CN111549084A - 一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其包括将骨头破碎成骨块，蒸煮后干燥粉碎，加入蒸馏水调配至质量分数为20～30％；调节pH值至3.0～5.0，加入木瓜蛋白酶和还原剂，辅以超声波和微波进行预酶解；调节pH值至1.0～4.0，加入胃蛋白酶并辅以超声波进行一次酶解；调节pH值至7.0～8.5，加入糜蛋白酶与胰蛋白酶的混合酶，辅以超声波进行二次酶解；进行脱盐处理；收集多肽液进行喷雾干燥，得到蛋白小分子肽。本发明基于模拟人体消化道中主要的消化蛋白酶类的酶解程序，经预酶解及一次、二次酶解，并辅以超声波‑微波，酶解出便于人体直接吸收和利用的蛋白小分子肽类产品。

Description

一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法
技术领域
本发明涉及蛋白小分子肽生产领域，具体涉及一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法。
背景技术
动物骨头中的营养成分非常丰富，其包含丰富的蛋白质、脂肪和钙等成分。我国作为世界肉食第一大国，每年产生的骨头就有1500多万吨。故充分利用动物骨头，大力开发骨类食品，已成为食品行业，尤其是肉类加工企业的首要问题。
近年来的科学研究认为，并不是所有的蛋白都能被人体吸收利用，人体吸收蛋白质主要是以肽的形式吸收，蛋白质被摄入至人体后需要通过人体消化道特定复杂的蛋白质酶解程序，形成特定的蛋白小分子肽才能被人体吸收和利用，从而调节人体内各系统和细胞的生理功能。
目前，采用生物酶催化各种动物源性骨头的技术已在广泛开展，其中传统的制备工艺是将动物鲜骨在高温、高压下进行蒸煮后，去油脱脂，用碱或酸调节pH值后，加入蛋白酶将蛋白质酶解，酶解后可得到小分子的多肽。可见，目前对于动物鲜骨主要采用单一酶法水解，采用单一酶类或非人体消化道酶类水解生产的多肽产品，酶解耗时长，酶解度和寡肽含量低，并且仅凭简单的搅拌混合步骤，难以保证酶类与蛋白质充分结合均匀，酶解效果和效率差，酶解产物中相对分子量高的多肽占比高，并不适合于被人体直接吸收和利用，更不能提高人体的免疫力。
因此，如何研发出一种在促进蛋白质与酶类充分结合均匀的情况下，基于模拟人体消化道中主要的消化蛋白酶类的酶解程序，以酶解出便于人体直接吸收和利用的小分子肽类产品成为当下食品行业中存在的主要技术难题。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明公开了一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：
一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其包括以下步骤：
步骤1，将已洗净的新鲜动物骨头破碎成骨块，经由沸水蒸煮后，取骨块干燥粉碎后得干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为20～30％的骨泥液；
步骤2，调节所述骨泥液的pH值至3.0～5.0，加入木瓜蛋白酶和还原剂，辅以超声波和微波进行预酶解，得到预酶解液；
步骤3，将步骤2制得的所述预酶解液过滤、离心得到粗蛋白水解液；
步骤4，调节所述粗蛋白水解液的pH值至1.0～4.0，加入胃蛋白酶并辅以超声波进行一次酶解，得到一次酶解液；然后调节所述一次酶解液的pH值至7.0～8.5，加入糜蛋白酶与胰蛋白酶的混合酶，辅以超声波进行二次酶解；待完成二次酶解后，调节pH值至中性得到二次酶解液；
步骤5，采用强酸型阳离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂组成的混合床对所述二次酶解液进行脱盐处理，得到脱盐水解液；
步骤6，将所述脱盐水解液经超滤膜进行截留分离，收集多肽液进行喷雾干燥，得到蛋白小分子肽。
上述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其中所述步骤2的具体步骤包括：
步骤2-1，调节所述骨泥液的pH值至3.0～5.0，按所述干燥骨粉质量的0.5％加入木瓜蛋白酶，同时加入还原剂，其中木瓜蛋白酶与还原剂的质量分数比为1：0.2～1；
步骤2-2，在30～40℃下，辅以功率为200W的微波辐照5min，同时辅以功率为100～300W、频率为40～60kHz的超声波对所述骨泥液预酶解20～40min，得到预酶解液，其中超声波每工作10s间歇停止20s～40s。
上述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其中所述步骤4的具体步骤包括：
步骤4-1，调节所述粗蛋白水解液的pH值至1.0～4.0，按所述干燥骨粉质量的0.1％～0.2％加入胃蛋白酶，在40～50℃下辅以超声波酶解30～50min，得到一次酶解液；
步骤4-2，调节所述一次酶解液的pH值至7.0～8.5，按所述干燥骨粉质量的0.1％～0.2％加入糜蛋白酶与胰蛋白酶的混合酶，在30～40℃下辅以超声波酶解30～50min，得到二次酶解液，其中糜蛋白酶与胰蛋白酶的质量比为1：1；
步骤4-3，待完成二次酶解后，在90℃下灭酶10min，并调节pH值至中性得到二次酶解液。
上述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其中所述步骤4-1和步骤4-2中的超声波辅助酶解的条件为：功率为100～300W，频率为40～60kHz，且超声波每工作10s间歇停止20s～40s。
上述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其中在所述步骤4-2中，所述胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶的酶活力均为20万U/g。
上述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其中所述步骤2-1中的所述还原剂为抗坏血酸或异抗坏血酸，且按每10万U酶活力的所述木瓜蛋白酶计，还原剂的添加量为25mg～125mg。
上述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其中所述木瓜蛋白酶的酶活力为80万U/g。
上述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其中所述步骤1的具体步骤包括：
步骤1-1，将已洗净的新鲜动物骨头破碎成骨块，按1:2～3的料液比加入沸水蒸煮40-80min；
步骤1-2，去除蒸煮液表层油脂后，将骨块沥干并在80～90℃下干燥至含水量小于5％；
步骤1-3，将所述步骤1-2干燥的骨块依次进行粗粉碎、超微粉碎至粒径小于200目得到干燥骨粉；
步骤1-4，取所述步骤1-3的干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为20～30％的骨泥液。
上述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其中所述步骤6的具体步骤包括：将所述脱盐水解液经以4000r/min的转速离心20min，取上层离心清液并由超滤膜进行截留分离，收集分子量为1kDal以下的多肽液进行喷雾干燥，得到蛋白小分子肽。
上述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其中所述步骤6中的喷雾干燥条件为：进口温度180℃、出口温度120℃。
本发明的有益效果为：
(1)本发明通过在酸性条件下，结合采用木瓜蛋白酶与还原剂，同时辅以微波-超声波进行酶解，实现对新鲜动物骨头及骨髓蛋白进行预酶解，从而便于在后续的酶解过程中形成特定小分子肽类产品的多肽，有效地提高酶解效率，缩短酶解时间，其中，超声波与微波协同，促进蛋白质与酶类充分结合均匀，也促进还原剂和酶促中心二硫键的碰撞，进一步提高酶解效果与效率，且还原剂大大地提高木瓜蛋白酶的活性与酶解效率，木瓜蛋白酶的成本低且获得途径便捷；
(2)本发明通过依次采用胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶进行一次、二次酶解，以模拟人体消化道中主要的消化蛋白酶类的酶解程序，根据不同酶类具有不同的酶切位点，使多肽进一步酶解成与人体消化道酶解产物相似的蛋白小分子肽，实现蛋白小分子肽可直接被人体吸收和利用；另外，在一次、二次酶解过程中辅以超声波，促进多肽与酶类充分结合均匀，进一步提高酶解效果与效率；
(3)本发明采用猪、牛或羊骨头，通过依次进行粗粉碎、超微粉碎至小粒径骨粉，在后续酶解过程中便于与酶充分接触，进一步提高酶解效率；
(4)采用强酸型阳离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂组成的混合床进行脱盐处理，脱盐效率高，经脱盐后的低盐终产物有益于人体吸收补充；
(5)所制得的蛋白小分子肽中1kDal以下的多肽得率高达85％以上，与对比例相比细胞转运和免疫调节数据显著提高，模拟细胞肽转运系统吸收产物中肽氮含量约为1.93±0.16mmol/L Gly，白介素-6(IL-6)含量约为361.4±29.8pg/mL，吞噬指数约为8.6±0.6，抗体积数约为67±7.7，可见，采用本发明的酶解制备方法，酶解效果和效率高，蛋白小分子肽能被直接吸收利用，具有潜在的生理活性，在机体健康保护方面具有重要的意义，并且不但没有对机体的免疫器官造成影响，还具有显著的调节免疫功能的作用，实现小分子肽类产品可直接被人体吸收和利用，适用于不同人群的服用需要，以提高免疫力的目的。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，而非对本发明进行限制。
本发明提供的一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其制备方法包括以下步骤：
步骤1，将已洗净的新鲜动物骨头破碎成骨块，经由沸水蒸煮后，取骨块干燥粉碎后得干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为20～30％的骨泥液；
步骤2，调节所述骨泥液的pH值至3.0～5.0，加入木瓜蛋白酶和还原剂，辅以超声波和微波进行预酶解，得到预酶解液；
步骤3，将步骤2制得的所述预酶解液过滤、离心得到粗蛋白水解液；
步骤4，调节所述粗蛋白水解液的pH值至1.0～4.0，加入胃蛋白酶并辅以超声波进行一次酶解，得到一次酶解液；然后调节所述一次酶解液的pH值至7.0～8.5，加入糜蛋白酶与胰蛋白酶的混合酶，辅以超声波进行二次酶解；待完成二次酶解后，调节pH值至中性得到二次酶解液；
步骤5，采用强酸型阳离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂组成的混合床对所述二次酶解液进行脱盐处理，得到脱盐水解液；脱盐效率高，经脱盐后的低盐终产物有益于人体吸收补充；
步骤6，将所述脱盐水解液经超滤膜进行截留分离，收集多肽液进行喷雾干燥，得到蛋白小分子肽。
较佳地，所述步骤2的具体步骤包括：
步骤2-1，调节所述骨泥液的pH值至3.0～5.0，按所述干燥骨粉质量的0.5％加入木瓜蛋白酶，同时加入还原剂，其中木瓜蛋白酶与还原剂的质量分数比为1：0.2～1；优选地，所述木瓜蛋白酶的酶活力为80万U/g，所述还原剂为抗坏血酸或异抗坏血酸，且按每10万U酶活力的所述木瓜蛋白酶计，还原剂的添加量为25mg～125mg；
步骤2-2，在30～40℃下，辅以功率为200W的微波辐照5min，同时辅以功率为100～300W、频率为40～60kHz的超声波对所述骨泥液预酶解20～40min，得到预酶解液，其中超声波每工作10s间歇停止20s～40s；通过在酸性条件下，结合采用木瓜蛋白酶与还原剂，同时辅以微波-超声波进行酶解，实现对新鲜动物骨头及骨髓蛋白进行预酶解，从而便于在后续的酶解过程中形成特定小分子肽类产品的多肽，有效地提高酶解效率，缩短酶解时间，其中，超声波与微波协同，促进蛋白质与酶类充分结合均匀，也促进还原剂和酶促中心二硫键的碰撞，进一步提高酶解效果与效率，且还原剂大大地提高木瓜蛋白酶的活性与酶解效率，木瓜蛋白酶的成本低且获得途径便捷。
较佳地，所述步骤4的具体步骤包括：
步骤4-1，调节所述粗蛋白水解液的pH值至1.0～4.0，按所述干燥骨粉质量的0.1％～0.2％加入胃蛋白酶，在40～50℃下辅以超声波酶解30～50min，得到一次酶解液；
步骤4-2，调节所述一次酶解液的pH值至7.0～8.5，按所述干燥骨粉质量的0.1％～0.2％加入糜蛋白酶与胰蛋白酶的混合酶，在30～40℃下辅以超声波酶解30～50min，得到二次酶解液，其中糜蛋白酶与胰蛋白酶的质量比为1：1；优选地，所述胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶的酶活力均为20万U/g；
步骤4-3，待完成二次酶解后，在90℃下灭酶10min，并调节pH值至中性得到二次酶解液；
优选地，所述步骤4-1和步骤4-2中的超声波辅助酶解的条件为：功率为100～300W，频率为40～60kHz，且超声波每工作10s间歇停止20s～40s；通过依次采用胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶进行一次、二次酶解，以模拟人体消化道中主要的消化蛋白酶类的酶解程序，根据不同酶类具有不同的酶切位点，使多肽进一步酶解成与人体消化道酶解产物相似的小分子肽类产品，实现小分子肽类产品可直接被人体吸收和利用，适用于不同人群的服用需要，以提高免疫力；另外，在一次、二次酶解过程中辅以超声波，促进多肽与酶类充分结合均匀，进一步提高酶解效果与效率。
较佳地，所述步骤1的具体步骤包括：
步骤1-1，将已洗净的新鲜动物骨头破碎成骨块，按1:2～3的料液比加入沸水蒸煮40-80min，优选地，所述新鲜动物骨头采用猪、牛或羊骨头；
步骤1-2，去除蒸煮液表层油脂后，将骨块沥干并在80～90℃下干燥至含水量小于5％；
步骤1-3，将所述步骤1-2干燥的骨块依次进行粗粉碎、超微粉碎至粒径小于200目得到干燥骨粉，由于粉碎成小粒径骨粉，在后续酶解过程中便于与酶充分接触，提高酶解效率；
步骤1-4，取所述步骤1-3的干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为20～30％的骨泥液。
进一步地，所述步骤6的具体步骤包括：将所述脱盐水解液经以4000r/min的转速离心20min，取上层离心清液并由超滤膜进行截留分离，收集分子量为1kDal以下的多肽液进行喷雾干燥，得到蛋白小分子肽；优选地，喷雾干燥条件为：进口温度180℃、出口温度120℃。
现根据本发明的制备方法详细描述如下实施例，并根据实施例作出相应的对比例，以进一步理解和掌握本发明技术方案。
实施例1：本实施例提供的一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其制备方法包括以下步骤：
步骤1，将500g已洗净的新鲜猪骨头破碎成约为3×3cm的骨块，加入1kg沸水蒸煮40min；去除蒸煮液表层油脂后，将骨块沥干并在80℃下干燥至含水量为4.5％；再将干燥的骨块依次进行粗粉碎、超微粉碎后，过200目筛子得到干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为20％的骨泥液；
步骤2，用盐酸调节所述骨泥液的pH值至3.0，加入2.5g木瓜蛋白酶，同时加入500mg抗坏血酸，其中木瓜蛋白酶的酶活力为80万U/g；在30℃下，辅以功率为200W的微波辐照5min，同时辅以功率为300W、频率为40kHz的超声波对所述骨泥液预酶解20min，得到预酶解液，其中超声波每工作10s间歇停止40s；
步骤3：将步骤2制得的所述预酶解液采用压滤机进行过滤，并以4000r/min的转速离心20min，得到粗蛋白水解液；
步骤4：用盐酸调节所述粗蛋白水解液的pH值至1.0，加入0.5g胃蛋白酶，在40℃下辅以辅以功率为100W，频率为60kHz的超声波酶解30min，得到一次酶解液；用氢氧化钠溶液调节所述一次酶解液的pH值至7.0，加入0.25g糜蛋白酶与0.25g胰蛋白酶的混合酶，在40℃下辅以功率为100W，频率为60kHz的超声波酶解30min，得到二次酶解液，其中胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶的酶活力均为20万U/g，超声波每工作10s间歇停止30s；待完成二次酶解后，在90℃下灭酶10min，并调节pH值至中性得到二次酶解液；
步骤5：采用强酸型阳离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂组成的混合床对所述二次酶解液进行脱盐处理，得到脱盐水解液；
步骤6：将所述脱盐水解液经以4000r/min的转速离心20min，取上层离心清液并由超滤膜进行截留分离，依次收集分子量为10kDal以上、5～10kDal、1～5kDal和1kDal以下4个分子量段的多肽液；分别取上述4个分子量段的多肽液进行喷雾干燥，并计算各分子量段的多肽液中多肽得率，最后混合由各分子量段的多肽液喷雾干燥的产物得到棕黄色粉末状的蛋白小分子肽，其中，喷雾干燥条件为进口温度180℃、出口温度120℃。
对比例1-1：本对比例的制备方法与实施例1的制备方法大致相同，其区别在于：步骤2，用盐酸调节所述骨泥液的pH值至3.0，加入2.5g木瓜蛋白酶，在30℃下预酶解20min，得到预酶解液，其中木瓜蛋白酶的酶活力为80万U/g。
对比例1-2：本对比例的制备方法与实施例1的制备方法大致相同，其区别在于：步骤2，用盐酸调节所述骨泥液的pH值至3.0，加入2.5g木瓜蛋白酶，在30℃下，辅以功率为200W的微波辐照5min，同时辅以功率为300W、频率为40kHz的超声波对所述骨泥液预酶解20min，得到预酶解液，其中木瓜蛋白酶的酶活力为80万U/g，超声波每工作10s间歇停止40s；
实施例2：本实施例提供的一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其制备方法包括以下步骤：
步骤1，将500g已洗净的新鲜牛骨头破碎成约为3×3cm的骨块，加入1.25kg沸水蒸煮50min；去除蒸煮液表层油脂后，将骨块沥干并在85℃下干燥至含水量为3.8％；再将干燥的骨块依次进行粗粉碎、超微粉碎后，过200目筛子得到干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为25％的骨泥液；
步骤2，用盐酸调节所述骨泥液的pH值至4.0，加入2.5g木瓜蛋白酶，同时加入1.6g抗坏血酸，其中木瓜蛋白酶的酶活力为80万U/g；在40℃下，辅以功率为200W的微波辐照5min，同时辅以功率为200W、频率为50kHz的超声波对所述骨泥液预酶解30min，得到预酶解液，其中超声波每工作10s间歇停止30s；
步骤3：将步骤2制得的所述预酶解液采用压滤机进行过滤，并以4000r/min的转速离心20min，得到粗蛋白水解液；
步骤4：用盐酸调节所述粗蛋白水解液的pH值至2.0，加入0.8g胃蛋白酶，在35℃下辅以功率为200W，频率为50kHz的超声波酶解35min，得到一次酶解液；用氢氧化钠溶液调节所述一次酶解液的pH值至7.8，加入0.4g糜蛋白酶与0.4g胰蛋白酶的混合酶，在35℃下辅以功率为200W，频率为50kHz的超声波酶解35min，得到二次酶解液，其中胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶的酶活力均为20万U/g，超声波每工作10s间歇停止40s；待完成二次酶解后，在90℃下灭酶10min，并调节pH值至中性得到二次酶解液；
步骤5：采用强酸型阳离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂组成的混合床对所述二次酶解液进行脱盐处理，得到脱盐水解液；
步骤6：将所述脱盐水解液经以4000r/min的转速离心20min，取上层离心清液并由超滤膜进行截留分离，依次收集分子量为10kDal以上、5～10kDal、1～5kDal和1kDal以下4个分子量段的多肽液；分别取上述4个分子量段的多肽液进行喷雾干燥，并计算各分子量段的多肽液中多肽得率，最后混合由各分子量段的多肽液喷雾干燥的产物得到棕黄色粉末状的蛋白小分子肽，其中，喷雾干燥条件为进口温度180℃、出口温度120℃。
对比例2-1：本对比例的制备方法与实施例2的制备方法大致相同，其区别在于：步骤4：用盐酸调节所述粗蛋白水解液的pH值至2.0，加入0.8g胃蛋白酶，在35℃下辅以功率为200W，频率为50kHz的超声波酶解35min，待完成酶解后，在90℃下灭酶10min，并调节pH值至中性得到酶解液，其中胃蛋白酶的酶活力为20万U/g，超声波每工作10s间歇停止40s。
对比例2-2：本对比例的制备方法与实施例2的制备方法大致相同，其区别在于：步骤4：用盐酸调节所述粗蛋白水解液的pH值至2.0，加入0.8g胃蛋白酶，在35℃下辅以功率为200W，频率为50kHz的超声波酶解35min，得到一次酶解液；用氢氧化钠溶液调节所述一次酶解液的pH值至7.8，加入0.8g胰蛋白酶的混合酶，在35℃下辅以功率为200W，频率为50kHz的超声波酶解35min，得到二次酶解液，其中胃蛋白酶、胰蛋白酶的酶活力均为20万U/g，超声波每工作10s间歇停止40s；待完成二次酶解后，在90℃下灭酶10min，并调节pH值至中性得到二次酶解液。
对比例2-3：本对比例的制备方法与实施例2的制备方法大致相同，其区别在于：步骤4：用盐酸调节所述粗蛋白水解液的pH值至2.0，加入0.8g胃蛋白酶，在35℃下酶解35min，得到一次酶解液；用氢氧化钠溶液调节所述一次酶解液的pH值至7.8，加入0.4g糜蛋白酶与0.4g胰蛋白酶的混合酶，在35℃下酶解35min，得到二次酶解液，其中胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶的酶活力均为20万U/g；待完成二次酶解后，在90℃下灭酶10min，并调节pH值至中性得到二次酶解液。
实施例3：本实施例提供的一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其制备方法包括以下步骤：
步骤1，将500g已洗净的新鲜羊骨头破碎成约为3×3cm的骨块，加入1.5kg沸水蒸煮60min；去除蒸煮液表层油脂后，将骨块沥干并在90℃下干燥至含水量为4.3％；再将干燥的骨块依次进行粗粉碎、超微粉碎后，过200目筛子得到干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为30％的骨泥液；
步骤2，用盐酸调节所述骨泥液的pH值至5.0，加入2.5g木瓜蛋白酶，同时加入2.5g异抗坏血酸，其中木瓜蛋白酶的酶活力为80万U/g；在35℃下，辅以功率为200W的微波辐照5min，同时辅以功率为100W、频率为40kHz的超声波对所述骨泥液预酶解35min，得到预酶解液，其中超声波每工作10s间歇停止20s；
步骤3：将步骤2制得的所述预酶解液采用压滤机进行过滤，并以4000r/min的转速离心20min，得到粗蛋白水解液；
步骤4：用盐酸调节所述粗蛋白水解液的pH值至4.0，加入1g胃蛋白酶，在40℃下辅以功率为100W，频率为40kHz的超声波酶解30min，得到一次酶解液；用氢氧化钠溶液调节所述一次酶解液的pH值至8.5，加入0.5g糜蛋白酶与0.5g胰蛋白酶的混合酶，在40℃下辅以功率为100W，频率为40kHz的超声波酶解30min，得到二次酶解液，其中胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶的酶活力均为20万U/g，超声波每工作10s间歇停止30s；待完成二次酶解后，在90℃下灭酶10min，并调节pH值至中性得到二次酶解液；
步骤5：采用强酸型阳离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂组成的混合床对所述二次酶解液进行脱盐处理，得到脱盐水解液；
步骤6：将所述脱盐水解液经以4000r/min的转速离心20min，取上层离心清液并由超滤膜进行截留分离，依次收集分子量为10kDal以上、5～10kDal、1～5kDal和1kDal以下4个分子量段的多肽液；分别取上述4个分子量段的多肽液进行喷雾干燥，并计算各分子量段的多肽液中多肽得率，最后混合由各分子量段的多肽液喷雾干燥的产物得到棕黄色粉末状的蛋白小分子肽，其中，喷雾干燥条件为进口温度180℃、出口温度120℃。
对比例3：本对比例采用传统的酶解制备方法，其步骤包括：
步骤1，将500g已洗净的新鲜羊骨头破碎成约为3×3cm的骨块，加入1.5kg沸水于0.1MPa压力下蒸煮3h；去除蒸煮液表层油脂后，将骨块沥干并在50℃下干燥6h，用粉碎机粉碎并过80目筛子得到干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为8％的骨泥液；
步骤2，按所述干燥骨粉质量的1％加入5g木瓜蛋白酶，在60℃下酶解4h后，升温至90℃下灭酶10min，得到酶解液；
步骤3：将步骤2制得的所述酶解液采用压滤机进行过滤，并以4000r/min的转速离心20min，得到粗蛋白水解液；
步骤4：采用超滤膜对所述粗蛋白水解液进行截留分离，依次收集分子量为10kDal以上、5～10kDal、1～5kDal和1kDal以下4个分子量段的多肽液；分别取上述4个分子量段的多肽液进行喷雾干燥，并计算各分子量段的多肽液中多肽得率，最后混合由各分子量段的多肽液喷雾干燥的产物得到棕黄色粉末状的蛋白小分子肽，其中，喷雾干燥条件为进口温度180℃、出口温度120℃。
检测项目：
1.对实施例1～3、及相应的各个对比例中步骤3所制得的所述粗蛋白水解液分别进行水解程度参数测定。采用甲醛滴定法测定所述粗蛋白水解液的水解度(DH)，以及采用三氯乙酸-可溶性氮法测定所述粗蛋白水解液中寡肽得率(TCA-NSI)，详细的测定结果如表1所示。
表1粗蛋白水解液的水解度与寡肽得率的测定结果
Figure BDA0002488078700000121
Figure BDA0002488078700000131
2.对实施例1～3、及相应的各个对比例中步骤6收集的分子量为10kDal以上、5～10kDal、1～5kDal和1kDal以下4个分子量段的多肽液分别进行水解程度参数测定，计算各分子量段的多肽液的多肽得率，详细的测定结果如表2所示。
表2各分子量段的多肽液的多肽得率的测定结果
10kDal以上/％ 5～10kDal/％ 1～5kDal/％ 1kDal以下/％
实施例1 0 1.62 13.31 85.07
对比例1-1 12.62 67.20 14.47 5.71
对比例1-2 11.46 24.71 19.62 44.21
实施例2 0 2.67 6.60 90.73
对比例2-1 0 7.34 8.52 84.14
对比例2-2 0 4.34 7.63 88.03
对比例2-3 0 9.92 14.56 75.52
实施例3 0 1.94 9.71 88.35
对比例3 9.31 38.50 41.73 10.46
结合表1与表2中的数据，通过对比实施例1、对比例1-1与对比例1-2可知，由于对比例1-1的步骤2中缺少使用还原剂、及辅以微波-超声波酶解的步骤，所述粗蛋白水解液的水解度和相应的寡肽得率明显降低，1kDal以下的蛋白小分子肽的多肽含量也较低，而对比例1-1的步骤2中缺少使用还原剂步骤，在辅以微波-超声波酶解的条件下，所述粗蛋白水解液的水解度维持中等水平，相应的寡肽得率并未能显著提高，1kDal以下的蛋白小分子肽的多肽含量仍维持较低的比例，可见，在步骤2中，添加还原剂并辅以微波-超声波酶解，有效地提高酶解效果。通过对比实施例2、对比例2-1、对比例2-2与对比例2-3可知，由于对比例2-1的步骤4中缺少使用糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶，1kDal以下的蛋白小分子肽的多肽含量占比接近于实施例2的多肽含量，但是5-10kDal的多肽含量则高于实施例2的多肽含量，即酶解液中仍有较多的多肽片段未能充分酶解成蛋白小分子肽；对比例2-2的步骤4中缺少使用糜蛋白酶，1kDal以下的蛋白小分子肽的多肽含量占比与实施例2的多肽含量相近，但是5-10kDal的多肽含量还是高于实施例2的多肽含量，即仅使用糜蛋白酶以取代糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶的酶解效果略差；对比例2-3的步骤4中缺少辅以超声波酶解，1kDal以下的蛋白小分子肽的多肽含量占比与实施例2的多肽含量相比显著下降，可见，在步骤4中，采用糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶并辅以超声波酶解，大大地提高酶解效果。通过对比实施例3与对比例3可知，对比例3采用传统的酶解制备方法，所述粗蛋白水解液的水解度和相应的寡肽得率略低，1kDal以下的蛋白小分子肽的多肽得率占比远低于实施例3的多肽得率，且多聚集在1-10kDal的范围内，可见，本方案的制备方法的酶解效果和效率优于传统的酶解制备方法。
3.采用Caco-2细胞模型模拟肠吸收，对实施例1～3、及相应的各个对比例所制得的蛋白小分子肽分别进行吸收转运效率参数测定。
Caco-2细胞培养基含有10％胎牛血清、1％非必须氨基酸、1％的双抗的DMEM培养液，并在37℃、相对湿度为90％、二氧化碳浓度为5％的培养箱中进行培养。待细胞状态良好时进行消化后接种于Transwell板的上侧，同时下侧加入3mL培养液。通过Millicell电阻仪测定跨膜电阻以检测细胞的完整性，当跨膜电阻达到800Ω以上时，可作为吸收转运模型。
分别将实施例1～3、及相应的各个对比例获得的蛋白小分子肽产物用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)配制浓度为10mg/mL。用37℃预温的HBSS清洗Caco-2单层细胞上侧和下侧，在上侧添加1.5mL溶于HBSS的样品，在下侧添加3mL的HBSS。置于37℃细胞培养箱中孵育2h，每组3个重复。分别收集下侧吸收的溶液，冷冻干燥备用。以溶剂HBSS代替样品作为空白对照，茶多酚为阳性对照。
通过测定转运到Caco-2细胞另一侧的液体中的肽氮含量，评估各个实施例和对比例获得的蛋白小分子肽产品被人体直接吸收转运的占比，详细的测定结果如表3所示。
表3模拟细胞肽转运系统吸收产物中肽氮含量的测定结果
肽氮含量(mmol/LGly)
实施例1 1.68±0.19**
对比例1-1 0.11±0.05
对比例1-2 0.26±0.11
实施例2 2.17±0.20*
对比例2-1 1.38±0.17
对比例2-2 1.95±0.13
对比例2-3 0.79±0.16
实施例3 1.94±0.10**
对比例3 0.72±0.17
*P<0.05表示实施例和对比例相比具有显著差异；**P<0.01表示实施例和对比例相比具有极显著差异。
由表3可知，在相同的模拟转运的时间内，各实施例和及其相对应的对比例的吸收产物中肽氮含量有显著差异，各实施例样品中的肽氮含量显著高于相对应的对比例样品，表明个实施例样品中的蛋白小分子肽被细胞肽转运系统直接吸收转运的比例显著高于对比例，经吸收的肽具有潜在的生理活性，在机体健康保护方面具有重要的意义。
4.对免疫功能调节作用的评价
本实验通过测定小鼠食用实施例1～3、及相应的各个对比例制得的蛋白小分子肽后的细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞的吞噬功能指标，综合评价各个实施例和对比例获得的所有分子量的多肽对小鼠免疫功能的调节作用。
实验对象：6周龄左右雌性二级昆明种雌性小鼠，体重范围：18-20g，由华南理工大学提供，动物使用许可证号：SYXK(粤)2017-0178。动物实验分10组，每组10只小鼠，实验组分别灌服实施例1～3、及相应的各个对比例制备的蛋白小分子肽水溶液，对照组灌服相同剂量的蒸馏水，共灌服15天，每日剂量都为1g/kg体重。
检测实验：
(1)采用二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应试验法(耳肿胀法)检测小鼠细胞免疫功能——测定白介素-6(IL-6)含量；
(2)采用碳廓清实验法测定小鼠单核-巨噬细胞功能——计算吞噬指数；
(3)采用血清溶血素实验(血凝法)测定小鼠体液免疫功能——计算抗体积数，详细的检测结果如表4所示。
表4免疫功能各指数的测定结果
Figure BDA0002488078700000161
*P<0.05表示实施例和对比例相比具有显著差异；**P<0.01表示实施例和对比例相比具有极显著差异。
由表4可知，各实施例制备的蛋白小分子肽相比于其相对应的对比例及对照组，具有显著的调节免疫功能的作用，特别是采用牛骨头制备的小分子多肽，能够极显著提高小鼠的耳片重量差值、白介素-6含量、血清溶血素抗体积数，显著提高巨噬细胞吞噬指数。而对比例制备的蛋白小分子肽和对照组相比，仅个别指标与对照组相比具有显著差异，其他大部分指标相差无几，这反映了各实施例结合使用胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶，并辅以超声波-微波酶解，不仅大大地提高了酶解的效率，而且进一步酶解成与人体消化道酶解产物相似的小分子肽类产品，具有显著增强小鼠细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞功能的作用，而胸腺/体重、脾脏/体重、肝脏/体重的比值均未见明显的差异，表明各个实施例和对比例制备的蛋白小分子肽没有对小鼠免疫器官造成影响，实现小分子肽类产品可直接被吸收和利用的目标，以提高免疫力。
综上所述，本发明具有以下优势：
(1)本发明通过在酸性条件下，结合采用木瓜蛋白酶与还原剂，同时辅以微波-超声波进行酶解，实现对新鲜动物骨头及骨髓蛋白进行预酶解，从而便于在后续的酶解过程中形成特定小分子肽类产品的多肽，有效地提高酶解效率，缩短酶解时间，其中，超声波与微波协同使用，促进蛋白质与酶类充分结合均匀，也促进还原剂和酶促中心二硫键的碰撞，进一步提高酶解效果与效率，且还原剂大大地提高木瓜蛋白酶的活性与酶解效率，木瓜蛋白酶的成本低且获得途径便捷；
(2)本发明通过依次采用胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶进行一次、二次酶解，以模拟人体消化道中主要的消化蛋白酶类的酶解程序，根据不同酶类具有不同的酶切位点，使多肽进一步酶解成与人体消化道酶解产物相似的小分子肽类产品，实现小分子肽类产品可直接被人体吸收和利用；另外，在一次、二次酶解过程中辅以超声波，促进多肽与酶类充分结合均匀，进一步提高酶解效果与效率；
(3)本发明采用猪、牛或羊骨头，通过依次进行粗粉碎、超微粉碎至小粒径骨粉，在后续酶解过程中便于与酶充分接触，进一步提高酶解效率；
(4)采用强酸型阳离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂组成的混合床进行脱盐处理，脱盐效率高，经脱盐后的低盐终产物有益于人体吸收补充；
(5)所制得的蛋白小分子肽中1kDal以下的多肽得率高达85％以上，模拟细胞肽转运系统吸收产物中肽氮含量约为1.93±0.16mmol/L Gly，白介素-6(IL-6)含量约为361.4±29.8pg/mL，吞噬指数约为8.6±0.6，抗体积数约为67±7.7，可见，采用本发明的酶解制备方法，酶解效果和效率高，蛋白小分子肽能被直接吸收利用，具有潜在的生理活性，在机体健康保护方面具有重要的意义，并且不但没有对机体的免疫器官造成影响，还具有显著的调节免疫功能的作用，实现小分子肽类产品可直接被人体吸收和利用，适用于不同人群的服用需要，以提高免疫力的目的。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术手段和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。故凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明之形状、构造及原理所作的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
步骤1，将已洗净的新鲜动物骨头破碎成骨块，经由沸水蒸煮后，取骨块干燥粉碎后得干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为20～30％的骨泥液；
步骤2，调节所述骨泥液的pH值至3.0～5.0，加入木瓜蛋白酶和还原剂，辅以超声波和微波进行预酶解，得到预酶解液；
步骤3，将步骤2制得的所述预酶解液过滤、离心得到粗蛋白水解液；
步骤4，调节所述粗蛋白水解液的pH值至1.0～4.0，加入胃蛋白酶并辅以超声波进行一次酶解，得到一次酶解液；然后调节所述一次酶解液的pH值至7.0～8.5，加入糜蛋白酶与胰蛋白酶的混合酶，辅以超声波进行二次酶解；待完成二次酶解后，调节pH值至中性得到二次酶解液；
步骤5，采用强酸型阳离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂组成的混合床对所述二次酶解液进行脱盐处理，得到脱盐水解液；
步骤6，将所述脱盐水解液经超滤膜进行截留分离，收集多肽液进行喷雾干燥，得到蛋白小分子肽。
2.根据权利要求1所述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤2的具体步骤包括：
步骤2-1，调节所述骨泥液的pH值至3.0～5.0，按所述干燥骨粉质量的0.5％加入木瓜蛋白酶，同时加入还原剂，其中木瓜蛋白酶与还原剂的质量分数比为1：0.2～1；
步骤2-2，在30～40℃下，辅以功率为200W的微波辐照5min，同时辅以功率为100～300W、频率为40～60kHz的超声波对所述骨泥液预酶解20～40min，得到预酶解液，其中超声波每工作10s间歇停止20s～40s。
3.根据权利要求2所述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤4的具体步骤包括：
步骤4-1，调节所述粗蛋白水解液的pH值至1.0～4.0，按所述干燥骨粉质量的0.1％～0.2％加入胃蛋白酶，在40～50℃下辅以超声波酶解30～50min，得到一次酶解液；
步骤4-2，调节所述一次酶解液的pH值至7.0～8.5，按所述干燥骨粉质量的0.1％～0.2％加入糜蛋白酶与胰蛋白酶的混合酶，在30～40℃下辅以超声波酶解30～50min，得到二次酶解液，其中糜蛋白酶与胰蛋白酶的质量比为1：1；
步骤4-3，待完成二次酶解后，在90℃下灭酶10min，并调节pH值至中性得到二次酶解液。
4.根据权利要求3所述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤4-1和步骤4-2中的超声波辅助酶解的条件为：功率为100～300W，频率为40～60kHz，且超声波每工作10s间歇停止20s～40s。
5.根据权利要求4所述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，在所述步骤4-2中，所述胃蛋白酶、糜蛋白酶与胰蛋白酶的酶活力均为20万U/g。
6.根据权利要求2所述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤2-1中的所述还原剂为抗坏血酸或异抗坏血酸，且按每10万U酶活力的所述木瓜蛋白酶计，还原剂的添加量为25mg～125mg。
7.根据权利要求6所述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的酶活力为80万U/g。
8.根据权利要求3所述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤1的具体步骤包括：
步骤1-1，将已洗净的新鲜动物骨头破碎成骨块，按1:2～3的料液比加入沸水蒸煮40-80min；
步骤1-2，去除蒸煮液表层油脂后，将骨块沥干并在80～90℃下干燥至含水量小于5％；
步骤1-3，将所述步骤1-2干燥的骨块依次进行粗粉碎、超微粉碎至粒径小于200目得到干燥骨粉；
步骤1-4，取所述步骤1-3的干燥骨粉，加入蒸馏水调配至质量分数为20～30％的骨泥液。
9.根据权利要求8所述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤6的具体步骤包括：将所述脱盐水解液经以4000r/min的转速离心20min，取上层离心清液并由超滤膜进行截留分离，收集多肽液进行喷雾干燥，得到蛋白小分子肽。
10.根据权利要求9所述的模拟人体消化道酶解制备蛋白小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤6中的喷雾干燥条件为：进口温度180℃、出口温度120℃。
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