CN103392902B

CN103392902B - 利用花生粕制备强抗氧化肽的方法

Info

Publication number: CN103392902B
Application number: CN201310291695.9A
Authority: CN
Inventors: 苏国万; 赵谋明; 孙为正; 赵强忠
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangdong peptide Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: CN103392902A

Abstract

本发明公开了一种利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，该方法包括以下步骤：（1）取花生粕与酸性缓冲液混匀，微波加热，过打粉机得到粉状花生粕；（2）加入水、蛋白酶和纤维素酶，再加入表面活性剂，在45-60℃下水解，离心分离，得到的上清液为花生粕酶解液；（3）往花生粕酶解液中加入乙醇溶液，超滤，收集截留液，喷雾干燥，得强抗氧化肽。本发明采用微波加热与有机酸缓冲液对花生粕进行预处理，促使花生粕蛋白内部的二硫键转化为巯基键，暴露更多的酶解位点，有利于酶解的进行。采用表面活性剂协同酶解，表面活性剂可以改变酶解底物的特性，增加纤维素可供吸附的表面，依次刺激反应位点而吸附到酶上；同时，表面活性剂对酶也有稳定效应，在水解过程中有效地阻止酶的变性，有利于提高蛋白酶的水解效率。

Description

利用花生粕制备强抗氧化肽的方法

技术领域

本发明涉及花生粕的深加工技术，具体涉及一种利用花生粕制备强抗氧化肽的方法。

背景技术

中国是世界上重要的花生生产国之一，产量和出口量均占世界第一，其中有50-60%左右的花生用作榨油，每年产生的花生粕就高达400万吨。花生粕中含有40-50%的蛋白质，其氨基酸组成比较合理，接近联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）的推荐值。但由于目前我国花生榨油主要是采用机械压榨和有机溶剂浸出法相结合，提油后得到的花生粕由于蛋白质高度变性，营养功能性降低和风味劣变而限制其应用领域，大多用作饲料、肥料或燃料，产品附加值低，资源浪费严重。

肽是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，然而其功能与蛋白质和氨基酸相距甚远，不仅具有更佳的吸收机制，同时也具有蛋白质或其组成氨基酸所没有的生理功能。如今，对生物活性肽的研究尤其是短肽的研究，已经成为肽类保健食谱和药物的热点。在众多的生物活性肽中，抗氧化肽作为一种天然抗氧化剂，具有较好的抗氧化性和安全性，吸引了越来越多的关注。

花生粕富含蛋白质，是一种制备抗氧化肽的优质蛋白原料。但由于榨油工艺导致花生粕蛋白发生的高度变性以及纤维素含量极高，增加了其制备抗氧化肽的工艺难度。但经过科研工作者的不懈努力，近年来在利用花生粕制备抗氧化肽取得了一定的进展。

张友维采用微生物发酵法对花生粕中的蛋白进行生物降解制备生物活性肽，制得的抗氧化肽在肽含量为4.92mg/ml时，DPPH自由基清除力为54.58%，超氧阴离子自由基清除力为25.12%，还原力为30.8%，且发酵产物水解度达到21.41%。

申请号为201110356467.6，名称为“一种利用花生粕厌氧发酵生产饲用花生肽的方法”的中国专利申请公开了利用乳杆菌、酿酒酵母和枯草杆菌对花生粕进行固态发酵，制备饲用花生肽，一方面降解花生粕中的黄曲霉毒素，另一方面获得较多的活性肽，提高饲料的消化率。但由于发酵工艺繁琐，且过程中容易引发安全隐患，难以实现大规模生产。

利用生物酶制剂降解蛋白质制备生物活性肽不仅安全性较高、条件温和，且水解过程容易控制。因此近年来普遍采用酶解方法制备生物活性肽。

如毛晓宇等人用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、Alcalase蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶对花生粕进行酶解，并筛选出可获得不同生物活性花生肽的最佳酶制剂。

王建化通过对比Alcalase和Neutrase蛋白酶的花生粕酶解特性，发现Alcalase具有更好的酶解效果，制得的花生肽具有明显的抗氧化活性，5%的花生抗氧化活性肽抗氧化效果与3%的VE抗氧化效果相当。

采用酶解法虽可大规模制备抗氧化肽，但由于花生粕蛋白发生了高度变性，蛋白内部二硫键增加，疏水值升高，同时纤维素含量较高，限制其水解效率，蛋白回收率低下，增加了花生抗氧化肽的生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用花生粕制备强抗氧化肽的方法。为了克服现有的酶解花生粕制备抗氧化肽的方法中的难题，如由于蛋白内部二硫键增加、疏水值升高而导致水解效率低的问题，本发明采用微波加热和有机酸对花生粕进行预处理，促使花生粕蛋白内部的二硫键转化为巯基键，暴露更多的酶解位点，有利于酶解的进行。同时，采用表面活性剂协同酶解，进一步提高酶解效率。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

（1）原料的预处理：按重量取1份花生粕和1-2份酸性缓冲液混匀，通过微波加热，并过打粉机得到粉状花生粕；

（2）花生粕的表面活性剂辅助酶解：加入粉状花生粕质量5-8倍的水，添加蛋白酶和纤维素酶，再加入表面活性剂，在45-60℃下水解，当水解度达到5-10%时，灭酶，离心分离，得到的上清液为富含抗氧化肽的花生粕酶解液；以粉状花生粕的质量为计算基准，蛋白酶的加入量占1.0-1.5%，纤维素酶的加入量占0.6-0.8%，表面活性剂的加入量占0.03-0.05%；

（3）膜分离-乙醇联用分离富集抗氧化肽：往花生粕酶解液中加入乙醇溶液，搅拌均匀；通过膜通量10000Da的超滤膜，收集透过液，再通过膜通量1000Da的超滤膜，收集截留液，得到花生肽溶液；喷雾干燥，得强抗氧化肽。

步骤（1）所述的酸性缓冲液为有机酸缓冲液，pH值为4.0-5.0；所述的有机酸是琥珀酸、柠檬酸或苹果酸；

步骤（1）所述的微波加热是在800-2000W下加热60-200s。

步骤（2）所述的表面活性剂为非离子型表面活性剂，优选PEG-6000、吐温80或司盘40。

步骤（2）中，当所述蛋白酶是中性蛋白酶或碱性蛋白酶时，酶解时pH值为5.0-8.0；当所述蛋白酶为酸性蛋白酶时，酶解时pH值为2.0-4.0。

步骤（3）所述的乙醇溶液，体积浓度为45-60%。

步骤（3）中，超滤条件为：超滤流量不超过50mL/min，进口压力不超过12psi，出口压力不超过7psi，收集经过膜通量1000Da超滤膜分离后的截留液进行喷雾干燥。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明采用微波加热与有机酸缓冲液对花生粕进行预处理，既可达到酸性改变花生粕蛋白内部结构的目的，促使内部的二硫键转化为巯基键，暴露更多的酶解位点，有利于酶解的进行，且可通过调节微波加热和酸的条件来调控最终酶解产物的分子量分布；同时又因为微波具有加热时间短、加热效果好的优点，而简化预处理工艺，降低生产成本。

（2）本发明采用表面活性剂协同酶解，表面活性剂可以改变酶解底物的特性，增加纤维素可供吸附的表面，依次刺激反应位点而吸附到酶上。同时，表面活性剂对酶也有稳定效应，在水解过程中有效地阻止酶的变性。此处用到非离子型表面活性剂可提高纤维素酶水解花生粕中纤维素的作用效率，促使纤维素水解为多糖和单糖，降低体系的粘度，从而增加蛋白酶与花生粕蛋白的接触机率，提高蛋白酶的水解效率，提高抗氧化肽的得率。

（3）本发明采用乙醇溶液结合膜通量10000Da及1000Da的超滤膜进行分离，一方面可以高效分离肽，得到高含量分子量在1000-3000Da之间的肽，同时也达到了浓缩目标肽的目的，简化了工艺流程。

（4）本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染、蛋白回收率高，所得抗氧化肽的抗氧化活性强，，可广泛应用于食品领域中。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下各实施例中，氧自由基吸收能力（ORAC）的测定方法如下：

基于ORAC反应在75mmol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH=7.4)环境中进行，FL（荧光素钠盐）、AAPH（自由基产生剂）、标准抗氧化物质Trolox（维生素E水溶性类似物）以及待测样品均用该缓冲液溶解和稀释。

具体测定操作为：在96孔板各微孔中分别加入待测样品20μL后添加缓冲溶液20μL及FL（70nmol·L^-1）20μL，在37℃下预置15min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH（12.8mmol·L^-1）140μL启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37℃下以激发波长485nm，发射波长528nm进行连续测定，每2min测定一次各孔荧光强度，测定108min，荧光强度分别记为f0，f1，f2···f54。将记录的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据fi与初始荧光强度f0相比，折算成相对荧光强度，并根据公式如下公式统计荧光熄灭曲线下面积(AUCsample)值，

AUC = 1 + Σ_{i = 1}^{54} f_{i} / f_{0}

然后根据公式：net AUC=AUC_sample-AUC_blank分别计算不同浓度Trolox和抗氧化剂net AUC值，其中AUC blank为没有抗氧化剂存在时自由基作用对照的AUC值。

实施例1

一种利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

（1）原料的预处理：柠檬酸缓冲液（pH值4.0）与花生粕按质量比1:1混匀，然后放入微波炉中加热，加热条件为1000W、100s；待物料冷却后，采用打粉机粉碎物料，然后过30目筛，得到改性花生粕粉末。

（2）花生粕的表面活性剂辅助酶解：加入粉状花生粕质量5倍的水，采用1mol/L的氢氧化钠调节花生粕浆液pH值至8.0，按底物质量1.5%添加碱性蛋白酶（Alcalase2.4L）、0.6%的纤维素酶和0.032%的吐温80，55℃进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至5%，90℃灭酶30min，离心分离，得到的上清液为酶解液。

（3）膜分离-乙醇联用分离富集抗氧化肽：往花生粕酶解液加入乙醇溶液（体积浓度45%），搅拌均匀，通过膜通量为10000Da的超滤膜，取透过液通过膜通量1000Da的超滤膜，收集截留液，得到花生肽溶液。

（4）喷雾干燥，得强抗氧化肽1。

酶解液的蛋白回收率、肽含量和分子量分布结果分别见表1～2。

抗氧化肽1的ORAC值为1198.90μmolTrolox/g。

实施例2

一种利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

（1）原料的预处理：琥珀酸缓冲液（pH值4.5）与花生粕按质量比2:1混匀，然后放入微波炉中加热，加热条件为1200W、80s；待物料冷却后，采用打粉机粉碎物料，然后过30目筛，得到改性花生粕粉末。

（2）花生粕的表面活性剂辅助酶解：加入粉状花生粕质量7倍的水，采用1mol/L的氢氧化钠调节花生粕浆液pH值至7.0，按底物质量1.2%添加木瓜蛋白酶（Papain）、0.75%纤维素酶和0.05%司盘40，50℃进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至7%，95℃灭酶20min，离心分离，得到的上清液为酶解液。

（3）膜分离-乙醇联用分离富集抗氧化肽：往花生粕酶解液加入乙醇溶液（体积浓度60%），搅拌均匀，通过膜通量为10000Da的超滤膜，取透过液通过膜通量1000Da的超滤膜，收集截留液，得到花生肽溶液。

（4）喷雾干燥，得强抗氧化肽2。

抗氧化肽2的ORAC值为1273.36μmolTrolox/g。

实施例3

一种利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

（1）原料的预处理：苹果酸缓冲液（pH值5.0）与花生粕按质量比1.5:1混匀，然后放入微波炉中加热，加热条件为800W、200s；待物料冷却后，采用打粉机粉碎物料，然后过30目筛，得到改性花生粕粉末。

（2）花生粕的表面活性剂辅助酶解：加入粉状花生粕质量8倍的水，采用1mol/L的氢氧化钠调节花生粕浆液pH值至7.0，按底物质量1.2%添加复合蛋白酶（Protamex）、0.68%纤维素酶和0.045%PEG-6000，55℃进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至6%，95℃灭酶20min，离心分离，得到的上清液为酶解液。

（4）喷雾干燥，得强抗氧化肽3。

抗氧化肽3的ORAC值为1103.27μmolTrolox/g。

实施例4

采用常规方法（非本发明方法）水解花生粕制备花生肽：

（1）原料的预处理：水与花生粕按质量比1.5:1混匀，然后放入杀菌锅中加热，加热条件为121℃、600s；待物料冷却后，采用打粉机粉碎物料，然后过30目筛，得到改性花生粕粉末。

（2）花生粕的酶解：加入粉状花生粕质量8倍的水，采用1mol/L的氢氧化钠调节花生粕浆液pH值至7.0，按底物质量1.2%添加复合蛋白酶（Protamex）和0.68%纤维素酶，55℃进行酶解反应，采用pH-Stat法控制水解度至6%，95℃灭酶20min，离心分离，得到的上清液为酶解液。

（3）膜分离富集抗氧化肽：将花生粕酶解液通过膜通量为10000Da的超滤膜，取透过液通过膜通量1000Da的超滤膜，收集截留液，得到花生肽溶液。

（4）喷雾干燥，得抗氧化肽4。

抗氧化肽4的ORAC值为632.73μmolTrolox/g。

表1植物蛋白酶解液的各项指标

表2植物蛋白酶解液的分子量分布

表3抗氧化肽与商业抗氧化剂ORAC值比较

由表1可发现，采用本发明的方法对花生粕进行水解，可得到较高的蛋白回收率（71.55-75.37%），同时水解物中的肽含量达到63.72%以上。然而，采用常规的预处理结合酶解方法（实施例4），花生粕水解物的蛋回收率仅为48.68%，虽然其肽含量较高，但对应分子量较大（见表2），也正好说明了蛋白的水解程度较低，这是因为长时间的常规加热也很难将花生粕蛋白中的二硫键转化为巯基键，而采用本发明的有机酸协同微波加热处理，可有效促进花生蛋白中的二硫键转化，从而提高其水解度。

表2为各实施例中花生粕酶解产物的肽分子量分布，由表中可知，采用本发明方法获得的花生粕酶解产物（实施例1～3）的肽分子量主要（90%以上）分布在3000Da以下，而采用常规方法（实施例4）水解花生粕得到的水解产物含有较多的大分子量多肽，而小于3000Da的肽含量仅为68.26%。由此可见采用本发明方法获得的水解液的肽主要集中在3000Da以下。

由表3可看出，采用本发明方法制备的抗氧化肽的抗氧化值（ORAC值）是采用常规方法（实施例4）水解得到的抗氧化肽的2倍左右。主要是因为在有机酸协同微波加热预处理以及非离子表面活性剂辅助水解的基础上，获得分子量集中在3000Da以下的花生肽，然后采用乙醇溶液和超滤膜分离富集分子量为1000-3000Da的肽段，也有大量的文献表明该分子量间的肽段抗氧化值较强，而采用常规的水解方法（实施例4）得到的水解物肽分子量分布分散，1000-3000Da的肽段含量相对较低，因此抗氧化值较低。同时，通过检测发现，采用本发明方法得到的抗氧化肽ORAC值高于商业常用抗氧化剂的ORAC值，说明采用本发明方法制备获到的抗氧化肽具有较好的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）按重量取1份花生粕和1-2份酸性缓冲液混匀，通过微波加热，并过打粉机得到粉状花生粕；

（2）加入粉状花生粕质量5-8倍的水，添加蛋白酶和纤维素酶，再加入表面活性剂，在45-60℃下水解，当水解度达到5-10%时，灭酶，离心分离，得到的上清液为花生粕酶解液；以粉状花生粕的质量为计算基准，蛋白酶的加入量占1.0-1.5%，纤维素酶的加入量占0.6-0.8%，表面活性剂的加入量占0.03-0.05%；

（3）往花生粕酶解液中加入乙醇溶液，搅拌均匀；通过膜通量10000Da的超滤膜，收集透过液，再通过膜通量1000Da的超滤膜，收集截留液，喷雾干燥，得强抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，其特征在于：步骤（1）所述的酸性缓冲液为有机酸缓冲液，pH值为4.0-5.0；所述的有机酸是琥珀酸、柠檬酸或苹果酸。

3.根据权利要求1所述的利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，其特征在于：步骤（2）所述的表面活性剂为PEG-6000、吐温80或司盘40。

4.根据权利要求1所述的利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，其特征在于：步骤（2）中，当所述蛋白酶是中性蛋白酶或碱性蛋白酶时，酶解时pH值为5.0-8.0；当所述蛋白酶为酸性蛋白酶时，酶解时pH值为2.0-4.0。

5.根据权利要求1所述的利用花生粕制备强抗氧化肽的方法，其特征在于：步骤（3）所述的乙醇溶液，体积浓度为45-60%。