CN106244659A - 制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法。所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法包括如下步骤：步骤一、软骨预处理；步骤二、软骨粉的制备；步骤三、脱脂处理；步骤四、脱钙处理；步骤五、除杂沉淀；步骤六、胶原蛋白的制备；步骤七：测定胶原蛋白含量；步骤八：配制胶原蛋白液；步骤九：胶原蛋白多肽液半成品的制备；步骤十：胶原蛋白多肽的制备。本制备工艺不仅很好的开发和利用了动物骨骼，增加了对动物副产物的开发价值和空间，而且深化和丰富了胶原蛋白和胶原蛋白肽提取的方法，为胶原蛋白多肽应用范围的研究奠定了理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学与生物技术领域，尤其涉及一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法。
背景技术
随着畜禽养殖的迅猛发展，副产物随之大量增加，这些副产物的深加工必须跟上养殖业的发展步伐，才能提高畜禽养殖的经济效益，减少资源浪费，促进产业持续、快速、健康、稳定地发展。因此，加强畜禽副产物的开发利用具有十分重要的意义。畜禽副产物的开发利用主要包括对畜禽的血液、骨、内脏、皮毛、蹄等的综合加工利用。目前，利用畜禽的副产品进行生化制药，己是与现代生物科技紧密结合的一项高科技产业，如何发展更多具有科技含量高、附加值高的畜禽副产品利用项目，已成为畜禽副产品研究、开发的重点。
畜禽骨骼由骨膜、骨质、骨髓构成，是蛋白质和钙质组成的网状结构，再构成管状，管内充满了含多种营养物质的骨髓，如构成脑组织的磷脂及防止老化的骨胶原、软骨素等，鲜骨中含有蛋白质、脂肪、矿物质(如钙、磷、铁等)、骨胶原、软骨素以及维生素A、B1、B2等。
畜骨蛋白是较为全价的可溶性蛋白质，生物学效价高。骨蛋白的主要成分为胶原蛋白。畜骨中的蛋白质提取主要是指对骨胶的提取。骨胶就是粉碎后的畜骨经洗涤脱脂，加酸去杂，浸泡熬煮，浓缩成胶冻状的物质。骨胶的主要成分就是骨蛋白，它被广泛应用于医药和食品工业中。
胶原多肽亦称水解明胶，是胶原或明胶经过蛋白酶等降解处理得到的分子量约为3000～20000Da，与明胶相比具有较强的水溶性，易被人体吸收的一类多肽混合物。胶原多肽具有较多的生理功能，例如抗高血压、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病、抗衰老和抗氧化等。因此，胶原多肽在保健食品、化妆品等领域具有较广泛的用途。
一般的胶原多肽生产方法按工艺类型分有种酸法、碱法、高温热解法和酶法。酸法和碱法工艺简单，成本低，但产品中含盐量较高，相对分子质量分布较宽，不适合生产高品质的食品级胶原多肽，而且由于这两种方法在生产过程中需要长时间浸泡，对设备的材质要求都比较高。高温热解法产品含盐量低，但水解时间长，需带压操作，产品相对分子质量分布不均且不易控制，也不适合生产高品质的食品级胶原多肽。与前三种方法相比，酶法生产周期短，产品的相对分子质量分布较窄，易控制，而且卫生环保。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种操作简单、生产周期短、可提高资源利用率、提高畜禽养殖附加值的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法。
本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
步骤一、软骨预处理：将新鲜软骨剔除骨膜，剥去残留的肌肉、脂肪和筋膜，用生理盐水冲洗去残留的杂质后称重；
步骤二、软骨粉的制备：经步骤一处理后的软骨轧成小块，高压蒸煮、去除油脂、干燥粉碎；
步骤三、脱脂处理：取一定量软骨粉加入脱脂剂，搅拌脱脂处理，直到脱脂完全后滤去脱脂剂；
步骤四、脱钙处理：经步骤三脱脂后，加入脱钙剂，搅拌脱钙处理，直到软骨变柔软透明状后滤去脱钙剂；
步骤五、除杂沉淀：在软骨中加入盐酸胍，搅拌处理，去除糖蛋白杂质，离心弃上清液，得沉淀物；
步骤六、胶原蛋白的制备：在沉淀物中加入醋酸胃蛋白酶消化后离心处理，取上清液加入氯化钠溶液，过夜盐析，离心得絮状白色沉淀物；
步骤七：测定胶原蛋白含量：采用Woessner法测定步骤六中絮状白色沉淀物的胶原蛋白含量，然后冷冻干燥；
步骤八：配制胶原蛋白液：将冷冻干燥后的胶原蛋白溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配成2mg/mL的胶原蛋白液；
步骤九：胶原蛋白多肽液半成品的制备：在步骤八配制的胶原蛋白液中加入碱性蛋白酶酶解，得酶解液；
步骤十：胶原蛋白多肽的制备：将酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，冷冻干燥。
在本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种较佳实施例中，所述步骤二具体为，将软骨轧成5x5cm的小块，放入杀菌锅内蒸煮1小时，蒸煮气压为0.1MPa，蒸煮温度为121℃，将软化后的软骨用清水洗去多余的油脂，放入干燥箱中以70℃的温度烘制5～6小时，烘制后用粉碎机粉碎成软骨粉。
在本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种较佳实施例中，所述步骤三中，软骨粉与脱脂剂的用料比为1：10，在25～30℃的温度下搅拌脱脂处理2天，所述脱脂剂由氯仿、甲醇、水按比例混合而成，所述氯仿、甲醇、水的质量分数比为1：2：0.8。
在发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种较佳实施例中，所述步骤四中，软骨粉与脱钙剂的用料比为1：10，在25～30℃的温度下搅拌脱钙处理2天，所述脱钙剂采用浓度为0.5mol/L的EDTA溶液。
在本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种较佳实施例中，所述步骤五中，盐酸胍采用的浓度为4mol/L，且按每克软骨加入10mL盐酸胍，在25℃的温度下搅拌处理2天后，在4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟。
在本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种较佳实施例中，所述步骤六具体为，醋酸胃蛋白酶以10倍于沉淀物的体积加入，并在4℃的温度下消化48小时，在4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟后，取上清液加入20％的氯化钠溶液，过夜盐析，再以在4℃、12000rpm的转速离心处理，得到絮状白色沉淀物。
在本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种较佳实施例中，所述步骤六中，所述醋酸胃蛋白酶的浓度为0.5mol/L，pH值为2.5～3.0，其包括100mg/100mL的胃蛋白酶和20mg/100mL的叠氮钠。
在本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种较佳实施例中，所述步骤九中，碱性蛋白酶的体积分数为1.2％，pH值为10.0，并在60～65℃的温度下酶解2小时。
在本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种较佳实施例中，所述步骤十具体为，将预处理过的SepHadex-G50装入层析柱，用经过超声脱气后的流速为0.9ml/min的超纯水洗脱压实，将酶解液经过过滤器后装入层析柱中以0.5ml/min的流速在室温下进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，冷冻干燥。
本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的有益效果是：
本制备工艺操作步骤简单方便，应用广泛，不仅可用于动物软骨，还可用于动物骨骼和其它组织，利用碱性蛋白酶将软骨胶原蛋白消化分解成多肽和氨基酸，其中多肽的分子量可达3000～20000Da，氨基酸的种类可达18种之多，总量可达40mg/100mL，提高了畜禽养殖附加值，其生成的产品可作为保健品，用于预防高血压预防与治疗骨关节炎和骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病、抗衰老和抗氧化等方面；
本制备工艺不仅很好的开发和利用了动物骨骼，增加了对动物副产物的开发价值和空间，而且深化和丰富了胶原蛋白和胶原蛋白肽提取的方法，为胶原蛋白多肽应用范围的研究奠定了理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种实施例的工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，是本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法的一种实施例的工艺流程图。
所述制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法S1包括如下步骤：
步骤S11、软骨预处理：将新鲜软骨剔除骨膜，剥去残留的肌肉、脂肪和筋膜，用生理盐水冲洗去残留的杂质后称重；
步骤S12、软骨粉的制备：经步骤一处理后的软骨轧成小块，高压蒸煮、去除油脂、干燥粉碎；
具体地，将软骨轧成5x5cm的小块，放入杀菌锅内蒸煮1小时，蒸煮气压为0.1MPa，蒸煮温度为121℃，将软化后的软骨用清水洗去多余的油脂，放入干燥箱中以70℃的温度烘制5～6小时，烘制后用粉碎机粉碎成软骨粉；
步骤S13、脱脂处理：取一定量软骨粉加入脱脂剂，搅拌脱脂处理，直到脱脂完全后滤去脱脂剂；
具体地，软骨粉与脱脂剂的用料比为1：10，在25～30℃的温度下搅拌脱脂处理2天，所述脱脂剂由氯仿、甲醇、水按比例混合而成，所述氯仿、甲醇、水的质量分数比为1：2：0.8；
步骤S14、脱钙处理：经步骤三脱脂后，加入脱钙剂，搅拌脱钙处理，直到软骨变柔软透明状后滤去脱钙剂；
具体地，软骨粉与脱钙剂的用料比为1：10，在25～30℃的温度下搅拌脱钙处理2天，所述脱钙剂采用浓度为0.5mol/L的EDTA溶液；
步骤S15、除杂沉淀：在软骨中加入盐酸胍，搅拌处理，去除糖蛋白杂质，离心弃上清液，得沉淀物；
具体地，盐酸胍采用的浓度为4mol/L，且按每克软骨加入10mL盐酸胍，在25℃的温度下搅拌处理2天后，在4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟；
步骤S16、胶原蛋白的制备：在沉淀物中加入醋酸胃蛋白酶消化后离心处理，取上清液加入氯化钠溶液，过夜盐析，离心得絮状白色沉淀物；
具体地，醋酸胃蛋白酶以10倍于沉淀物的体积加入，并在4℃的温度下消化48小时，在4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟后，取上清液加入20％的氯化钠溶液，过夜盐析，再以在4℃、12000rpm的转速离心处理，得到絮状白色沉淀物；
具体地，所述醋酸胃蛋白酶的浓度为0.5mol/L，pH值为2.5～3.0，其包括100mg/100mL的胃蛋白酶和20mg/100mL的叠氮钠；
步骤S17：测定胶原蛋白含量：采用Woessner法测定步骤六中絮状白色沉淀物的胶原蛋白含量，然后冷冻干燥；
步骤S18：配制胶原蛋白液：将冷冻干燥后的胶原蛋白溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配成2mg/mL的胶原蛋白液；
步骤S19：胶原蛋白多肽液半成品的制备：在步骤八配制的胶原蛋白液中加入碱性蛋白酶酶解，得酶解液；
具体地，碱性蛋白酶的体积分数为1.2％，pH值为10.0，并在60～65℃的温度下酶解2小时；
步骤S20：胶原蛋白多肽的制备：将酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，冷冻干燥；
具体地，将预处理过的SepHadex-G50装入层析柱，用经过超声脱气后的流速为0.9ml/min的超纯水洗脱压实，将酶解液经过过滤器后装入层析柱中以0.5ml/min的流速在室温下进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，冷冻干燥。
本发明提供的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法S1的有益效果是：
本制备工艺操作步骤简单方便，应用广泛，不仅可用于动物软骨，还可用于动物骨骼和其它组织，利用碱性蛋白酶将软骨胶原蛋白消化分解成多肽和氨基酸，其中多肽的分子量可达3000～20000Da，氨基酸的种类可达18种之多，总量可达40mg/100mL，提高了畜禽养殖附加值，其生成的产品可作为保健品，用于预防高血压预防与治疗骨关节炎和骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病、抗衰老和抗氧化等方面；
本制备工艺不仅很好的开发和利用了动物骨骼，增加了对动物副产物的开发价值和空间，而且深化和丰富了胶原蛋白和胶原蛋白肽提取的方法，为胶原蛋白多肽应用范围的研究奠定了理论基础。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (9)
1.一种制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、软骨预处理：将新鲜软骨剔除骨膜，剥去残留的肌肉、脂肪和筋膜，用生理盐水冲洗去残留的杂质后称重；
步骤二、软骨粉的制备：经步骤一处理后的软骨轧成小块，高压蒸煮、去除油脂、干燥粉碎；
步骤三、脱脂处理：取一定量软骨粉加入脱脂剂，搅拌脱脂处理，直到脱脂完全后滤去脱脂剂；
步骤四、脱钙处理：经步骤三脱脂后，加入脱钙剂，搅拌脱钙处理，直到软骨变柔软透明状后滤去脱钙剂；
步骤五、除杂沉淀：在软骨中加入盐酸胍，搅拌处理，去除糖蛋白杂质，离心弃上清液，得沉淀物；
步骤六、胶原蛋白的制备：在沉淀物中加入醋酸胃蛋白酶消化后离心处理，取上清液加入氯化钠溶液，过夜盐析，离心得絮状白色沉淀物；
步骤七：测定胶原蛋白含量：采用Woessner法测定步骤六中絮状白色沉淀物的胶原蛋白含量，然后冷冻干燥；
步骤八：配制胶原蛋白液：将冷冻干燥后的胶原蛋白溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配成2mg/mL的胶原蛋白液；
步骤九：胶原蛋白多肽液半成品的制备：在步骤八配制的胶原蛋白液中加入碱性蛋白酶酶解，得酶解液；
步骤十：胶原蛋白多肽的制备：将酶解液过滤后采用凝胶分离技术进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤二具体为，将软骨轧成5x5cm的小块，放入杀菌锅内蒸煮1小时，蒸煮气压为0.1MPa，蒸煮温度为121℃，将软化后的软骨用清水洗去多余的油脂，放入干燥箱中以70℃的温度烘制5～6小时，烘制后用粉碎机粉碎成软骨粉。
3.根据权利要求1所述的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤三中，软骨粉与脱脂剂的用料比为1：10，在25～30℃的温度下搅拌脱脂处理2天，所述脱脂剂由氯仿、甲醇、水按比例混合而成，所述氯仿、甲醇、水的质量分数比为1：2：0.8。
4.根据权利要求1所述的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤四中，软骨粉与脱钙剂的用料比为1：10，在25～30℃的温度下搅拌脱钙处理2天，所述脱钙剂采用浓度为0.5mol/L的EDTA溶液。
5.根据权利要求1所述的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤五中，盐酸胍采用的浓度为4mol/L，且按每克软骨加入10mL盐酸胍，在25℃的温度下搅拌处理2天后，在4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟。
6.根据权利要求1所述的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤六具体为，醋酸胃蛋白酶以10倍于沉淀物的体积加入，并在4℃的温度下消化48小时，在4℃、12000rpm的转速下离心处理30分钟后，取上清液加入20％的氯化钠溶液，过夜盐析，再以在4℃、12000rpm的转速离心处理，得到絮状白色沉淀物。
7.根据权利要求1或6所述的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤六中，所述醋酸胃蛋白酶的浓度为0.5mol/L，pH值为2.5～3.0，其包括100mg/100mL的胃蛋白酶和20mg/100mL的叠氮钠。
8.根据权利要求1所述的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤九中，碱性蛋白酶的体积分数为1.2％，pH值为10.0，并在60～65℃的温度下酶解2小时。
9.根据权利要求1所述的制备畜禽软骨胶原蛋白多肽的方法，其特征在于：所述步骤十具体为，将预处理过的SepHadex-G50装入层析柱，用经过超声脱气后的流速为0.9ml/min的超纯水洗脱压实，将酶解液经过过滤器后装入层析柱中以0.5ml/min的流速在室温下进行分离提纯，收集出现蛋白质峰的洗脱液，冷冻干燥。
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