CN101906456A

CN101906456A - 源自厚壳贻贝的抗氧化肽的制备方法和用途

Info

Publication number: CN101906456A
Application number: CN201010234963XA
Authority: CN
Inventors: 戴志远; 张婷; 王宏海; 张燕平; 张艳萍
Original assignee: Zhejiang Gongshang University
Current assignee: Zhejiang Gongshang University
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2030-07-22
Also published as: CN101906456B

Abstract

本发明公开了一种源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法，依次包括以下步骤：1)以厚壳贻贝肉脱脂干粉作为原料，在原料中加入水；2)将步骤1)的所得物先均质，然后预热并调节pH至7.0～9.0，最后加入蛋白酶启动酶解反应；3)酶解反应结束后调整pH至6.9～7.1；灭酶、离心后通过超滤富集活性肽，最后经浓缩和冷冻干燥，得抗氧化肽。本发明还同时公开了利用上述方法制备而得的抗氧化肽的用途：作为活性功能性成分。采用本发明方法制备而得的抗氧化肽活性较强。

Description

源自厚壳贻贝的抗氧化肽的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物活性肽的制备工艺，更具体的说，涉及一种厚壳贻贝抗氧化肽的制备方法及应用。

背景技术

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)，属软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异柱目(Anisomyaria)、贻贝科(Mytilidae)，富产于浙江省嵊泗列岛周围海域，是一种高蛋白、低脂肪、富含多种营养成分的双壳类海洋软体动物。

作为传统的滋补食疗品，贻贝素有“海中鸡蛋”的美誉。现代科学研究表明，贻贝具有极高的营养价值，干贻贝含50％～70％的蛋白质，6％～15％的脂肪，8％～14％糖类，并富含多种维生素及钙、磷、铁、碘等营养成分。贻贝还有很高的药用价值和食疗功效，据《本草纲目》记载，贻贝肉能治“虚劳伤惫，精血衰少，吐血久痢，肠鸣腰痛”。《大明日华子本草》：“煮熟食之，能补五脏，益阳事，理腰脚气，消宿食，除腹中冷气”。现代临床试验表明，长期食用贻贝，对肝肾不足、眩晕盗汗、肾阳虚弱、腰痛、小腹冷痛以及高血压、动脉血管硬化等均有一定疗效。

但由于贻贝常温下不耐贮藏及其生产的季节性，使贻贝的开发利用受到很大限制，目前市场上只有附加值较低的干货、罐头等制品，随着养殖技术日趋完善，贻贝年产量日益增高，贻贝加工与高值化利用逐渐引起人们的注意。以天然食品作为蛋白源生产的抗氧化肽因其高效、低毒、易吸收等优点越来越受到欢迎，贻贝因其高蛋白、来源丰富等特点成为制备抗氧化肽的优良原料。

目前已有研究者成功利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶从牡蛎蛋白中获得了抗氧化肽(专利公开号CN1768765A)，但该技术中未提及产率，使得产业化生产不经济；且酶解过程中使用的酶量较大，加大了生产成本，没有找到一个合适的经济位点；同时由于该方法的原料来源不够广泛、不耐贮运、成本较高等缺点，不利于工业化大规模生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种源自厚壳贻贝的抗氧化肽制备方法，该方法条件温和、操作简单、原料来源丰富、价格低廉；所制备的抗氧化肽活性较强。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法，依次包括以下步骤：

1)、以厚壳贻贝肉脱脂干粉作为原料；在原料中加入水，原料与水的质量比为2～5∶100；

2)、将步骤1)的所得物先均质8～12min，然后预热至37～60℃，保持恒温，调节pH至7.0～9.0，最后加入蛋白酶启动酶解反应；蛋白酶与原料中所含蛋白的重量比为1.5～2.5％，酶解反应时间为2～4h；

3)、酶解反应结束后调整pH至6.9～7.1；灭酶、离心后通过超滤富集活性肽，最后经浓缩和冷冻干燥，得抗氧化肽。

作为本发明的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法的改进：步骤1)中的厚壳贻贝肉脱脂干粉的制备方法为：将厚壳贻贝肉干粉在40℃下，按1kg∶4L的料液比加入质量浓度95％的乙醇脱脂4h；重复脱脂三次(即重复实施上述脱脂步骤共3次)，接着于40℃真空干燥、粉碎至能过100目筛。

作为本发明的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法的进一步改进：步骤2)中的蛋白酶为Alcalase2.4L碱性蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶或胰蛋白酶。

在本发明中，所用的蛋白酶均为市购产品；例如：

Alcalase2.4L碱性蛋白酶(酶活力为9.4×10⁴U/g)可购自诺维信酶制剂公司；

复合蛋白酶(酶活力为4.9×10⁴U/g)可购自诺维信酶制剂公司；

中性蛋白酶(酶活力为2.7×10⁴U/g)可购自诺维信酶制剂公司；

胰蛋白酶((酶活力为5.6×10⁴U/g)可购自诺维信酶制剂公司。

作为本发明的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法的进一步改进：步骤2)为：先水浴加热至37～60℃，保持恒温，再调节pH至7.0～9.0，最后加入蛋白酶启动酶解反应，酶解过程连续搅拌，并保持恒温和pH恒定。

作为本发明的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法的进一步改进：步骤3)为：酶解反应结束后调整酶解反应液的pH至7.0，然后于95℃水浴灭酶10～15min，冷却至室温后，离心，取上清液进行超滤。

作为本发明的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法的进一步改进：步骤3)的离心为：8500r/min离心15～20min；上清液先采用0.45μm的中空纤维膜进行微滤，然后再进行超滤。超滤所用超滤膜的截留分子量为5KD～10KD，超滤压力为0.1～0.2Mpa，工作温度10～25℃；收集透过液进行真空浓缩和冷冻干燥，得抗氧化肽。即：将微滤后的酶解液在0.1～0.2Mpa的工作压力和10～25℃的工作温度下，通过超滤膜(截留分子量为5KD～10KD)进行超滤，除去大分子蛋白质及多糖等，收集透过液，真空浓缩，冷冻干燥，得抗氧化肽。

本发明还同时提供了利用上述任意一种方法制备而得的抗氧化肽的用途：作为活性功能性成分。

本发明的抗氧化肽的分子量分布如图1和表1所示；

表1厚壳贻贝抗氧化肽分子量分布结果分析

本发明的抗氧化肽实际使用时，在每1kg食品添加剂、营养强化剂、保健品、护肤品、化妆品、宠物食品或动物饲料中添加3～5克的抗氧化肽。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明所得抗氧化肽具有显著的还原力，较强的清除自由基的能力，可以作为活性功能性成分用于保健品、化妆品等，应用范围非常广泛，具有显著的社会效益和经济效益。

2.本发明的抗氧化肽是厚壳贻贝蛋白经蛋白酶水解后产生的小分子肽，分子量较小，容易被吸收。

3.本发明是一种生物酶法，易通过对酶解过程的监控，使抗氧化肽最大程度释放出来，提高原料的利用率。

4.本发明的原料来源广泛，价格低廉；技术工艺科学合理，制备方法简单易行，适合工业化生产。经过本发明的技术转化可以有效提高厚壳贻贝的附加值，能够大幅度提高厚壳贻贝蛋白资源的利用率，对促进水产加工业的发展有重要意义。

综上所述，本发明首次采用不同种类的蛋白酶对海洋低值贝类——贻贝进行酶解，进而分离得到抗氧化肽，开拓了贻贝高值化利用的新领域，具有广阔的发展前景和显著的经济效益。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是厚壳贻贝抗氧化肽的分子量分布图。

具体实施方式

实施例1

新鲜厚壳贻贝洗净，去壳及毛须，打浆机匀浆至糊状，冻藏，冷冻(-50℃)干燥得厚壳贻贝肉干粉(其含水率为2.54％)。厚壳贻贝肉干粉在40℃下，按1kg∶4L的料液比例加入95％(质量浓度)乙醇脱脂4h，重复脱脂共三次(每次的乙醇浓度、用量及脱脂时间均相同)。将脱脂后的样品40℃真空干燥，粉碎并过100目筛，得厚壳贻贝肉脱脂干粉(其含水率为2.73％，蛋白重量含量78.9％)。

称取厚壳贻贝肉脱脂干粉5.0g于酶反应器中，加入100ml去离子水搅拌均匀，均质10min，预热至55℃，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至8.5；然后加入0.08gAcalase2.4L碱性蛋白酶启动酶解反应，连续搅拌，保持反应体系的温度恒定(55±0.5℃)及pH恒定(pH8.5±0.3)，反应时间为3h。反应结束后，利用0.1mol/L的NaOH溶液或者0.1mol/L的HCL溶液调整所得的酶解反应液pH至7.0；然后于95℃水浴灭酶10min，冷却至室温后，在8500r/min下离心15min，取上清液用0.45μm的中空纤维膜进行微滤，微滤后的酶解液在0.13Mpa的工作压力(超滤压力)和25℃的工作温度下，通过截留分子量为10KD超滤膜进行超滤，除去大分子蛋白质及多糖等，收集透过液，真空浓缩，冷冻(-50℃)干燥，得3.35克干粉状的抗氧化肽(其含水率为1.96％)。

将该抗氧化肽配成浓度为8mg/mL的溶液(以去离子水为溶剂，作为样品)。取2mL上述溶液，加入2mL0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲液和2mL1％(质量浓度)的铁氰化钾(K₃Fe(CN)₆))溶液，混匀，50℃水浴保温20min，再加入2mL10％(质量浓度)的三氯乙酸(TCA)溶液，混匀后离心；取上清液2mL，加入2mL纯水和0.5mL0.1％(质量浓度)的三氯化铁溶液(FeCl₃)，混匀后50℃水浴保温10min；以纯水代替样品作空白，测定700nm下的吸光值，得其还原力A700为0.585。

将该抗氧化肽用超纯水配成浓度为5.0mg/mL的溶液(作为样品)，取2mL加入1×10^-4mol/L的DPPH 80％的乙醇溶液2mL，混匀，室温下避光静置30min；以2mL80％乙醇溶液代替上述DPPH溶液为空白组，以2mL的超纯水代替样品溶液为对照组，分别于517nm测定吸光值Ai、Aj、Ac。按公式：清除率P＝[(1-(Ai-Aj)/Ac]×100％计算，得DPPH自由基清除率为43.0％。

将该抗氧化肽用超纯水配成浓度为5.0mg/mL的溶液(作为样品)，取1mL加入1.8mL50mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2)，混匀，25℃水浴保温10min后加入0.1mL浓度为10mmol/L的邻苯三酚溶液(用10mmol/L的HCl配制)，迅速混匀倒入比色皿开始计时，每隔30S在325nm下测吸光值，持续5min。以1mL超纯水代替样品作为对照组。分别作吸光值随时间变化的回归方程，得到斜率即邻苯三酚自氧化速率V_样品、V_对照。通过公式：P＝[(V_对照-V_样品)/V_对照]×100％计算，得超氧阴离子清除率为26.5％。

实施例2

厚壳贻贝肉脱脂干粉的制备方法同实施例1。

称取厚壳贻贝肉脱脂干粉200.0g(蛋白含量78.9％)于酶反应器中，加入4L去离子水搅拌均匀，均质10min，预热至55℃，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至8.5，加入3.2gAcalase2.4L碱性蛋白酶启动酶解反应，连续搅拌，保持反应体系的温度恒定及pH恒定，反应时间为4h。反应结束后，利用0.1mol/L的NaOH溶液或者0.1mol/L的HCL溶液调整所得的酶解反应液pH至7.0；然后95℃水浴灭酶10min，冷却至室温，在8500r/min下离心15min，取上清液用0.45μm的中空纤维膜进行微滤，微滤后的酶解液在0.13Mpa的工作压力和25℃的工作温度下，通过截留分子量为5KD超滤膜进行超滤，除去大分子蛋白质及多糖等，收集透过液，真空浓缩，冷冻(-50℃)干燥，得130g抗氧化肽干粉(其含水率为1.87％)。

按实施例1的测定方法，对该抗氧化肽进行活性测定，得其还原力A700为0.545，DPPH自由基清除率为41.7％，超氧阴离子清除率为28.2％。

实施例3

厚壳贻贝肉脱脂干粉的制备方法同实施例1。

称取厚壳贻贝肉脱脂干粉5.0g(蛋白含量78.9％)于酶反应器中，加入100ml去离子水搅拌均匀，均质10min，预热至45℃，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.2，加入0.08g复合蛋白酶启动酶解反应，连续搅拌，保持反应体系的温度恒定(45±0.5℃)及pH恒定(pH7.2±0.2)，反应时间为3小时。反应结束后，利用0.1mol/L的NaOH溶液或者0.1mol/L的HCL溶液调整所得的酶解反应液pH至7.0；然后95℃水浴灭酶10min，冷却至室温，在8500r/min下离心15min，取上清液用0.45μm的中空纤维膜进行微滤，微滤后的酶解液在0.15Mpa的工作压力和20℃的工作温度下，通过截留分子量为5KD超滤膜进行超滤，除去大分子蛋白质及多糖等，收集透过液，真空浓缩，冷冻(-50℃)干燥，得3.15g抗氧化肽干粉(其含水率为1.79％)。

按实施例1的测定方法，对该抗氧化肽进行活性测定，得其还原力A700为0.563，DPPH自由基清除率为42.6％，超氧阴离子清除率为25.0％。

实施例4、

厚壳贻贝肉脱脂干粉的制备方法同实施例1。

称取厚壳贻贝肉脱脂干粉5.0g(蛋白含量78.9％)于酶反应器中，加入200ml去离子水搅拌均匀，均质12min，预热至50℃，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.2，加入0.07g中性蛋白酶启动酶解反应，连续搅拌，保持反应体系的温度恒定(50±0.5℃)及pH恒定(pH7.2±0.2)；反应时间为4小时。反应结束后，利用0.1mol/L的NaOH溶液或者0.1mol/L的HCL溶液调整所得的酶解反应液pH至7.0；然后95℃水浴灭酶10min，冷却至室温，在8500r/min下离心15min，取上清液用0.45μm的中空纤维膜进行微滤，微滤后的酶解液在0.15Mpa的工作压力和15℃的工作温度下，通过截留分子量为10KD超滤膜进行超滤，除去大分子蛋白质及多糖等，收集透过液，真空浓缩，冷冻(-50℃)干燥，得3.05g抗氧化肽干粉(其含水率为1.92％)。

按实施例1的测定方法，对该抗氧化肽进行活性测定，得其还原力A700为0.507，DPPH自由基清除率为40.2％，超氧阴离子清除率为24.8％。

实施例5、

厚壳贻贝肉脱脂干粉的制备方法同实施例1。

称取厚壳贻贝肉脱脂干粉5.0g(蛋白含量78.9％)于酶反应器中，加入150ml去离子水搅拌均匀，均质10min，预热至38℃，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至8.0，加入0.09g胰蛋白酶启动酶解反应，连续搅拌，保持反应体系的温度恒定(38±0.5℃)及pH恒定(pH8.0±0.3)；反应时间为2.5小时。反应结束后，利用0.1mol/L的NaOH溶液或者0.1mol/L的HCL溶液调整所得的酶解反应液pH至7.0；然后95℃水浴灭酶10min，冷却至室温，在8500r/min下离心15min，取上清液用0.45μm的中空纤维膜进行微滤，微滤后的酶解液在0.18Mpa的工作压力和20℃的工作温度下，通过截留分子量为10KD超滤膜进行超滤，除去大分子蛋白质及多糖等，收集透过液，真空浓缩，冷冻(-50℃)干燥，得3.26g抗氧化肽干粉(其含水率为1.87％)。

按实施例1的测定方法，对该抗氧化肽进行活性测定，得其还原力A700为0.586，DPPH自由基清除率为47.1％，超氧阴离子清除率为26.3％。

对比实施例：

参照CN1768765A的方法，取新鲜厚壳贻贝肉匀浆，加水调节至蛋白质浓度为5％，加热至65℃，加入重量为厚壳贻贝肉中的蛋白质重量3.6％的中性蛋白酶，保温160min，煮沸、冷却、离心取上清液，通过截留分子量为10KD超滤膜进行超滤，浓缩，喷雾干燥，得抗氧化肽干粉。

按实施例1的测定方法，对该抗氧化肽进行活性测定，得其还原力A700为0.385，DPPH自由基清除率为32.1％，超氧阴离子清除率为20.7％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、以厚壳贻贝肉脱脂干粉作为原料；在原料中加入水，所述原料与水的质量比为2～5∶100；

2)、将步骤1)的所得物先均质8～12min，然后预热至37～60℃，保持恒温，调节pH至7.0～9.0，最后加入蛋白酶启动酶解反应；所述蛋白酶与原料中所含蛋白的重量比为1.5～2.5％，酶解反应时间为2～4h；

2.根据权利要求1所述的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法，其特征是所述步骤1)中的厚壳贻贝肉脱脂干粉的制备方法为：将厚壳贻贝肉干粉在40℃下，按1kg∶4L的料液比加入质量浓度95％的乙醇脱脂4h；重复脱脂三次，接着于40℃真空干燥、粉碎至能过100目筛。

3.根据权利要求2所述的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法，其特征是：所述步骤2)中的蛋白酶为Alcalase2.4L碱性蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶或胰蛋白酶。

4.根据权利要求3所述的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法，其特征是：所述步骤2)中的酶解反应于搅拌状态下进行、并保持恒温和pH恒定。

5.根据权利要求4所述的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法，其特征是所述步骤3)为：酶解反应结束后调整酶解反应液的pH至7.0，然后于95℃水浴灭酶10～15min，冷却至室温后，离心，取上清液进行超滤。

6.根据权利要求5所述的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法，其特征是：所述步骤3)的离心为：8500r/min离心15～20min；上清液先采用0.45μm的中空纤维膜进行微滤，然后再进行超滤。

7.根据权利要求6所述的源自厚壳贻贝蛋白的抗氧化肽的制备方法，其特征是：所述超滤所用超滤膜的截留分子量为5KD～10KD，超滤压力为0.1～0.2Mpa，工作温度10～25℃；收集透过液进行真空浓缩和冷冻干燥，得抗氧化肽。

8.如权利要求1～7所述任意一种方法制备而得的抗氧化肽的用途，其特征是：作为活性功能性成分。