CN110759964A - 一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法 - Google Patents
一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法，该方法首先对蛋白提取工艺参数进行合理的筛选和确定，其次通过响应面优化法对蛋白提取液进行超滤膜分离，该方法得到的蛋白含量高达76.9 mg/mL，分离所得部位进一步用离子交换树脂纯化，并用红外光谱、扫描电子显微镜、二维电泳技术及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等对多肽进行结构表征和肽序列的鉴定，共鉴定出20种活性肽段序列，其中抗氧化肽10种、抗菌肽7种、降压肽3种。本发明所述的方法具有提取时间短、操作简单、鉴定技术可靠、效率高等优势，易于工业化生产，且为来源于动物骨髓的抗菌、抗氧化、降压等活性多肽的开发及综合利用提供基础参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法，属于天然 活性多肽成分提取分离技术领域。
技术背景
动物类中药是中国传统药学的重要组成部分，动物骨质和骨髓作为珍贵药物，具有很好 的疗效。同时作为肉类加工副产物，资源储藏量丰富，是一种营养丰富的天然药食资源，但 综合开发利用程度较低。
瑞典、美国、前苏联、丹麦、英国、日本等技术发达国家早已开始对畜禽骨和鱼类骨骼 产品的开发，主要的加工方法有将骨骼加工成骨泥、从骨骼中提取胶原蛋白、从动物软骨组 织中提取硫酸软骨素等生物活性成分。国内也有以畜禽骨骼为原料制备的多肽或制成的促进 骨折愈合的骨肽注射液，以及预防骨质疏松、治疗腰椎间盘突出症、关节炎、风湿、骨折等 疾病的复方骨肽、骨肽片等药物陆续上市，但骨髓相关的基础研究依然集中在骨髓移植和相 关疾病的治疗方面。我国虽拥有丰富的畜禽骨资源，但长期以来，因对其食药功能成分和活 性研究不足，除少数加热熬汤和制作骨胶外，一般加工成骨糊、骨粉等作为饲料添加剂，而 在资源向“动物生化药物”转化利用方面研究较少。这些方法和应用忽视其综合营养价值， 造成了骨营养成分和资源的大量浪费，而且带来了环境污染。食药加工业通常使用全骨，未 能将骨质和骨髓有效地分离，并且动物骨髓有效成分的针对性研究鲜见，消费者对骨骼食药 功能的认识程度普遍较低，充分利用这废弃资源是十分重要的课题，因此提高骨髓资源综合 效益，具有广阔的应用前景。
一般动物的骨骼重量占体重的20％-30％左右，可利用度相当可观。牛骨的重量约占体重 的20.5％-25％，其中骨髓占鲜骨的4％-7％，拥有丰富的鲜骨和蛋白资源。前人做了一些研究， 但他们一般采用高压蒸煮、水煮等方法进行提取，且均未将骨质和骨髓分开研究，也未对提 取的蛋白与多肽进行电泳和分子量分析；同时高温条件可能会破坏蛋白质和某些必需氨基酸 结构，使多肽失去具有生物活性的空间结构，因此，本发明进一步分离纯化和鉴定具有生物 活性的短肽端，从提取条件、耗材等因素考虑，筛选最适合于工业化生产，具有一定的推广 应用潜力的方法并鉴定活性多肽类型和序列，对开发资源提供基础参考。
超滤作为绿色的分离，浓缩技术，是一种利用加压膜分离和压力差，即在一定压力下， 使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的滤膜，而且截留大分子溶质，从而使溶液中不同分子量 的物质得到分级分离。超滤技术因其具有操作方便、无相变、效率高、成本低等优点，已被 广泛应用于蛋白肽(如大豆肽、乳蛋白多肽、盐水腌鲱鱼多肽等)的分级分离，既可以分离 不同相对分子质量的多肽，又有利于保持多肽的生物活性。目前，国内对动物骨髓利用超滤 膜回收中蛋白质资源研究不多，因此建立高效、低成本、绿色的回收蛋白质的方法具有重要 的意义。
膜分离是一种利用天然或人工合成的，具有选择透过性的高分子薄膜，借助不同的推动 力，在膜的两相之间进行传质，以达到不同组分的分离、分级、提纯和浓缩的技术。本专利 以牛骨髓为原料，采用盐提法来提取骨髓蛋白。之前研究者研究主要集中在有机溶剂和酶解 法或者直接水煮来提取骨髓蛋白，存在提取条件繁琐、成本高、周期长等缺点。盐提法可以 实现大量生产，并用超滤膜移除小分子盐类，能解除透析等程序。
骨骼含有大量蛋白、油脂、矿物质成分，这些成分与其生物活性有着密切的关系。因此， 如何才能有效利用该资源，开发其营养成分是肉类加工企业和研发人员亟待解决的热点之一。 通过采用合适的蛋白酶种使胶原蛋白酶解成低分子量的胶原多肽和氨基酸。胶原多肽具有多 样的生物活性，包括抗氧化、抗菌、降血压等，它能够展现出胶原蛋白原本拥有的多种性能。 骨胶原，骨胶原蛋白肽等产品利用全骨，未将骨质和骨髓分开，为了提高骨头胶原蛋白水溶 性，需要加酶的提高溶出效果。因为这些产品使用原料，一般很少对蛋白、肽类活性成分开 展追踪研究，导致产品档次不高，关注力不够等，因此需要水解度较好的骨髓作为原料通过 现代制备技术对其中的有效成分富集很有必要，这为开发骨骼蛋白、蛋白螯合钙、高级脂肪 酸等高钙、高营养、高附加值的产品，为实现畜禽骨骼转化增值等提供新的途径，为原料综 合利用提供理论支撑。
生物体中的蛋白质作为复杂混合物形式存在的生物大分子聚合物，种类数上千。蛋白质 的分离纯化方法有很多，但是对于任何一种蛋白质都需要选择适当的分离提纯方法来获得高 纯度的蛋白质样品。目前常用的分离纯化方法有：萃取法(不同浓度乙醇，不同比例丙酮等)、 硫酸铵盐析法、膜分离(超滤)、离子交换柱层析法、凝胶过滤柱层析法、凝胶电泳法、毛细 管电泳法、高效液相色谱分析法等。
蛋白质及多肽的序列组成和结构分析方法
从自然界中分离纯化的多肽类物质，还需要进一步分析鉴定氨基酸组成结构以及生化特 性。常用的研究方法有以下几种：①等电点测序；②基质辅助激光解吸质谱法；③酶解法、 化学降解法④现代仪器分析方法，包括：快原子轰击质谱、串联质谱、电喷雾质谱、离子 喷雾质谱、等离子体解吸质谱以及核磁共振、傅立叶变换外光谱、圆二色谱等。
综上所述，目前活性多肽制备方法较多，但其中超滤膜法操作简单、无相变、无污染， 能够最大限度保持分离部位原有活性；多肽鉴定方面质谱和其他检测技术的联合使用对快速 检测和鉴定带来了极大的便利。因此以废弃物牛骨髓为原料，与现代提取分离、鉴定和合成 相结合进行综合开发应用，可变废为宝，将保证资源的可持续利用和新资源的开发，尤其是 动物类药材质量标准的建立，含动物骨髓类食品、保健品的产业化开发极为重要，因此寻找 一种能快速、有效分离牛骨髓活性多肽方法及其肽序列鉴定方法具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于，为了解决现有技术和对动物来源活性物质认识中存在的客观问题，本 发明提供了一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法。该方法首先对 蛋白提取工艺参数进行合理的筛选和确定，其次通过响应面优化法对蛋白提取液进行超滤膜 分离，该方法得到的蛋白含量高达76.9mg/mL，分离所得部位进一步用离子交换树脂纯化， 并用红外光谱、扫描电子显微镜、二维电泳技术及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等对 多肽进行结构表征和肽序列的鉴定，共鉴定出20种活性肽段序列，其中抗氧化肽10种、抗 菌肽7种、降压肽3种。本发明所述的方法具有提取时间短、操作简单、鉴定技术可靠、效 率高等优势，易于工业化生产，且为来源于动物骨髓的抗菌、抗氧化、降压等活性多肽的开 发及综合利用提供基础参考。
本发明所述的一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法，该方法 以氯化钠为提取溶剂，通过响应面法优化超滤膜分离工艺，对所得蛋白进行结构表征及肽序 列鉴定，并鉴定出20种活性多肽序列，具体操作包括以下步骤：
a、取新鲜牛骨髓粉末，加入浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，加热搅拌提取，提取温度 为45℃，提取时间2小时，提取次数为2次，用分液漏斗分离油水层，水层按体积比1:5加入石油醚进行脱脂，过滤，得到牛骨髓蛋白提取液，提取率和蛋白含量分别为55.3％，56.7mg/mL；
b、将步骤a制备的蛋白提取液进行响应面优化超滤膜分离，利用Design Expert8.0.6 软件进行Box-Behnken设计，截留膜分子量大小为10kDa，压力为0.22Pa，浓缩倍数为5， 温度为40℃时蛋白含量和膜通量分别为76.29％，25.29L/h.m2；
c、将步骤b制备的蛋白进行红外光谱、扫描电子显微镜、二维电泳技术分离及基质辅助 激光解吸电离飞行时间质谱综合分析，表征其结构，鉴定出20种活性肽段，其中抗氧化肽 10种、抗菌肽7种、降压肽3种。
所述的方法获得的肽序列对动物骨髓来源食品和保健品开发中的用途。
本发明所述的一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法，采用了 蛋白含量、提取率、分子量分布、抗菌活性为导向的提取分离和鉴定方法，提高了提取分离 过程的准确性和所鉴定的活性多肽序列的可靠性；整个提取和分离过程中操作温度始终控制 在45℃以下，保证多肽的原有活性；本发明是在前期申请的发明专利201710130574.4一种 骨髓蛋白质和多肽的超滤膜制备方法及其应用的基础上，以氯化钠为提取溶剂，并结合响应 面法优化膜分离工艺，蛋白含量和膜通量达最高值，分别高达76.29％，25.29L/h.m2，能有 效分离牛骨髓蛋白与多肽；而前期申请的发明专利是以水作为溶剂进行提取，经膜分离纯化 后10KDa截留部分和透过部分提取率仅为38.1％及12.3％。通过本发明所述方法以氯化钠为 提取溶剂，再结合响应面优化法可以大幅度提高牛骨髓蛋白提取率。除此，本发明首次采用 现代仪器分析技术对所得蛋白进行结构表征和活性多肽的鉴定工作，对牛骨髓多肽产业化生 产和医药保健功能开发提供科学参考。
本发明采用基于响应面优化制备方法分离得到的牛骨髓多肽，其蛋白质和多肽部位分离 度较好、生物活性强，且提取方法简单可行，提取全程在低温环境下操作，更好的保留了牛 骨髓原生多肽的活性成分。同时，首次对牛骨髓蛋白活性多肽序列进行鉴定，并筛选出了20 种活性肽序列，其中抗氧化肽10种(GKFICNECR、LPGGLTDNLGNLK、LPGGLTDNLGNLKNLMK、 QEIMNLKEEQNK、QTKEEVTSPPAEGVYIY、IEELEEEIEAER、QEIMNLKEEQNK、QTKEEVTSPPAEGVYIYG、 IEELEEEIEAER、ETDGLKQEIMNLK、DSGRDYVAQFEASALGK、HPEYAVSVLLRLAK)；抗菌肽7种 (MDDDIAALVVDNGSGMC、FFAMEFVKYYK、TFSKISTLTLHQR、MSSPPSSMAAGSTSPPS、 WPVAPKEITVEDSFVHPA、EGCTVSPETISLNVK、SFYPMLRYTNGPPPT)；降压肽3种(GFTPVVDDPVTER、 LLDAPGIVPGPNSEVGTIL、VKAEGLLDVFQAVK)，这对作为生化制药和含骨髓类保健品的研制提供 制备原料，并在作为新型药物先导化合物的重要材料方面具有潜在的开发应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例2中四个单因素试验对牛骨髓蛋白含量与提取率的影响，图中A为 NaCl浓度对骨髓蛋白提取率与含量的影响、B为提取次数对骨髓蛋白提取率与含量的影响、C 为提取温度对骨髓蛋白提取率与含量的影响、D为提取时间对骨髓蛋白提取率与含量的影响。
图2为本发明实施例3中四个单因素试验对超滤膜膜通量的影响，分别为A为截留分子 量大小对膜通量的影响、B为压力对膜通量的影响、C为浓缩倍数对膜通量的影响、D为温度 对膜通量的影响。
图3为本发明超滤膜响应面设计等高线图，图中A为压力、B为浓缩倍数、C为温度。
图4为本发明各分离部位蛋白电泳图，图中M为Marker，1为0.5mol/LNaCl提取部位、2为10kDa透过部分、3为10kDa截留部分、4为3kDa截留部分、5为3kDa透过部 分、6为1kDa截留部分、7为1kDa透过部分。
图5为本发明扫描电镜(SEM)图，其中A为10kDa截留部分图；
图6为本发明扫描电镜(SEM)图，其中B为10kDa透过部分图；
图7为本发明扫描电镜(SEM)图，其中C为3kDa透过部分图；
图8为各分离部位的傅里叶红外光谱(FT-IR)图谱，图中A为10kDa截留部位、B为10kDa透过部位、C为3kDa透过部位、D为1kDa截留部位；
图9为各分离部位蛋白双向电泳(2D)图谱,图中A为牛骨髓蛋白粉末双向电泳图谱、 B为0.5mol/L NaCl提取蛋白双向电泳图谱、C为牛骨髓蛋白超滤膜纯化部位双向电泳图谱 (10kDa透过部位)、D为牛骨髓蛋白Sephadex-G 25纯化部位双向电泳图谱(10kDa透过部位)。
具体实施方式
实施例1(对比)
a、牛骨髓粉末中加入氯化钠溶液进行加热搅拌提取，提取液用石油醚脱脂，得到蛋白提 取液，计算蛋白含量和提取率；
b、以蛋白含量和提取率为指标，对步骤a中的氯化钠浓度0.25mol/L，0.5mol/L，0.75 mol/L，1mol/L，提取次数1次，2次，3次，4次，提取温度35℃，40℃，45℃，50℃，提 取时间1h，2h，3h，4h，及提取次数进行单因素试验；在最佳水平基础上进行三因素三 水平正交试验设计，氯化钠浓度为0.5mol/L，提取温度为45℃，提取时间2小时，提取次 数为2次时提取率和蛋白含量达到最高值，分别为55.3％，56.7mg/mL；
表1正交实验结果与分析
表2蛋白提取率方差分析
注：F 0.05(2，2)＝19.00
表3蛋白含量方差分析表
注：F 0.05(2，2)＝19.00；
由表1-3可知，各提取因素对蛋白提取率的影响顺序为A>C>D>B，即：NaCl浓度>提取温 度>提取次数>提取时间，方差分析结果表明因素A、C对骨髓蛋白提取效果的影响具有显著性 差异。各因素对蛋白含量的影响顺序为A>C>B>D，即：NaCl浓度>提取温度>提取时间>提取次 数，方差分析表明其中A与C显著性差异较大；对蛋白提取率效果最佳工艺条件为A2B1C3D3， 即：0.5mol/L NaCl、提取次数2次、温度为50℃、提取时间为3h；蛋白含量最佳条件为 A2B1C2D1，即：0.5mol/L NaCl、提取次数2次、温度45℃、提取时间为2h。对两种考察指标具有显著性差异的因素是NaCl浓度和提取温度，两种考察下NaCl浓度均为0.5mol/L， 提取次数为2次时蛋白含量和提取率最高。综合考虑实际生产中的时间和成本等因素，最佳条件改为A2B2C2D3。按优选工艺进行3次验证实验，蛋白平均提取率55.3％(RSD 1.5％)，蛋白 含量56.7mg/mL(RSD 0.7％)。
实施例2
a、取新鲜牛骨髓粉末，加入浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，加热搅拌提取，提取温度 为45℃，提取时间2小时，提取次数为2次，用分液漏斗分离油水层，水层按体积比1:5加入石油醚进行脱脂，过滤，得到牛骨髓蛋白提取液，提取率和蛋白含量分别为55.3％，56.7mg/mL；
b、将步骤a制备的蛋白提取液进行响应面优化超滤膜分离，利用Design Expert8.0.6 软件进行Box-Behnken设计，截留膜分子量大小为10kDa，压力为0.22Pa，浓缩倍数为5， 温度为40℃时蛋白含量和膜通量达最高值，对数据进行多元二次方程为Y＝+24.87+1.22 A-0.29B+1.19C+0.78AB+0.38AC-1.40BC-2.03A2-3.71B2-1.36C2，其中A表示压力，B表示浓缩倍数，C表示温度，Y为膜通量，通过三次验证试验得到蛋白含量和膜通量分别为76.29％，25.29L/h.m2见表5，对牛骨髓蛋白与多肽的有效分离；
c、将步骤b制备的蛋白进行红外光谱、扫描电子显微镜、二维电泳技术分离及基质辅助 激光解吸电离飞行时间质谱综合分析，表征其结构，鉴定出20种活性肽段，其中抗氧化肽 10种、抗菌肽7种、降压肽3种；
表4响应面优化试验水平表
实验结果：
如图2所示，A为截留分子量对膜通量的影响，随着超滤膜截留量的增大，膜通量随着 增大；随着超滤时间的延长，膜通量呈现先快后慢的下降趋势，到一定时间时，膜截留分子 量越小，膜通量降低的越快，可见，膜的孔径大小是影响超滤工艺的重要因素之一，考虑到 实际生产需求和渗透量，低分子量膜对后续生产带来困难，因此，选择10 000Da超滤膜；B 为操作压力对膜通量的影响，前40min之内，压力越高，膜通量越大；如若压力过低，推动力小，导致小分子多肽和盐溶液易于被膜截留住，未能起到分离作用，当压力增大至0.24MPa 时，推动力过大，导致大分子量的蛋白质随着透过，造成损失，当蛋白水解液中的大分子溶 质在膜表面吸附积聚达到饱和后形成凝胶层，再增加操作压力，凝胶层的厚度随着增加，传 质阻力增大，渗透通量不再变化，使得蛋白质和多肽无法分开，加重膜的污染；因此，选择 0.20MPa；C为浓缩倍数对膜通量的影响，浓缩初期膜通量最高，随着浓缩倍数的升高，膜 通量缓慢下降，当浓缩倍数达到5倍时，膜通量下降趋势变为上升趋势，再增加浓缩倍数膜 通量又开始缓慢下降，随着超滤膜截留部分溶液浓度的不断增加，传质系数减小，加剧浓差 极化现象，出现凝胶层，导致超滤膜孔道的阻塞，加剧膜污染，造成截留部位中蛋白质含量 的增大，使产品浓缩液色泽变深，骨髓多肽流失，产品得率减少；综合考虑，浓缩倍数选择 5倍；D为温度对膜通量的影响，当时间一定时，温度与膜通量成正比。随着渗透时间的延长 膜通量逐渐下降，呈现先快后慢的趋势；由于较高的料液温度降低溶液的粘度，溶质的扩散 系数增大，一定程度上减轻了浓差极化效应，使得渗透通量增加；随着温度的升高，蛋白质 结构也随着发生变化，时间的延长易于堵塞膜孔，使污染程度增大，通量下降，温度控制在 40℃；
表5响应面优化法设计与结果
表6回归模型方差分析
BOX-Behnken中心组合实验设计共有12个分析因子，3个零点；零点实验进行3次估计 误差，试验结果见表5；釆用回归模型方差分析对试验结果进行探讨，经数据拟合，得到膜 通量与压力、浓缩倍数和温度三因素的二次回归方程为Y＝+24.87+1.22A-0.29B+1.19C+0.78AB+0.38AC-1.40BC-2.03A2-3.71B2-1.36C2，经Design-Expert(8.0.6)软件处 理，采用二次模型进行变异分析(ANOVA)，二次回归方程的方差分析结果见表6；二次回归模 型的P＝0.0008×0.01，方差回归显著，可见以膜通量为考察指标建立的回归模型极显著，但失拟项0.2210×0.05不显著，相关系数R2＝0.9817，说明模型拟合度良好，试验方法可靠，可准确的预测实验响应值。其中A、BC、A2、B2、C2表现为极显著，表明这些因素对响应值有 较大影响；对所选的因素显著性为A×C×B，即：压力>浓缩倍数>温度；
由图3可知，在所选范围内存在极值，同时也是等高线最小椭圆的中心点，通过比较， 得出A(压力)和C(温度)的影响最大，表现为响应面曲线比较陡峭，这与回归分析结果吻 合；根据所得到的模型，分析得到的最优工艺条件：压力为0.22MPa、浓缩倍数为4.89倍、温度为38.2℃，此条件下，膜通量的理论值为25.38L/(m2.h)；
验证实验：
为了检验响应面法的可行性，参考模型给出渗透最佳条件，结合实际生产条件确定，以 操作压力0.2MPa、浓缩倍数为5倍、温度为40℃，在此条件下进行三组平行试验所得的膜 通量分别为25.74、25.10和25.05L/(m2.h)，平均值为25.29L/(m2.h)；这与预测值比较接近，表明采用的响应面优化法参数可靠，准确；
以膜通量为考察指标，通过响应面法优化了超滤膜分离工艺，最佳参数：截留量为10kDa 超滤膜，压力为0.20MPa，浓缩倍数为5，温度为40℃，此条件下，膜通量为25.29L/(h.m2)。
实施例3
蛋白质浓度的测定：
利用二喹啉甲酸(BCA)法测定实施1-2所得牛骨髓不同分离部位蛋白质浓度：
标准曲线的绘制：根据BCA蛋白测量试剂盒说明书操作配制工作液，每50倍体积的BCA 试剂A溶液加1倍体积的BCA试剂B溶液，充分混匀备用；根据表7吸取试剂盒中蛋白标准品牛血清蛋白，用水稀释，摇匀，各管分别取25μL于96孔板中，各加入175μL BCA工 作液，轻微振荡，混匀，于温度37℃恒温箱中温育30min，取出96孔板，用酶标仪测定吸 光度，测定波长为562nm，每组做三组平行试验，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标 进行回归运算；
表7系列稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品
样品的测定：
精确称取3mg样品，加入1mL蒸馏水溶解，10000rpm离心2min，按照标准曲线操作方法，取25μL样品溶液于96孔板中，各加入175μL BCA工作液，轻微振荡，混匀，于 37℃恒温箱中温育30min，取出96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长为562nm，每个 样品做三组平行试验，按照标准曲线计算蛋白质的含量。
实施例4
抗菌活性测定：
配制浓度为50mg/mL的骨髓蛋白样品，利用孔穴法检测抗菌活性，每孔加样品溶液20μL， 置于37℃培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养皿16-18h，测量抑菌环的直径 并记录，菌种分别为CA：白色念珠菌ATCC10231，EC：大肠杆菌ATCC11229。抑菌圈直径≤7mm时认为样品无抑菌活性；
试验结果：
由图7可知，三种不同截留膜中，1kDa膜对蛋白含量影响最大，其中1kDa截留液蛋白含量达88.2mg/mL，因超滤膜截留分子量越小，其所含有的大分子量蛋白聚集在截留部分中，导致蛋白含量较高，其余部位蛋白含量高低顺序依次为：10kDa截留液>3kDa截留液>3kDa透过液>10kDa透过液>1kDa透过液；
抗菌活性结果显示，除了1kDa透过部位外，其余均对两种试菌有抑制作用，1kDa截留部分抑制效果最好，其次是10kDa截留部分；
表8膜分离经响应面优化后蛋白含量与抗菌效果比较
CA:白色念珠菌；EC:大肠杆菌。
实施例5
蛋白质种类的确定：
试剂配制及样品处理
样品缓冲液：0.5mL三羟甲基氨基甲烷与盐酸混合缓冲液0.5moL/L pH＝6.8、2mL的 10％十二烷基硫酸钠、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；
样品的处理：精密称取样品5mg，溶于1mL蒸馏水中，摇匀，与样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸5min，7000rpm，离心5min；
电极缓冲液：将15.1g三羟甲基氨基甲烷、94g甘氨酸、50mL的10％十二烷基硫酸钠溶解并定容至4L；
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶储存液：30％(W/V)超纯级丙烯酰胺、0.8％(W/V)N,N- 亚甲双丙烯酰胺；
12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶的分离胶配制：3.3mL的H2O、4mL的30％(V/V)十 二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶储存液、2.5mL的1.5moL/L的三羟甲基氨基甲烷与盐酸混 合缓冲液(pH＝8.8)、0.1mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠、0.1mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.006 mL的四甲基乙二胺；
5％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶的积层胶配制：0.68mL的H2O、0.17mL的30％(V/V) 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶储存液、0.13mL三羟甲基氨基甲烷与盐酸混合缓冲液(0.5 moL/L pH＝6.8)、0.01mL的10％(W/V)十二烷基硫酸钠、0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.001 mL的四甲基乙二胺；
电泳条件：恒压75V，40min，然后恒压150V，90min；
考马斯亮蓝固定液：25％异丙醇、10％的冰醋酸、65％水；
考马斯亮蓝染色液：将0.6g的考马斯亮蓝R-250溶解在300mL的固定液中，过滤，棕色瓶储存；
考马斯亮蓝脱色液：5％甲醇、7％的冰醋酸、88％水；
电泳结束后将凝胶片置于固定液中固定2小时，然后放入考马斯亮蓝染色液中，置于摇 床上染色2小时，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止；
试验结果：
图4可知，0.5mol/L NaCl提取部位谱带出现在4.1-9.5kDa和45-66kDa之间，其中既有蛋白也有多肽部位；3kDa截留部分谱带出现在4.1-20kDa之间；1kDa截留部分在 4.1-14.4kDa、35kDa处出现条带；3kDa，1kDa截留部分蛋白谱带无明显单一条带，可能 由于几种蛋白和多肽聚集在一起，导致电泳条带较粗。
实施例6
扫描电子显微镜分析：
用扫描电子显微镜(SEM)观察各骨髓蛋白部分的表面结构形态，取适量各骨髓部位蛋白 样品干燥样品粘贴于样品台上，用离子镀膜仪镀一层铂金导电膜，用扫描电子显微镜分析系 统在加速电压20kV条件下检测，放大倍数1 000-10 000×；
试验结果
图5-图7给出了2 000×、5 000×放大倍数的SEM图；一般多肽的结构均以碎片状态存 在，还有部分小颗粒聚集如图所示；牛骨髓蛋白通过膜分离技术制备的三种不同分子量的部 位均有不同的表面结构，颗粒大小等均不相同，在同一条件下，分子量越小其微观状态呈片 状结构越明显，颗粒尺寸也越小，此现象与蛋白质的分子量有关，随着分子量的增大，表面 突出与结晶状态越明显，这可能是由于真空冷冻干燥过程中因脱水而逐渐聚集结晶而引起。
实施例7
红外吸收光谱分析：
取适量牛骨髓分离部位干燥样品，采用直接涂抹法，进行红外光谱分析，扫描区间为 4000-400cm-1；
试验结果：
图8可看出，四种不同分离部位均在3280cm-1附近有吸收峰，是由N-H伸缩振动引起的 酰胺A带特征峰。2922cm-1附近的吸收峰是因C-N伸缩振动引起的酰胺B带的特征峰，是酰胺Ⅱ带的一次泛频，是费米共振。1645cm-1附近的吸收峰是由C＝O伸缩振动引起的酰胺Ⅰ带特征峰。1450-1600cm-1是酰胺Ⅱ带的特征吸收频率，其中1540cm-1附近的信号峰是因N-H面内弯曲振动引起的；1456cm-1处的信号峰是多肽氨基酸残基侧链基团引起的。1200-1400cm-1处的吸收是酰胺Ⅲ带特征峰，其中1398cm-1附近的吸收峰是因C-N伸缩振动引起，1238cm-1附近的吸收峰是因N-H面内弯曲振动引起的。各个部位红外特征吸收峰峰位分配结果如表9所示。通过FT-IR谱图可判断蛋白质和多肽的特征吸收频率，但是并不能凭此找出四种不同 部位之间的差异；
表9骨髓蛋白的傅里叶红外光谱峰位分配
实施例8
双向电泳(2-DE)
将500μg干燥的蛋白质提取物溶解在含有5M尿素、2M硫脲、3％(w/v)蛋白质裂解液(Chaps)、0.4％(v/v)两性聚合物和溴酚蓝的缓冲液中，将样品加载到固定的pH梯度条pH3-10，非线性，11cm，Bio-Rad上，使用Bio-Rad-Protean-IEF系统进行等电聚焦，凝胶 被动再水化16小时，随后施加快速电压梯度以达到85kv/h，使用Bio-Rad-Protean II XL 系统进行第二维度分离，蛋白质在13％SDS-PAGE凝胶上分解，蛋白带用考马斯蓝染色，置于摇床上染色2小时，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止；
试验结果：
图9中A为7cm，pH 3-10胶条，13％SDS-PAGE分离得到的牛骨髓蛋白的双向电泳图谱。 本实验为了验证牛骨髓蛋白电泳图谱准确位置和分子量信息，直接取牛骨髓原料经双向电泳 缓冲液处理后，考马斯亮蓝染色，谱带出现在66kDa处，该部位在指纹图谱的鉴定中样品名 称为N1，对应靶号为A2；图7中B为7cm，pH 3-10胶条，13％SDS-PAGE分离得到的牛骨髓 0.5mol/L NaCl提取蛋白双向电泳图谱。经考马斯亮蓝染色后蛋白与多肽段均出现相应的分 离点，分离点较多，该部位提取17个蛋白与多肽点，样品名称为YD；图7中C为7cm，pH3-10 胶条，13％SDS-PAGE分离得到的牛骨髓0.5mol/L NaCl提取蛋白用10kDa超滤膜分离后的 透过部位双向电泳图谱；经考马斯亮蓝染色，蛋白与多肽段均出现相应的分离点，多肽分离 点较多，显示在4.1kDa处或以下，蛋白段条带出现在45-66kDa处；该部位提取9个点， 样品名称为MD；图7中D为7cm，pH 3-10胶条，13％SDS-PAGE分离得到的牛骨髓0.5mol/LNaCl提取蛋白用10kDa超滤膜和Sephadex G-25两次纯化后的双向电泳图谱；本试验经两种分离技术合并综合分析得出该方法能有效地分离多肽段；经考马斯亮蓝染色，多肽图谱主 要显示在4.1-6.5kDa处，多肽段的分离效果较为理想，该部位提取5个多肽点，样品名称为ND。
实施例10
肽序列鉴定：
通过MALDI-TOF-MS法确定具有活性的高纯度肽的序列应用较广泛，将扣除蛋白点和纯化 的肽点在平板上，溶于0.6μL在体积比1:1的乙腈/水中的DHBA-饱和基质溶液，将样品进 行质谱分析，并在质谱中鉴定其分子量，然后将肽自动选择分段，通过串联质谱分析收集测 序信息并使用Mascot.2.0软件进行处理；
试验结果：
从表10,11牛骨髓四种制备部位中经查库、对比相关文献初步鉴定了具有生物活性的 20种多肽段，在A2、A5、A12、A15蛋白点中的活性多肽较多，分别是10种抗氧化多肽，7种抗 菌多肽，3种降压多肽。这与牛骨胶原蛋白前期发现的抗氧化、抗菌等生物活性相吻合；
表10抗氧化多肽对比鉴定结果
表11抗菌与降压多肽对比鉴定结果
注：牛骨髓粉末：A2；0.5mol/L NaCl提取部位：A8-A24；10kDa透过部位：B1-B9；10kDa 透过部位+Sephadex G-25纯化部位：A3-A7。
Claims (1)
1.一种基于响应面优化牛骨髓多肽的超滤膜分离及肽序列鉴定方法，其特征在于该方法以氯化钠为提取溶剂，通过响应面法优化超滤膜分离工艺，对所得蛋白进行结构表征及肽序列鉴定，并鉴定出20种活性肽段序列，具体操作包括以下步骤：
a、取新鲜牛骨髓粉末，加入浓度为0.5 mol/L的氯化钠溶液，加热搅拌提取，提取温度为45℃，提取时间2小时，提取次数为2次，用分液漏斗分离油水层，水层按体积比1:5加入石油醚进行脱脂，过滤，得到牛骨髓蛋白提取液，提取率和蛋白含量分别为55.3%，56.7 mg/mL；
b、将步骤a制备的蛋白提取液进行响应面优化超滤膜分离，利用 Design Expert8.0.6 软件进行Box-Behnken 设计，截留膜分子量大小为10 kDa，压力为0.22 Pa，浓缩倍数为5，温度为40℃时蛋白含量和膜通量分别为76.29%，25.29 L/ h.m2；
c、将步骤b制备的蛋白进行红外光谱、扫描电子显微镜、二维电泳技术及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱综合分析，表征其结构，鉴定出20种活性肽段，其中抗氧化肽10种、抗菌肽7种、降压肽3种。
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|---|---|---|---|---|
| CN111254177A (zh) * | 2020-02-17 | 2020-06-09 | 遵义医学院附属医院 | 一种提取骨髓中蛋白质的方法 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN106854232A (zh) * | 2017-03-07 | 2017-06-16 | 中国科学院新疆理化技术研究所 | 一种骨髓蛋白质的制备方法及其应用 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 帕尔哈提•柔孜等: "中药牛骨髓中蛋白与多肽提取方法的比较研究" * |
Cited By (1)
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