CN106854232B

CN106854232B - 一种骨髓蛋白质的制备方法及其应用

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Publication number: CN106854232B
Application number: CN201710130682.1A
Authority: CN
Inventors: 阿布力米提·伊力; 阿吉艾克拜尔·艾萨; 帕尔哈提·柔孜
Original assignee: Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Current assignee: Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2037-03-07
Also published as: CN106854232A

Abstract

本发明涉及一种骨髓蛋白质的制备方法及其应用，该方法中的原料为牛、羊、马、骆驼或其它动物屠宰场的动物骨骼里面的新鲜骨髓，采用水清洗前处理之后的新鲜骨髓中的蛋白质分别利用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液和氯化钠溶液提取，其中的脂质成分由石油醚或正己烷萃取其没有脂质成分残留，其后水提取物部分浓缩、透析脱盐、再利用现代喷雾干燥技术或冷冻干燥精制而成的骨髓蛋白质。该骨髓蛋白质被验证其抗细菌和真菌活性，具有广泛的抗微生物活性，同时具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含人体易消化和吸收的纯天然来源蛋白质。既保留了骨髓蛋白质营养的同时还实现变废为宝和资源充分利用的目的；该骨髓蛋白质作为天然抗菌剂、食品添剂或药物，可用于食品和医药行业。

Description

一种骨髓蛋白质的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种骨髓蛋白质的制备方法及其应用，是利用新疆资源丰富的骨骼为原料制备的具有抗菌活性蛋白质，具有抗细菌、抗真菌等生物活性，在医药、食品领域具有很好的应用前景。

背景技术

畜牧业是新疆最具特色的传统产业，是新疆农业的重要组成部分，是新疆农业农村经济的支柱产业，也是各族人民赖以生存和发展的重要基础。新疆拥有可利用草场面积0.48亿hm²，占全国可利用天然草场总面积的23％；拥有耕地412.46万hm²，农作物饲草料资源丰富；各族群众具有从事畜牧业生产的悠久传统和丰富经验；具有发展现代畜牧业的良好资源条件和物质基础，是我国重要的良种畜和畜产品生产基地。

2009年我区畜牧业总产值达到318.37亿元，占农业产值的24.5％(受棉花等经济作物效益高的影响)，低于全国平均水平。主要畜产品产量快速增长，2009年畜产品总量达到305.15万t。肉类总产量达到115.4万t，占到畜产品总量的43.7％，肉类人均占有量居全国第17位，其中羊肉人均占有量居全国第3位，牛肉人均占有量居全国第3位。奶类产量125.24万t，占到畜产品总量的47.5％，人均占有量居全国第6位。蛋类产量23.2万t，占到畜产品总量的8.8％。禽肉产量8.1万t，占到畜产品总量的3.0％。反应出新疆羊肉、牛肉和奶业依然是畜产品中竞争力比较强的主要产品。

将新疆、内蒙古、西藏、青海、甘肃五大牧业省区主要畜产品产量数据经过计算取得相关比较参数，即可得到各省区主要畜产品竞争力的比较值。新疆主要畜产品竞争力(参数)由强到弱的排序为：羊肉(5.93176)—牛肉(2.12851)—奶类(1.76865)—禽肉(0.26783)—猪肉(0.23718)—禽蛋(0.12540)。

我国是个畜禽消费大国，但多集中于畜禽肉类的消费，大量的畜禽骨骼得不到充分利用，既浪费了这种营养成分丰富且比例合理的资源，又在骨处理的问题上污染了环境，造成一定的环境压力。

畜禽骨骼中蛋白质的利用方面，骨蛋白较为重要。骨中的蛋白质含量很高，且属较为全价的可溶性蛋白质，生物活性较高。我国的蛋白质资源一直比较紧张，这种资废弃物资源的开发利用对缓解蛋白资源短缺的有效途径。畜禽骨骼由骨膜，骨质，骨髓构成，是蛋白质和钙质组成的网状结构“再构成管状”管内充满了含多种营养物质的骨髓，如构成脑组织的磷脂及防止老化的骨胶原，软骨素等，鲜骨中含有蛋白质，脂肪，矿物质，如钙，磷，铁等，骨胶原，软骨素以及维生素等，尤其是的钙磷比非常接近人体钙吸收的最佳比例，是理想的天然钙源，

骨髓是动物器官中十分重要的一个部分，造血干细胞就由骨髓供应，俗话说骨髓补血，骨髓不仅味道好，营养价值确实不错。尤其是骨髓化到汤里后变白的汤最有营养，最香,是动物当中最有营养的动物的骨头中含有多种对人体有营养、滋补和保健功能的物质，具有添骨髓、增血液、减缓衰老、延年益寿的保健功效。

动物骨髓中富含有利于智力发育的磷脂质、磷蛋白等，骨头中含有丰富的钙质，都是很有营养的食物，一般人都可以食用，骨髓中脂肪含量较高，肥胖、高脂血症等病人不宜过多食用。骨头中的钙需要长时间的熬制，使钙质充分溶出，才容易被人体利用。

化学成份：牛髓每100g含水3g，蛋白质0.5g，脂肪95.8g，灰分0.3g，硫胺素微量，核黄素0.01mg，烟酸0.05mg。其脂肪酸含率如次：月桂酸0.1％，肉豆蔻酸2.6％，棕榈酸32.3％，硬脂酸15.5％，十四(碳)烯酸0.7％，十六(碳)烯酸3.0％，油酸43.2％，亚油酸2.6％，不皂化物0.5-0.6％。

我国的蛋白质资源紧张有重要意义，在骨蛋白的利用上，国外许多研究者致力于应用酶解技术：如采用猪的胃蛋白酶进行了酶解鸡头骨蛋白的研究，并测定了酶解物氨基酸成分含量，而国内的研究人员也做了不懈的工作，赵胜年等进行了酶法水解鲜牛骨的研究“采用胰酶进行水解反应”确定了最适酶解条件，何建军以小杂鱼和链鱼下脚料为原料“加酶分解蛋白质”并进行恒温发酵，研制了淡水鱼露周涛等运用木瓜蛋白酶酶解鲐鱼头骨等加工废弃物，并运用不同颗粒大小的活性炭对水解液进行脱色制得营养价值高水溶性好的蛋白水解物，余杰、陈美珍运用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对酶解鳗鱼头的最适工艺条件进行了详细研究，采用粉末状活性炭进行脱苦脱色，并研制出一种味道鲜美的高级海鲜风味调料王朝旭等，采用了胰蛋白酶对鲜猪骨进行了酶法水解的研究，赵霞、马丽珍介绍了酶解利用骨蛋白的主要工艺以及蛋白水解物的脱苦方法牛骨蛋白的水解研究过去多集中在纯酶生产上钟秋平等另辟蹊径，利用固体曲法结合低度盐稀醪对牛骨蛋白进行了水解，由于食盐的防腐作用，防止了水解液在水解过程中的腐败，通过研究确定了固体曲法水解牛骨蛋白的最佳方法也探索出一条能应用于工业化生产的最佳工艺途径，骨蛋白食品用于美容保健品，还可满足生长期儿童，恢复期病人老年人及高体能消耗的运动员等特殊人群的营养需求，王显伦杨桂苹"等分别进行了骨蛋白水解研究，测定了水解液中的氨基酸含量，李泰等人开发了骨参饮料这一动植物蛋白复合的营养型饮料用畜禽骨生产小肽为了更好的利用骨蛋白，研究者的研究方向为蛋白水解物多肽，研究表明，多肽类食品比蛋白质类食品具有更为优越的理化特性，营养特性和功能特性，将蛋白质水解为多肽，其意义不仅在于提高蛋白质类食品的价值，而且使一些从前难以开发的蛋白质资源以多肽类食品的形式得以利用，白恩侠，张卫柱进行了动物骨生产水肽的工艺研究，利用牛骨为原料，采用温和的提取，水解方法，在保持其原有效成分的同时，对其所含蛋白质制备成小肽的工艺进行研究，采用高压蒸煮及酶水解方法来制备易被人吸收的小肽及氨基酸#用毛皮动物骨及禽类骨时只需将水解条件进行试验调整即可对畜禽骨资源的开发利用具有普遍意义。

对于新疆这样的畜牧大区来说这个方面的研究领处于空白，这不仅浪费了宝贵的资源，因此本发明在已有的工作基础上对于新疆骨髓中活性多肽进行了系统的提取分离和活性评价研究，通过几十种提取方法的比较总结出了三种得率高、高纯度和具有广泛抗微生物活性的方法，并保证多肽的本性，提取率高，成本低的制备方法，为新疆骨髓资源的充分利用和提供附加值了提供了科学依据。

发明内容

本发明目的在于，提供一种骨髓蛋白质的制备方法及其应用，该方法中的原料为动物屠宰后骨骼中的骨髓，采用缓冲液或无机盐溶剂提取，将处理之后的新鲜骨髓蛋白质分别利用缓冲液三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液Tris–HCl(0.1mol/L,8.4)和氯化钠溶液搅拌提取，其中的脂质成分由石油醚或正己烷脱脂，其后水提取物部分浓缩、透析脱盐、再利用冷冻干燥精制而成的骨髓蛋白质。该骨髓蛋白质被验证其抗细菌和真菌活性，具有广泛的抗微生物活性，同时具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含人体易消化和吸收的纯天然来源多肽。该多肽既保留了骨髓蛋白质营养的同时还实现变废为宝和资源充分利用的目的；该骨髓多肽粉作为天然抗菌剂、食品添剂或药物，可用于食品和医药行业。

本发明所述的一种骨髓蛋白质的制备方法，该方法中的原料为动物屠宰后骨骼中的骨髓，采用缓冲液或无机盐溶剂提取，具体操作按下列步骤进行：

缓冲液提取：

a、取新鲜骨髓，清洗3次，去掉骨头和血迹，切成小块，按重量比为1∶5加入液氮粉碎，反复粉碎3-4次，得到骨髓粉碎粉，低温冰箱保存备用；

b、取将步骤a中得到骨髓粉碎粉100g，加入重量比为1:10的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液0.1mol/L，pH＝8.4，在温度40℃条件下置集约式恒温加热磁力搅拌机上回流反复提取2-3次至未见沉淀物为止，得到总提取液；

c、将步骤b得到的总提取按料液比为1:6的石油醚或正己烷脱脂，反复2-3次，收集下层提取液；

d、将步骤c得到的下层提取液在12000转/分，温度4℃离心10min，取上清液，得到骨髓蛋白质粗提液；

e、将步骤d中得到的蛋白质粗提液，浓缩至2-5倍，并利用1000Da透析带在蒸馏水循环透析24-48小时；

f、将步骤e中透析后的多肽提取液，用硫酸铵饱和溶液沉淀，先用浓度为30％饱和硫酸铵沉淀，再依次用浓度为60％-90％饱和硫酸铵沉淀，温度4℃，过夜，离心，透析48h，喷雾干燥或冷冻干燥，即得到1.14g骨髓蛋白质；

无机盐溶剂提取：

b、取步骤a中3等份100g的已粉碎好骨髓样品，每份样品中按料液比为1:5，分别加入质量分数为0.5％、2.5％和5％的氯化钠溶液提取，在温度40℃下置集约式恒温加热磁力搅拌机上回流反复提取2-3次至未平底下未见沉淀物为止，回流时间为3-4h，将提取液过滤，未过滤部分再加氯化钠溶液提取，过滤，合并滤液；

c、将步骤b得到的合并滤液用料液比为1:4石油醚或正己烷脱脂，反复2-3次，收集下层提取液；

d、将步骤c中下层液体12000转/分下，温度4℃，离心10min，取上清液，得到骨髓蛋白质粗提取液；

e、将步骤d中得到的蛋白质粗提取液，浓缩至5/10-2/10倍，并利用1000Da透析带在蒸馏水循环透析48-72小时，冷冻干燥，得到骨髓蛋白质，分别为0.5％氯化钠1.1g、2.5％氯化钠0.925g和5％氯化钠0.52g。

附图说明

图1为本发明提取工艺流程图；

图2为本发明BCA法测定骨髓蛋白质浓度的标准曲线，其中方程式为：y＝197.34x2+432.11x-110.2，相关系数为0.9991；

图3为本发明骨髓蛋白质浓度测定结果对比图，其中系列1为不同饱和度硫酸沉淀的多肽，从左到右依次为30％硫酸铵沉淀部位、60％硫酸铵沉淀部位、90％硫酸沉淀部位；其中系列2为不同浓度氯化钠提取的骨髓蛋白质，从左到右依次为0.5％氯化钠部分，2.5％氯化钠部分，5％氯化钠部分；

图4为本发明骨髓蛋白质得率与纯度结果对比图，其中系列1为不同饱和度硫酸沉淀的多肽，从左到右依次为30％硫酸铵沉淀部位、60％硫酸铵沉淀部位、90％硫酸沉淀部位；其中系列2为不同浓度氯化钠提取的骨髓蛋白质，从左到右依次为0.5％氯化钠部分，2.5％氯化钠部分，5％氯化钠部分；

图5为本发明十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；-考马斯亮蓝染色图，其中1为30％硫酸铵沉淀部位，2为60％硫酸铵沉淀部位；3为90％硫酸沉淀部位；4为0.5％氯化钠部分，5为2.5％氯化钠部分；6为5％氯化钠部分；

图6为本发明提取的六种蛋白质抑菌活性和平板抑菌圈尺对比图，其中1为30％硫酸铵沉淀部位，2为60％硫酸铵沉淀部位；3为90％硫酸沉淀部位；4为0.5％氯化钠部分，5为2.5％氯化钠部分；6为5％氯化钠部分。

具体实施方式：

实施例1

缓冲液提取：

a、取新鲜骨髓，清洗3次，去掉骨头和血迹，切成小块，按重量比为1∶5加入液氮粉碎，反复粉碎3次，得到骨髓粉碎粉，低温冰箱保存备用；

b、取将步骤a中得到骨髓粉碎粉100g，加入重量比为1:10的三羟甲基氨基甲烷盐酸0.1mol/L，pH＝8.4缓冲溶液，在温度40℃条件下置集约式恒温加热磁力搅拌机上回流反复提取2次至未见沉淀物为止，得到总提取液；

c、将步骤b得到的总提取按料液比为1:6的石油醚脱脂，反复2-3次，收集下层提取液；

e、将步骤d中得到的蛋白质粗提液，浓缩至2倍，并利用1000Da透析带在蒸馏水循环透析24小时；

f、将步骤e中透析后的多肽提取液，用硫酸铵饱和溶液沉淀，先用浓度为30％饱和硫酸铵沉淀，再依次用浓度为60％和90％饱和硫酸铵沉淀，温度4℃，过夜，离心，透析48h，喷雾干燥或冷冻干燥，即得到1.14g骨髓蛋白质，总提取率为57％。

实施例2

无机盐溶剂提取：

b、取步骤a中3等份100g的已粉碎好骨髓样品，每份样品中按料液比为1:5，分别加入质量分数为0.5％、2.5％和5％的氯化钠溶液提取，在温度40℃下置集约式恒温加热磁力搅拌机上回流反复提取2次至未平底下未见沉淀物为止，回流时间为3h，将提取液过滤，未过滤部分再加氯化钠溶液提取，过滤，合并滤液；

c、将步骤b得到的合并滤液用料液比为1:4石油醚脱脂，反复2-3次，收集下层提取液；

d、将步骤c中下层液体12000转/分下，温度4℃，离心10min，取上清液，得到骨髓蛋白质粗提液；

e、将步骤d中得到的蛋白质粗提液，浓缩至5/10倍，并利用1000Da透析带在蒸馏水循环透析48小时，冷冻干燥，得到骨髓蛋白质，分别为0.5％氯化钠1.1g、2.5％氯化钠0.925g和5％氯化钠0.52g，总提取率为分别为57％，46.25％，26％

实施例3

缓冲液提取：

a、取新鲜骨髓，清洗3次，去掉骨头和血迹，切成小块，按重量比为1∶5加入液氮粉碎，反复粉碎4次，得到骨髓粉碎粉，低温冰箱保存备用；

b、取将步骤a中得到骨髓粉碎粉100g加入重量比为1:10三羟甲基氨基甲烷盐酸，0.1mol/L，pH＝8.4缓冲溶液，在温度40℃条件下置集约式恒温加热磁力搅拌机上回流反复提取3次至未见沉淀物为止，得到总提取液；

c、将步骤b得到的总提取按料液比为1:6的正己烷脱脂，反复2-3次，收集下层提取液；

e、将步骤d中得到的蛋白质粗提液，浓缩至5倍，并利用1000Da透析带在蒸馏水循环透析48小时；

f、将步骤e中透析后的多肽提取液，用硫酸铵饱和溶液沉淀，先用浓度为30％饱和硫酸铵沉淀，再依次用浓度为60％和90％饱和硫酸铵沉淀，温度4℃，过夜，离心，透析48h，喷雾干燥或冷冻干燥，即得到1.14g骨髓蛋白质。

实施例4

无机盐溶剂提取：

b、取步骤a中3等份100g的已粉碎好骨髓样品，每份样品中按料液比为1:5，分别加入质量分数为0.5％、2.5％和5％的氯化钠溶液提取，在温度40℃下置集约式恒温加热磁力搅拌机上回流反复提取2次至未平底下未见沉淀物为止，回流时间为4h，将提取液过滤，未过滤部分再加氯化钠溶液提取，过滤，合并滤液；

e、将步骤d中得到的蛋白质粗提液，浓缩至2/10倍，并利用1000Da透析带在蒸馏水循环透析72小时，冷冻干燥，得到骨髓多肽，分别为0.5％氯化钠1.1g、2.5％氯化钠0.925g和5％氯化钠0.52g。

实施例5：

骨髓蛋白质浓度的测定：

利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定实施1-4所得骨髓蛋白质浓度：

标准曲线的绘制：根据BCA蛋白测量试剂盒说明书操作配制工作液，每50倍体积的BCA试剂A溶液加1倍体积的BCA试剂B溶液，充分混匀备用，根据表1吸取试剂盒中蛋白标准品牛血清蛋白，用水稀释，摇匀，各管分别取25μL于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，轻微振荡，混匀，于温度37℃恒温箱中温育30min，取出96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长为562nm，每个做三组平行，以吸光度为纵坐标，多肽浓度为横坐标进行回归运算；

表1系列稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品

样品的测定：

精确称取2.5mg样品，加入1mL蒸馏水溶解，10000转/分离心2min，按照标准曲线操作方法，取25μL样品溶液于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，轻微振荡，混匀，于温度37℃恒温箱中温育30min，取出96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长为562nm，每个样品做三组平行；按照标准曲线计算蛋白质的含量。

实验结果：

由图2及表2可知，利用液氮研磨处理后Tris-盐酸提取，其中50％硫酸铵沉淀蛋白质浓度可达1856μg/mL，占提取物的52.36％；2.5％氯化钠提取蛋白质浓度1944μg/mL，占提取物的57.40％。

表2有效成分及蛋白质提取率

实施例6

蛋白质种类的确定：

试剂配制及样品处理：

样品缓冲液：0.5mL的0.5moL/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液(pH＝6.8)、2mL的10％十二烷基硫酸钠、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；

样品的处理：精密称取样品3mg溶于1mL蒸馏水中，摇匀，与样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10min，10000转/分，离心5min；

电极缓冲液：将15.1g三羟甲基氨基甲烷94g甘氨酸、50mL的10％十二烷基硫酸钠溶解并定容至4L；

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液：30％(W/V)超纯级丙烯酰胺、0.8％(W/V)N,N-亚甲双丙烯酰胺；

10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶配制：2.3mL的H₂O、5mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、2.5mL的1.5moL/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶(pH＝8.8)、0.1mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠、0.1mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.004mL的四甲基乙二胺；5％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶配制：3.4mL的H₂O、0.83mL的30％(V/V)

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液、0.63mL的1.5moL/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液(pH＝8.8)、0.05mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠、0.05mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.005mL的四甲基乙二胺；

电泳条件：恒压75伏，30min，然后恒压150伏，90min；

考马斯亮蓝固定液：25％异丙醇、10％的冰醋酸、65％水；

考马斯亮蓝染色液：将0.6g的考马斯亮蓝R-250溶解在300mL的固定液中，过滤，棕色瓶储存；

考马斯亮蓝脱色液：5％甲醇、7％的冰醋酸、88％水；

电泳结束后将凝胶片置于固定液中固定2h，然后放入考马斯亮蓝染色液中，置于摇床上染色2h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止。

实验结果：

由图3中可以看出，三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液提取并用不同饱和度硫酸铵沉淀中，30％硫酸按饱和部位出现了6.5KD以下的多肽条带，又出现4.1KD以下多肽条带，一般用有机或者其他缓冲溶液提取原生多肽是罕见的，这可能由于三羟甲基氨基甲烷缓冲液被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，很高的缓冲能力，在水中溶解度高,对很多酶反应是惰性的,使三羟甲基氨基甲烷成为用于许多生化目的非常满意的缓冲液.一般用于稳定反应体系的pH，在pH7.5-9.0之间有较强的缓冲能力，这个实验中本发明采用是0.1mol/L，pH＝8，三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液，硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质.用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质，故本发明采用3种不同的饱和度溶液分别处理多肽。60％硫酸铵沉淀部位的多肽分子量在9.5KD左右，因本身蛋白含量高，故条带较粗一些。90％硫酸铵沉淀部位沉淀部位条带也66KD和9.5KD处出现。

由图3中可以看出，氯化钠是骨髓蛋白、多肽提取有效的溶剂之一，其中0.5％氯化钠提取部分在4.1KD-6.5KD处，9.5KD-14.4KD处有多肽和蛋白条带，还有66KD处也出现相应的条带，说明0.5％氯化钠是提取骨髓小分子量多肽的有效方法之一；2.5％氯化钠部位蛋白含量高，未出现多肽条带；5％氯化钠部位在9.5KD-14.4KD处，66KD上下部位出现明显的条带，说明浓度高低会影响蛋白质提取率和条带出现位置。

实施例7

融化琼脂培养基，待其温度降至46±0.5℃，加入已培养好的菌液，使试验菌悬液浓度为5×105cfu/ml-5×106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20mine使其凝固；

用琼脂打孔器打孔，直径为5-6mm，4-5孔/皿，均匀分布，各样片中心之间相距25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上；

样品浓度为100mg/ml(100mM)；每孔加样品溶液20μl，盖好平皿，置于温度37℃培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养16h-18h，用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录；

评价：

(1)抑菌作用的判断：

抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用；

抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用；

试验结果：

由表3和图4、图5中可以看出两种提取方法所得的六种蛋白质对白色念球菌具有不同程度的抑菌活性，可大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有抑制活性，故没列表和放相关图片。其中2.5％氯化钠部位抑菌活性最强，可达10；这与蛋白质含量高低也有一定的剂量关系。

表3两种法提取蛋白质抗菌效果对比图

当抑制区直径≤7mm时，认为样品没有效果抗菌(水肿)：白色念珠菌ATCC10231；大肠杆菌ATCC11229；金黄色葡萄球菌ATCC6538。

Claims

1.一种骨髓蛋白质的制备方法，其特征在于该方法中的原料为动物屠宰后骨骼中的骨髓，采用无机盐溶剂提取，具体操作按下列步骤进行：

无机盐溶剂提取：

b、取步骤a中100g的已粉碎好骨髓样品，每份样品中按料液比为1:5，加入氯化钠溶液提取，在温度40℃下置集约式恒温加热磁力搅拌机上回流反复提取2-3次至未平底下未见沉淀物为止，回流时间为3-4h，将提取液过滤，未过滤部分再加氯化钠溶液提取，过滤，合并滤液，其中所述氯化钠溶液的质量分数为0.5%、2.5%或5%；

d、将步骤c中下层液体12000转/分下，温度4℃，离心10min，取上清液，得到骨髓多蛋白质提取液；

e、将步骤d中得到的蛋白质粗提取液，浓缩至5/10-2/10倍，并利用1000Da透析带在蒸馏水循环透析48-72小时，冷冻干燥，得到骨髓蛋白质。

2.如权利要求1所述方法获得的骨髓蛋白质在制备抗白色念球菌生物活性的药物中的用途。

3.如权利要求1所述方法获得的骨髓蛋白质在制备食品添加剂中的用途。