再用超声波辅助破碎细胞后进行固液分离得滤液；将滤液蒸发浓缩，得浓缩液；
(2)将步骤(1)中所得浓缩液维持在30-40℃，添加酸至pH值2.5-3.0，加入浓缩液重量2.0-3.0％的胃蛋白酶或糜蛋白酶消化6-8小时，得消化液，命名为消化液A；
(3)向步骤(2)所得消化液A中添加碱液至pH值7.5-8.0，加入浓缩液重量0.5-1.5％的胰蛋白酶消化6-8小时，温度维持在30-40℃，得消化液，命名为消化液B；
(4)将步骤(3)所得消化液B升温灭酶处理，然后冷却，静置分层，除去上层悬浮物和底层沉淀，取中间澄清液过滤得提取液；
(5)将步骤(4)所得提取液超滤，收集超滤液，即得骨肽溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的动物四肢骨为猪、牛或羊四肢骨中任一种或几种混合物；粉碎后四肢骨头粒径为0.5-1.5cm的骨块。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中加入的水量为粉碎后的动物四肢骨重量的3-4.5倍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中静置脱脂的时间为1-2小时；所述的减压为压力从2.7-3.0kg/cm2减到0.5-0.8kg/cm2，减压时间为2.0-2.5小时；所述的滤液蒸发浓缩为浓缩到原滤液体积的50-60％；所述的超声波辅助破碎细胞条件：超声波频率为26-30kHz，超声波功率为290-330w，温度为40-45℃，时间为15-20min；使用管道过滤器进行固液分离得滤液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述酸为盐酸或磷酸；酸的浓度为1.5-2.0mol/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；碱的浓度为2.0-2.5mol/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中升温除酶的温度为87-100℃，处理时间15-20min；冷却至1-5℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的超滤条件为：超滤膜为PS-10聚砜膜或聚丙烯(PP)中空纤维膜；超滤膜的截留量为9000-10000Da；超滤操作压力为0.07-0.09MPa；超滤温度为30-40℃；超滤时间为35-45min。
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