CN114057837A - 一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保护功能的抗氧化肽及其制备方法和应用 - Google Patents
一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保护功能的抗氧化肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保护功能的抗氧化肽及其制备方法和应用，涉及抗氧化肽技术领域。本发明所述抗氧化肽，通过厚壳贻贝肉清洗→搅碎→脱脂→烘干→粉碎→酶解→分离、纯化和测序制备得到两条抗氧化肽：H1和H5。H1和H5抗氧化活性较好，表现出较好的清除活性；并且多肽H1和H5具备热稳定性，耐消化性。
Description
技术领域
本发明属于抗氧化肽技术领域，具体涉及一组从厚壳贻贝肉中分离的具 有肝保护功能的抗氧化肽及其制备方法和应用。
背景技术
厚壳贻贝(Mytilus coruscus)，属软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、异柱目(Anisomyaria)、贻贝科(Mytilidae)，是一种高 蛋白、低脂肪、富含多种营养成分的双壳类海洋软体动物。
作为传统的滋补食疗品，贻贝素有“海中鸡蛋”的美誉。现代科学研究表 明，贻贝具有极高的营养价值，干贻贝含50％～70％的蛋白质，6％～15％的 脂肪，8％～14％糖类，并富含多种维生素及钙、磷、铁、碘等营养成分。贻 贝还有很高的药用价值和食疗功效，据《本草纲目》记载，贻贝肉能治“虚 劳伤惫，精血衰少，吐血久痢，肠鸣腰痛”。《大明日华子本草》：“煮熟食之， 能补五脏，益阳事，理腰脚气，消宿食，除腹中冷气”。现代临床试验表明，长期食用贻贝，对肝肾不足、眩晕盗汗、肾阳虚弱、腰痛、小腹冷痛以及高 血压、动脉血管硬化等均有一定疗效。
随着科学技术的发展，厚壳贻贝已经可进行深加工，作为氧化肽的优良 原料，但是现有的源自厚壳贻贝的抗氧化肽的制备方法(CN101906456A)， 不仅需酶种类多，而且得到的抗氧化肽抗氧化性一般。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保 护功能的抗氧化肽及其制备方法和应用，所述抗氧化多肽的自由基清除活性 和稳定性高，对氧化损伤细胞表现出显著地保护作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保护功能的抗氧化肽， 所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：(1)将洁净 的厚壳贻贝肉脱脂后烘干和粉碎，得脱脂肉粉；
(2)利用胰蛋白酶对所述脱脂肉粉进行酶解，收集分子量小于1kDa 的酶解液；
(3)将所述酶解液依次经过Q-琼脂糖凝胶FF离子交换层析和Sephadex G-15层析，于214nm处收集各峰，收集液中包含所述抗氧化肽。
优选的，步骤(1)所述脱脂包括利用乙酸乙酯脱脂。
优选的，步骤(2)所述酶解时，胰蛋白酶的加酶量为2～4％，在40℃ 条件下酶解3～5h。
优选的，步骤(2)所述酶解前，将所述脱脂肉粉与水混合，所述脱脂 肉粉与水的体积比为1:30～50。
本发明还提供了一种抗氧化剂，所述抗氧化剂以上述抗氧化肽为有效成 分。
本发明还提供了上述抗氧化肽或上述制备方法制备得到的抗氧化肽在 制备对氧化损伤细胞具有保护作用的制剂中的应用。
本发明还提供了一种对氧化损伤细胞具有保护作用的制剂，所述制剂以 上述抗氧化肽或上述制备方法制备得到的抗氧化肽为有效成分。
有益效果：本发明提供了一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保护功能的 抗氧化肽，通过厚壳贻贝肉清洗→搅碎→脱脂→烘干→粉碎→酶解→分离、 纯化和测序制备得到。本发明得到两条抗氧化肽：H1：Leu-Ala-Ala-Ser-His (497.55Da)和H5：Ser-Pro-Phe-Asn-Phe(610.67Da)。H1和H5抗氧化活 性较好，对DPPH·半最大效应浓度(EC50)分别为0.423±0.002mg/mL和 0.716±0.011mg/mL、HO·EC50为0.777±0.027mg/mL和1.340±0.036 mg/mL)、O2·-EC50为0.179±0.003mg/mL和0.678±0.008mg/mL、 ABTS·EC50为0.188±0.001mg/mL和0.385±0.003mg/mL，表现出较好的 清除活性；并且多肽H1和H5具备热稳定性，耐消化性。
本发明实施例中所述抗氧化肽H1和H5对HUVEC细胞表现出更强的 保护能力：多肽H1和H5都能促进一氧化氮释放，提高超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化 能力(T-AOC)水平，降低丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)水平。同 时，所述H1和H5对体外氧化损伤的牛血清蛋白还具有保护作用，作用效 果呈浓度依赖性，Keap1/Nrf2信号通路可能是多肽H1、H5发挥保护作用的 潜在抗氧化通路。综上，厚壳贻贝抗氧化多肽通过调节HUVEC细胞的氧化 应激对氧化损伤的HUVECs起到保护作用。
附图说明
图1为不同酶种类的活性氧清除率，其中A：DPPH·清除率，B：HO·清 除率，C：ABTS·清除率；
图2为DPPH·清除率随时间变化(左)、随酶含量变化(中)和随料 液比(右)变化；
图3为超滤各段的活性氧清除率，其中A：DPPH·清除率，B：HO·清 除率，C：ABTS·清除率；
图4为QFF离子交换洗脱曲线；
图5为脱盐后各组分的活性氧清除率，其中A：DPPH·清除率，B： HO·清除率，C：ABTS·清除率；
图6为Sephadex G-15凝胶层析结果；
图7为凝胶组分的活性氧清除率，其中A：DPPH·清除率，B：HO·清 除率，C：ABTS·清除率；
图8为M-Ⅰ-5-1的RP-HPLC谱图；
图9为多肽的脂质过氧化抑制测定(左)和温度对多肽的ABTS自由基 活性的影响；
图10为多肽在模拟胃肠道消化过程中的ABTS·清除活性动态曲线；
图11为H2O2浓度对HUVECs的作用(左)、多肽对HUVECs活力影响 (中)和多肽对HUVECs的保护作用(右)；
图12为不同浓度多肽对HUVECs的保护作用(左)和多肽对HUVECs 中SOD活力(中)及MDA活力(右)影响；
图13为多肽对HUVECs中GSH-PX活力影响(左)和NO含量影响(右)；
图14为多肽对HUVECs中iNOS(A)和eNOS(B)活力影响；
图15为多肽对HUVECs中CAT活力(左)、LDH活力(中)、T-AOC 活力(右)影响；
图16为多肽对HUVECs中ROS含量影响，其中A：Control；B:模型组； C:NAC+H2O2；D:50μM H1+H2O2；E:100μM H1+H2O2；F:200μM H1+H2O2； G:50μM H5+H2O2；H:100μM H5+H2O2；I:200μM H5+H2O2；J：ROS含 量；
图17为多肽的蛋白质保护作用，其中A：多肽保护BSA损伤的电泳图； 1：BSA；2：BSA+H2O2；3：BSA+GSH+H2O2；4：BSA+H1(2.5mM)+H2O2； 5：BSA+H1(5mM)+H2O2；6：BSA+H1(10mM)+H2O2；7：BSA+H5 (2.5mM)+H2O2；8：BSA+H5(5mM)+H2O2；9：BSA+H5(10mM) +H2O2；B：各条带相对强度分析；
图18为多肽对HUVEC细胞Keap1/Nrf2通路相关蛋白的影响，其中A： Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1和GCLM的蛋白印迹分析；B：对Keap1的定 量分析；C：对Nrf2的定量分析；D：对HO-1的定量分析；E：对NQO1 的定量分析；F：对GCLM的定量分析。
具体实施方式
本发明提供了一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保护功能的抗氧化肽， 所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为Leu-Ala-Ala-Ser-His，分子量 为497.55Da，简写为H1；SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列为 Ser-Pro-Phe-Asn-Phe，分子量为610.67Da，简写为H5。
本发明还提供了上述抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：(1)将洁净 的厚壳贻贝肉脱脂后烘干和粉碎，得脱脂肉粉；
(2)利用胰蛋白酶对所述脱脂肉粉进行酶解，收集分子量小于1kDa 的酶解液；
(3)将所述酶解液依次经过Q-琼脂糖凝胶FF离子交换层析和Sephadex G-15层析，于214nm处收集各峰，收集液中包含所述抗氧化肽。
本发明将洁净的厚壳贻贝肉脱脂后烘干和粉碎，得脱脂肉粉，本发明优 选将厚壳贻贝肉用流水清洗干净，并在低温条件下烘干表面水分，解剖和粉 碎。本发明所述低温优选为50℃，所述烘干的时间优选为48h。本发明所述 解剖优选包括将贝肉剥离，去除内脏。本发明所述粉碎优选将获得的贝肉置 于组织粉碎机中进行粉碎，过60目筛。
本发明优选将粉碎后的厚壳贻贝肉脱脂，而后再进行烘干和粉碎。本发 明所述脱脂优选包括利用乙酸乙酯脱脂，且所述乙酸乙酯与厚壳贻贝肉的体 积质量比优选为1mL:1g，共脱脂5次，每次脱脂12小时。
得脱脂肉粉后，本发明利用胰蛋白酶对所述脱脂肉粉进行酶解，收集分 子量小于1kDa的酶解液。本发明进行所述酶解前，优选将所述脱脂肉粉与 水混合，所述脱脂肉粉与水的体积比优选为1:30～50，更优选为1:40。本发 明所述酶解优选在40℃和pH值8.0的条件下进行，且所述酶解的时间优选 为3～5h，更优选为4h。本发明所述酶解时，胰蛋白酶的加酶量(U/g)优选 为2～4％，更优选为3％。
本发明在所述酶解后优选还包括灭酶，并收集子量小于1kDa的酶解液。 本发明所述收集优选为利用膜超滤装置进行超滤，选用分子量为1kDa的超 滤膜进行截留，所述超滤的频率和压力参照仪器说明即可。
得酶解液后，本发明将所述酶解液依次经过Q-琼脂糖凝胶FF离子交换 层析和Sephadex G-15层析，于214nm处收集各峰，收集液中包含所述抗氧 化肽。本发明收集得到分子量小于1kDa的酶解液后，优选还包括进行旋蒸 和冻干，并重新配制成50mg/mL的溶液，离心，取上清，过0.22μm滤膜， 再依次经过Q-琼脂糖凝胶FF离子交换层析和Sephadex G-15层析。
本发明进行Q-琼脂糖凝胶FF(QFF)离子交换层析时，优选按照说明 书对QFF阴离子交换树脂进行实验前预处理，将QFF引流到柱中；双蒸水 清洗，使其充分洗净；再用Tris-HCl缓冲溶液冲洗层析柱，平衡到pH稳定。 吸取3mL上述过0.22μm滤膜的滤液，恒流上样，之后依次按照Tris-HCl 缓冲液(0～0.5M NaCl)逐级洗脱，在214nm紫外波长下检测收集洗脱峰， 旋蒸浓缩备用。本发明对收集得到的液体进行抗氧化活性分析，以抗氧化活 性最优的M-I-5进行下一步的Sephadex G-15层析。
本发明所述Sephadex G-15层析优选包括称取适量Sephadex G-15，超纯 水浸泡24h，待其溶胀，舍弃表面颗粒，清洗凝胶，去除气泡；固定层析柱， 检漏，将Sephadex G-15引流到柱中，之后用2倍柱体积超纯水平衡色谱柱。 开启恒流泵过夜，用流水压实胶柱体；色谱柱平衡后，取样3mL，超纯水 洗脱，流速0.5mL/min，10min/管，并于214nm处检测收集各峰。本发明 优选对比各峰的抗氧化活性，筛选具有最高抗氧化活性的峰进行后续的分离和纯化。本发明实施例中，共得到两个峰M-I-5-1和M-I-5-2，其中M-I-5-1 的抗氧化能力最强，选择该峰进行后续的分离和纯化。
本发明对M-I-5-1峰的洗脱物进行高效液相色谱分析，共测序得到8条 多肽，其中H1和H5的抗氧化活性及热稳定性更好。
本发明还提供了一种抗氧化剂，所述抗氧化剂以上述抗氧化肽为有效成 分。
本发明实施例中对多肽H1和H5进行自由基清除活性试验测定，结果 表明：H1和H5抗氧化活性较好，对DPPH·的EC50分别为0.423±0.002 mg/mL和0.716±0.011mg/mL，HO·的EC50分别为0.777±0.027mg/mL 和1.340±0.036mg/mL、O2·-的EC50分别为0.179±0.003mg/mL和0.678 ±0.008mg/mL，ABTS·的EC50分别为0.188±0.001mg/mL和0.385±0.003 mg/mL，有较好的清除活性；且多肽H1和H5具备热稳定性，耐消化性， 因此可用于制备抗氧化剂。
本发明还提供了上述抗氧化肽或上述制备方法制备得到的抗氧化肽在 制备对氧化损伤细胞具有保护作用的制剂中的应用。
本发明所述抗氧化肽，在实施例中利用氧化损伤细胞模型进行验证，证 实多肽H1和H5对HUVEC细胞表现出更强的保护能力，具体体现在：多 肽H1和H5都能促进一氧化氮(NO)释放，提高超氧化物歧化酶(SOD)、 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC) 水平，降低丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)水平，可以减少细胞内活性氧(ROS)的产生，形成保护作用。本发明实施例同时还利用所述多肽 H1和H5对体外氧化损伤的牛血清蛋白进行保护功能验证，证实存在保护作 用，并且作用效果呈浓度依赖性。Westernblot实验显示H1和H5使得Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)表达降低，核因子E2相关因子2(Nrf2)、 血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接 酶(GCLM)表达上升。Keap1/Nrf2信号通路可能是多肽H1、H5发挥保护 作用的潜在抗氧化通路。
本发明还提供了一种对氧化损伤细胞具有保护作用的制剂，所述制剂以 上述抗氧化肽或上述制备方法制备得到的抗氧化肽为有效成分。
本发明所述制剂的保护机理与上述内容相同，在此不再赘述。本发明所 述制剂具有良好的稳定性，口服或注射均可。
下面结合实施例对本发明提供的一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保 护功能的抗氧化肽及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理 解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、材料和方法
1、将厚壳贻贝肉流水清洗干净，低温烘干表面水分，解剖绞碎，乙酸 乙酯脱脂，烘干，粉碎。
2、不同酶的酶解效果比较
分别以胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶在 表1所示的最适条件下进行酶解。通过加热灭酶活性，酶解液放于100℃水 浴，时间为15min。之后4000r/min条件下离心15min，收集上清液，冷冻 干燥。以DPPH·、HO·及ABTS·清除率为指标，进行比较。
表1五种蛋白酶最适条件
2.1胰蛋白酶不同酶解时间的比较
取适量厚壳贻贝粉，去离子水为溶剂，控制条件温度为40℃，pH 8， 设置酶解时间分别为2、3、4、5和6h，根据不同时间下的DPPH·清除率， 进行比较。
2.2胰蛋白酶的不同加酶量的比较
取适量厚壳贻贝粉，去离子水为溶剂，控制条件40℃、pH 8、4.0h， 设置加酶量分别为1％、2％、3％、4％和5％。比较不同加酶量条件下的 DPPH·清除率。
2.3厚壳贻贝肽不同料液比的酶解效果比较
取适量厚壳贻贝粉，去离子水为溶剂，在pH 8、40℃、4.0h条件下， 胰蛋白酶加酶量为3％，选择料液比为1：20，1：30，1：40，1：50和1： 60进行酶解，将酶解液离心旋蒸冻干后，比较不同料液比条件下的DPPH·清 除率。
2.4正交实验
根据上述因素得到的结果，进行正交实验，确定酶解时间(A)、加酶量 (B)、料液比(C)对厚壳贻贝肽抗氧化活性的影响，得到厚壳贻贝最佳酶 解工艺。
3、厚壳贻贝抗氧化肽的分离纯化
3.1超滤分段
启动膜超滤装置，设定好超滤时的频率与压力，对机器进行清洗。选用 不同分子量(1、3、5、10kDa)超滤膜对厚壳贻贝酶解液截留分段，得到 五部分酶解物。收集每个组分，旋蒸，冻干。进行抗氧化活性试验，选取出 其中活性较好组分，进一步分离纯化。
3.2 Q-琼脂糖凝胶FF(QFF)离子交换层析
按照说明书对QFF阴离子交换树脂进行实验前预处理，将QFF引流到 柱中。双蒸水清洗，使其充分洗净。再用Tris-HCl缓冲溶液冲洗层析柱，平 衡到pH稳定。将厚壳贻贝酶解液最优活性组分配置成50mg/mL的溶液， 离心，取上清，过0.22μm滤膜。吸取3mL，恒流上样，之后依次按照Tris-HCl 缓冲液(0～0.5M NaCl)逐级洗脱，在214nm紫外波长下检测收集洗脱峰， 旋蒸浓缩备用。
3.3 Sephadex G-15层析
称取适量Sephadex G-15，超纯水浸泡24h，待其溶胀，舍弃表面颗粒， 清洗凝胶，去除气泡。固定层析柱，检漏，将Sephadex G-15引流到柱中， 之后用2倍柱体积超纯水平衡色谱柱。开启恒流泵过夜，用流水压实胶柱体。 色谱柱平衡后，取样3mL，超纯水洗脱，流速0.5mL/min，10min/管，并 于214nm处检测收集各峰。测定每个组分抗氧化活性，将最好组分进行下 一步实验。
3.4高效液相色谱纯化、制备
收集上步所得抗氧化活性最好的组分，冻干，进行氨基酸测序。
4、抗氧化活性的测定
4.1 DPPH·清除能力测定
将获得的各组分配置成一定浓度的多肽液。测定实验分为样品组(As)、 空白组(Ac)和对照组(Ab)。准确配置0.2mM DPPH溶液，之后按照表2 添加试剂，摇晃充分混匀，避光反应6min，在517nm测定吸光值。
表2试剂添加方法
DPPH自由基清除率测定公式如下：
4.2 HO·清除能力测定
将获得的各组分配置成一定浓度的多肽液。实验分组同4.1。按表3添 加试剂，37℃水浴90min，于536nm测定吸光值。
表3试剂添加方法
HO·自由基清除率测定公式如下：
4.3 ABTS·清除能力测定
将获得的各组分配置成一定浓度的多肽液。测定实验分为对照组(Ac) 和样品组(As)。Ac：磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释ABTS溶液，使734nm 处吸光值0.70±0.02。按照表4添加试剂，摇晃充分混匀后，避光反应10min， 于734nm测定吸光值。
表4试剂添加方法
ABTS·自由基清除率测定公式如下：
4.4超氧阴离子自由基清除能力测定
测定实验分为对照组(Ac)和样品组(As)。准确配置2.52mM氯化硝 基四氮唑蓝(NBT)溶液、624μM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)溶液 和120μM吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液，之后按照表5加样。避光25℃水 浴5min。在560nm测各组吸光值。
表5试剂添加方法
计算公式：
4.5脂质过氧化抑制能力测定
准确称取1mg样品溶于1mLpH＝7,50mM的磷酸盐缓冲溶液中制成样 品液，取其中1mL加入0.13mL亚油酸、1mL 99.5％乙醇及0.37mL双蒸 水制成样品混合液。100μL无水乙醇加入1mLpH＝7,50mM的磷酸盐缓冲 溶液中制成空白液，取其中1mL加入0.13mL亚油酸、1mL无水乙醇及 0.37mL双蒸水制成空白混合液。之后按表6添加试剂，混匀，暗室孵育7 天(40℃)，每天同一时间于500nm处测定吸光度。
表6脂质过氧化抑制能力测定
5、多肽稳定性测定
5.1温度对厚壳贻贝多肽抗氧化活性的影响
配制浓度为1mg/mL的厚壳贻贝抗氧化肽样品溶液，不同温度下(20、 40、60、80、100℃)恒温水浴，保持1h，冷却至室温，测定其ABTS自由 基清除率。
5.2体外模拟胃肠消化对厚壳贻贝多肽抗氧化活性的影响
胃液的配制：0.32g胃蛋白酶溶于100mL蒸馏水，调节pH至1.2。配 制1mg/mL的厚壳贻贝抗氧化肽溶液，37℃条件下水浴反应2h。
模拟肠消化：用1.0M NaOH调pH至6.8，按1：100加入胰酶，37℃ 水浴2h，其余条件不变。加热法终止消化，自然冷却，离心(10000r/min； 15min)，取上清。测定其ABTS自由基清除率活性。
二、结果分析
1、蛋白酶的酶解效果对比
用五种蛋白酶对厚壳贻贝粉进行酶解，冻干，样品浓度为5mg/mL，测 定不同酶解物DPPH·清除率、HO·清除率和ABTS·清除率，结果如图1 所示，胰蛋白酶酶解产物的DPPH·清除率最好，为73.08±1.47％，且与 其余四种蛋白酶的清除率有明显差异(P＜0.05)；胰蛋白酶酶解产物HO·清 除率最强，为47.04±1.28％，且与其余四种蛋白酶清除率有明显差异(P ＜0.05)；胰蛋白酶酶解产物ABTS·清除率最强，为87.19±1.15％，且胰与其余四种蛋白酶清除率有明显差异(P＜0.05)。
2、酶解条件的对比
2.1胰蛋白酶分别在2、3、4、5、6h酶解，获得酶解产物，冻干，检 测DPPH·清除率。结果如图2所示，在0～2h之间，随着时间延长，酶解 物的DPPH·清除率升高。4～6h之间，酶解物的DPPH·清除率慢慢下降。 位于4h时，DPPH·清除率最高，为74.44±0.30％，且DPPH·清除率与 其余四个时间下的清除率有明显差异(P＜0.05)。
2.2结果如图2所示，当实验加酶量小于3％时，随着加酶量的增加， 酶与底物结合变多，酶解物的DPPH·清除率不断升高。实验加酶量大于3％ 时，底物逐渐饱和，酶解物的清除率反而有所降低。得出结论，加酶量3％ 时，试验得到DPPH·清除率最高，为75.47±0.27％，且DPPH·清除率 与其余四种加酶量时的清除率有明显差异(P＜0.05)。
2.3胰蛋白酶分别在1：20、1：30、1：40、1：50、1：60料液比下酶 解，获得酶解产物，冻干。结果如图2所示，试验过程中，随着料液比的增 大，自由基清除率先升后降。小于1：40时，酶解物的DPPH·清除率升高。 大于1：40时，酶解物的DPPH·清除率逐渐降低。料液比1：40时，DPPH·清 除率最高，为76.24±0.36％，与其余四组有明显差异(P＜0.05)。
2.4正交试验
随机组合酶解时间(3h、4h、5h)、加酶量(2％、3％、4％)、料液比 (1：30、1：40、1：50)，在这9种不同组合条件下对厚壳贻贝进行酶解， 比较各组抗氧化活性。结果如表7所示，通过比较9种条件下厚壳贻贝酶解 物活性，发现酶解时间影响最大，料液比次之，加酶量最小。由K值(同一 因素试验结果之和)可以看出，A2B2C2为最佳组合，条件为：酶解时间4h， 料液比1：40，加酶量3％。以试验得到的最佳组合为条件，对厚壳贻贝进 行酶解，所得产物DPPH自由基清除率为76.87±0.58％，符合实验预测。
表7正交试验结果
3、厚壳贻贝抗氧化肽分离纯化结果
3.1超滤分段结果
将厚壳贻贝用胰蛋白酶酶解，超滤得5个组分：M-Ⅰ(＜1kDa)、M-Ⅱ (1kDa～3kDa)、M-Ⅲ(3kDa～5kDa)、M-Ⅳ(5kDa～10kDa)、M-Ⅴ(＞ 10kDa)，浓缩，冻干。样品配制成5mg/mL，比较其自由基清除能力。结 果如图3所示，在5mg/mL浓度下，以超滤前原液作对比，比较各组分活性。 M-Ⅱ组分DPPH自由基清除能力与超滤前原液相差不大，无明显差异。M-Ⅲ、 M-Ⅳ和M-Ⅴ组分比超滤前原液清除率低。M-Ⅰ组分DPPH自由基清除能力 最强，为80.94±1.54％，显著高于组分M-Ⅱ、M-Ⅲ、M-Ⅳ和M-Ⅴ，比超 滤前的原液清除率高，且与其他各组均有明显差异(P＜0.05)。在5mg/mL 浓度下，M-Ⅱ组分HO自由基清除能力与超滤前原液相差不大，无明显差异。 M-Ⅲ、M-Ⅳ和M-Ⅴ组分比超滤前原液清除率低。M-Ⅰ组分HO自由基清除 能力最强，清除能力达到52.93±1.90％，显著高于组分M-Ⅱ、M-Ⅲ、M-Ⅳ、 M-Ⅴ，比超滤前的原液HO自由基清除率高，且与其他各组均有明显差异(P ＜0.05)。在5mg/mL浓度下，M-Ⅱ组分ABTS自由基清除能力与超滤前原 液相差不大，无明显差异。M-Ⅲ、M-Ⅳ和M-Ⅴ组分比超滤前原液清除率低。 M-Ⅰ组分ABTS自由基清除能力最强，清除能力达到89.62±0.41％，显著 高于组分M-Ⅱ、M-Ⅲ、M-Ⅳ、M-Ⅴ，比超滤前的原液ABTS自由基清除率 高，且与其他各组均有明显差异(P＜0.05)。综上，M-Ⅰ组分(MW＜1kDa) 各项抗氧化活性最好，因此选择M-Ⅰ组分进行后续分离纯化。
3.2 QFF离子交换层析结果
将M-Ⅰ组进行QFF柱层析。样品用Tris-HCl(0～0.5M NaCl)缓冲液、 逐步洗脱出5个峰，如图4所示，取名为M-Ⅰ-1、M-Ⅰ-2、M-Ⅰ-3、M-Ⅰ-4、 M-Ⅰ-5。将所得到各个组分进行旋蒸，透析，冻干。进行下一步实验。
经过透析除盐后的各组分多肽，样品配置成1mg/mL，以过柱前M-Ⅰ 组分作对比，比较不同组分自由基清除活性。结果如图5所示，M-Ⅰ-4组 分DPPH自由基清除能力与M-Ⅰ相差不大，无明显差异。M-Ⅰ-1、M-Ⅰ-2、 M-Ⅰ-3组分比M-Ⅰ清除率低。M-Ⅰ-5的DPPH自由基清除能力最强，清除 能力达到50.33±1.44％，比M-Ⅰ、M-Ⅰ-1、M-Ⅰ-2、M-Ⅰ-3、M-Ⅰ-4活性 强，且有明显差异(P＜0.05)。经过透析除盐后的各组分多肽，样品配置成 1mg/mL。以过柱前M-Ⅰ组分作对比，M-Ⅰ-1、M-Ⅰ-2、M-Ⅰ-3、M-Ⅰ-4 组分均比其清除率低。M-Ⅰ-5的HO自由基清除能力最强，清除能力达到 41.51±1.89％，比M-Ⅰ-2、M-Ⅰ-3、M-Ⅰ-4、M-Ⅰ-5活性强，比过QFF柱 前M-Ⅰ组分的HO自由基清除率高，且与其他各组均有明显差异(P＜0.05)。 经过透析除盐后的各组分多肽，样品配置成1mg/mL。以过柱前M-Ⅰ组分 作对比，M-Ⅰ-2组分ABTS自由基清除能力较好，M-Ⅰ-4组分与其相差不 大，M-Ⅰ-1、M-Ⅰ-3组分比其清除率低。M-Ⅰ-5的ABTS自由基清除能力 最强，清除能力达到87.62±0.58％，显著高于其余组分且有明显差异(P＜ 0.05)。综上，M-Ⅰ-5组分抗氧化活性最好，对M-Ⅰ-5进行后续分离纯化。
3.3 Sephadex G-15凝胶层析结果
将M-Ⅰ-5组分过Sephadex G-15凝胶柱，214nm处检测，如图6所示 得到组分M-Ⅰ-5-1和M-Ⅰ-5-2。将分离得到的组分进行活性测定。
将样品配制成1mg/mL。以过柱前M-Ⅰ-5组分作对比，结果如图7所 示，M-Ⅰ-5-1的DPPH自由基清除能力最强，为54.17±1.23％，显著高于 M-Ⅰ-5-2，比M-Ⅰ-5组分的DPPH自由基清除率高，与各组均有明显差异 (P＜0.05)。将样品配制成1mg/mL。以过柱前M-Ⅰ-5组分作为对比，不 同组分的HO自由基清除能力不同，其中M-Ⅰ-5-1的HO自由基清除能力较 好，清除能力达到45.28±1.89％，显著高于M-Ⅰ-5-2，比过凝胶柱柱前 M-Ⅰ-5组分的HO自由基清除率高，且与其他各组均有明显差异(P＜0.05)。 将样品配制成1mg/mL。以过柱前M-Ⅰ-5组分作为对比，M-Ⅰ-5-1的ABTS 自由基清除能力较好，清除能力达到88.86±0.29％，显著高于M-Ⅰ-5-2， 比M-Ⅰ-5组分的ABTS自由基清除率高，与各组均有明显差异(P＜0.05)。 综上，M-Ⅰ-5-1组分各项抗氧化活性最好，对M-Ⅰ-5-1进行后续分离纯化。
3.4高效液相色谱结果
将M-Ⅰ-5-1经高效液相分析，经测序得到2条多肽，其出峰时间、氨 基酸序列及分子量如表8和图8所示。
表8多肽H1、H5的出峰时间、序列和分子量
4、纯化多肽的抗氧化活性分析
4.1自由基清除活性
选取谷胱甘肽(GSH)为阳性对照，以DPPH·、HO·、ABTS·、超氧 阴离子自由基(O2 -·)清除率评价厚壳贻贝纯肽自由基清除活性，测定EC50值，结果如表9所示，依据自由基清除活性来看，多肽H1和H5体外抗氧 化能力较强。
表9多肽的自由基清除活性
4.2脂质过氧化抑制测定
对2条多肽进行脂质过氧化抑制作用试验，结果如图9所示，相较于空 白对照组，2条多肽在500nm处的吸光值均明显减小(P＜0.05)。在7天的 孵育过程中，多肽H1的吸光度值最接近谷胱甘肽(GSH)，对脂质过氧化能 起到抑制作用。
5、多肽稳定性测定结果
5.1温度对厚壳贻贝多肽稳定性的影响结果
将厚壳贻贝抗氧化肽H1和H5在不同温度条件下分别处理1h，继而测 定自由基清除活性，结果如图9所示，多肽H1在20、40、60、80、100℃ 处理后，在不同温度下其ABTS自由基清除率活性没有显著变化(P＜0.05)。 相同处理下，多肽H5的ABTS自由基清除率活性也没有显著变化(P＜0.05)。 说明厚壳贻贝抗氧化肽H1和H5均具有较好的热稳定性。
5.2体外模拟胃肠消化对厚壳贻贝多肽抗氧化活性的影响结果
结果如图10所示，在胃消化过程中，试验显示ABTS自由基清除率逐 渐降低，在肠消化过程中，ABTS自由基清除活性变化不大。从模拟消化开 始至结束，多肽H1和H5的ABTS自由清除能力分别下降2.62±0.14％、2.77 ±0.08％，总体上来看略有下降，但下降幅度很小。从厚壳贻贝多肽模拟胃 肠道消化后的抗氧化活性来看，其具有较好的耐消化性。
实施例2
一、材料和方法
1、实验材料
H1：Leu-Ala-Ala-Ser-His
H5：Ser-Pro-Phe-Asn-Phe
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，由中科院上海细胞库提供
2、实验方法
2.1建立氧化损伤模型
(1)接种：选对数生长期的HUVEC细胞，将细胞接种于96孔板上， 密度为1.5×104个细胞/孔，每孔含180μL培养基，37℃、5％CO2条件下 孵育24h。
(2)加样：预先分组，空白组加入20μL细胞培养基，实验组加入 20μL H2O2，终浓度分别为(100、200、300、400、500、600、700、800μ M)。37℃、5％CO2条件下孵育4h。
(3)存活率测试：每孔均加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培 养4h，弃去孔中溶液后，每孔加入150μL的DMSO，570nm测吸光值。 MTT法测细胞存活率，公式为：
2.2多肽对HUVECs增殖影响
除加样与2.1不同外，其余操作均相同，加样：预选分组，空白组加20 μLPBS，样品组加20μL多肽液(终浓度为200μM)。37℃、5％CO2条件下孵育24h。
2.3初筛对H2O2诱导损伤HUVEC细胞有保护作用的多肽
(1)接种：取对数生长期的HUVEC细胞，将细胞接种于96孔板上， 密度为1.5×104个细胞/孔，每孔含160μL培养基，37℃、5％CO2条件下 孵育24h。
(2)加样：预先分组，空白与模型组加入20μL PBS，阳性药组加入 20μL NAC(终浓度1mM)，样品组加入20μL多肽液(终浓度200μ M)。孵育24h后，空白组加入20μL PBS，其余各组加入20μL 500μ M的双氧水，培养4h.
(3)存活率测试同2.1。
2.4不同浓度多肽对H2O2诱导损伤HUVEC细胞的保护
除加样与2.3不同外，其余操作均相同，加样：样品组加入20μL多 肽液(终浓度为50、100、200μM)。
2.5抗氧化指标测定
以购自北京索莱宝科技有限公司的商品用试剂盒测定超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量、一氧化 氮(NO)含量、一氧化氮合成酶(NOS)、过氧化氢酶(CAT)含量、乳酸 脱氢酶(LDH)含量和总抗氧化能力(T-AOC)。所有指标均按试剂盒步骤 和标准进行测试。
2.6 DCFH-DA染色
细胞培养：取对数生长期的HUVEC细胞，将细胞接种于6孔板上，密 度为8.0×105个细胞/孔，每孔含1.6mL培养基，37℃、5％CO2条件下孵育 24h。加样量为10倍，其余操作同2.3(2)。
染色：弃去培养液，每个孔用PBS洗3次。避光下加入1mL/孔2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)缓冲液(10μM)，完全能够盖住 细胞。置于培养箱中孵育60min。结束染色后弃去含DCFH-DA探针的缓冲 液，用PBS轻轻冲洗HUVEC细胞两次，进行荧光检测。荧光倒置显微镜下 观察，进行分析。
2.7蛋白保护作用
采用Fenton反应对牛血清蛋白(BSA)进行损伤。之后加入多肽液，37℃ 孵育60min。考马斯亮蓝R-250染色法检测。
2.8 Western blot检测Nrf2及其相关的蛋白表达
二、结果分析
1、氧化损伤模型的建立
结果如图11所示，在实验条件为双氧水500μM，时间4h时，细胞存 活率为50.94±1.25％，与Control差异显著(P＜0.05)，符合实验预期，造模 成功。
2、多肽对HUVECs存活率影响
选用MTT法，判断多肽H1和H5对HUVECs存活率的影响。结果如 图11所示，在HUVECs培养时，加入多肽作用24h，细胞存活率均高于90％， 与Control组无显著差异，说明多肽H1和H5均对HUVECs没有毒性。厚 壳贻贝多肽在浓度为200μM时，不会抑制HUVECs的增殖.
3、筛选对HUVECs有保护作用的厚壳贻贝抗氧化肽
如图11所示，细胞存活率为参照。模型组细胞存活率较低，为48.66±1.47％，与Control组存在显著性差异，说明建模成功。H1和H5进行比较， 发现H1、H5能提高受损HUVEC细胞的存活率(P<0.01)，达到60.27±2.69％ 和58.43±3.43％。对H1和H5进行进一步得探索。
4、不同浓度厚壳贻贝多肽对HUVECs损伤的保护作用
如图12所示，模型组的细胞存活率较低，为48.58±1.16％，与Control 组存在显著性差异(P<0.01)，说明建模成功。与模型组相比，多肽样品组 (H1、H5)细胞存活率随浓度升高而升高，对H2O2损伤的HUVEC细胞的 保护作用加强。在50μM,100μM浓度下，效果不是很明显。当浓度加大到 200μM时，受损的HUVEC细胞存活率提高到60.34±1.87％和58.47±1.37％。从整体可以看出，多肽H1、H5的浓度与其对双氧水损伤的HUVECs 的作用为正相关。
5、抗氧化指标测定结果
5.1超氧化物歧化酶(SOD)含量测定
如图12所示，模型组SOD含量最低，与Control组存在显著差异 (P<0.01)，建模成功。与之相比，加入多肽(H1、H5)后，SOD含量提高， 从而保护受损得HUVEC细胞。H1、H5在50μM,100μM浓度下，效果不 是很明显。在100μM,200μM浓度下，可以看出具有显著增强效果(P<0.01)。 随着多肽浓度变大，SOD含量也逐步增加，对受损HUVECs保护作用增强。 从整体可以看出，HUVECs中SOD含量和对细胞的保护作用与多肽H1、H5 浓度呈正相关。
5.2丙二醛(MDA)含量测定
结果如图12所示，模型组MDA含量最高，与Control存在显著差异 (P<0.01)，建模成功。与之相比，加入多肽(H1、H5)后，MDA含量降 低，从而保护受损的HUVECs。H1、H5在50μM浓度下，效果不是很明显。 在100μM,200μM浓度下，可以看出具有显著降低作用(P<0.01)。随着多 肽浓度变大，MDA含量逐步降低，对受损HUVECs保护作用增强。从整体 可以看出，HUVECs中MDA含量与多肽H1、H5浓度呈负相关，其保护作 用与多肽H1、H5浓度呈正相关。
5.3谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量测定
如图13所示，模型组GSH-PX含量最低，与Control存在显著差异 (P<0.01)，建模成功。与之相比，加入多肽(H1、H5)后，GSH-PX含量 增多，从而保护受损的HUVECs。H1、H5在50μM浓度下，效果不是很明 显。在100μM,200μM浓度下，可以看出具有显著增强作用(P<0.01)。随 着多肽浓度变大，GSH-PX含量逐步增加，对受损HUVECs保护作用增强。 从整体可以看出，HUVECs中GSH-PX含量和对细胞的保护作用与多肽H1、 H5浓度呈正相关。
5.4一氧化氮(NO)含量测定
如图13所示，模型组NO含量最低，与Control组存在显著差异(P<0.01)， 建模成功。与之相比，加入多肽(H1、H5)后，NO含量增多，从而保护受 损的HUVECs。H1、H5在50μM浓度下，效果不是很明显。在100μM,200 μM浓度下，可以看出具有显著增强作用(P<0.01)。随着多肽浓度变大，NO 含量逐步增加，对受损HUVECs保护作用增强。从整体可以看出，HUVECs中NO含量和对细胞的保护作用与多肽H1、H5浓度呈正相关。
5.5一氧化氮合成酶(NOS)含量测定
图17中A为不同条件处理牛血清蛋白(BSA)的SDS-PAGE图，经Fenton 反应损伤牛血清蛋白的模型组条带与正常组相比能清晰的看到变浅，加入 2.5mM，5mM，10mM多肽(H1，H5)保护后条带与模型组相比较深，与 正常组相比较浅，且随着浓度的增加变化越明显，说明模型较为成功。从图 17中B各条带的相对强度分析也可以看出，模型组谱带强度降低，与空白 组相比十分明显(P<0.01)，说明所建模型可用。与模型组相比，多肽样品 组(H1，H5)随着多肽样品浓度的增加，谱带强度逐渐增加。从结果来看， 厚壳贻贝多肽H1，H5能保护羟自由基诱导损伤牛血清蛋白(BSA)的作用， 且呈浓度依赖性。
5.6过氧化氢酶(CAT)含量测定
如图15所示，模型组CAT含量最低，与Control组存在显著差异(P<0.01), 建模成功。与之相比，加入多肽(H1、H5)后，CAT含量增加，从而保护 受损的HUVECs。H1、H5在50μM浓度下，效果不是很明显。在100μM,200 μM浓度下，可以看出具有显著升高作用(P<0.01)。随着多肽浓度变大，CAT 含量逐步增加，对受损HUVECs保护作用增强。从整体可以看出，HUVECs 中CAT含量和对细胞的保护作用与多肽H1、H5浓度呈正相关。
5.7乳酸脱氢酶(LDH)含量测定
结果如图15所示，模型组LDH含量最高，与Control组存在显著差异 (P<0.01)，建模成功。与之相比，加入多肽(H1、H5)后，LDH含量减少， 从而保护受损的HUVECs。H1、H5在50μM浓度下，效果不是很明显。在 100μM,200μM浓度下，可以看出具有显著降低作用(P<0.01)。随着多肽 浓度变大，LDH含量逐步降低，对受损HUVECs保护作用增强。从整体可 以看出，HUVECs中LDH含量与多肽H1、H5浓度呈负相关，其保护作用 与多肽H1、H5浓度呈正相关。
5.8总抗氧化能力(T-AOC)测定
如图15所示，模型组T-AOC水平最低，与Control组存在显著差异 (P<0.01)，建模成功。与之相比，加入多肽(H1、H5)后，T-AOC增加， 从而保护受损的HUVECs。H1、H5在50μM浓度下，效果不是很明显。 在100μM、200μM浓度下，可以看出具有显著升高作用(P<0.01)。随着多肽浓度变大，T-AOC水平逐步提高，对受损HUVECs保护作用增强。 从整体可以看出，HUVECs中T-AOC水平和对细胞的保护作用与多肽H1、 H5浓度呈正相关。
6、DCFH-DA染色结果
如图16所示，用50μM,100μM,200μM多肽(H1、H5)作用于受损 的HUVECs，进一步进行DCFH-DA染色。染色后，可以观察到模型组荧光 含量最高，相比于其余各组都很明显，建模成功。与之相比较，多肽样品组 (H1，H5)荧光强度都显示出不同程度的减弱。在50μM浓度下，效果不 是很明显。在100μM,200μM浓度下，可以看出具有明显作用。ROS含量 降低，体现出H1，H5对HUVECs的保护。厚壳贻贝多肽H1，H5能降低氧 化损伤造成的细胞内ROS的升高，且体现剂量依赖性。
7、蛋白保护作用结果
图17中A为不同条件处理牛血清蛋白(BSA)的SDS-PAGE图，经Fenton 反应损伤牛血清蛋白的模型组条带与正常组相比能清晰的看到变浅，加入 2.5mM，5mM，10mM多肽(H1，H5)保护后条带与模型组相比较深，与 正常组相比较浅，且随着浓度的增加变化越明显，说明模型较为成功。从图 17中B各条带的相对强度分析也可以看出，模型组谱带强度降低，与空白 组相比十分明显(P<0.01)，说明所建模型可用。与模型组相比，多肽样品 组(H1，H5)随着多肽样品浓度的增加，谱带强度逐渐增加。从结果来看， 厚壳贻贝多肽H1，H5能保护羟自由基诱导损伤牛血清蛋白(BSA)的作用， 且呈浓度依赖性。
8、Western blot检测Nrf2及其相关蛋白的表达结果
结果如图18所示，与空白组相比，模型组中Keap1表达升高，Nrf2蛋 白表达下降，进一步降低了受Nrf2调节的下游抗氧化剂蛋白质的含量，下 游蛋白HO-1、NQO1和GCLM表达明显降低(P＜0.01)，说明双氧水对 HUVEC细胞造成损伤，抑制了Nrf2通路的表达。在加入多肽H1和H5后， 与模型组相比，Keap1表达降低，Nrf2蛋白表达上升，同时使得下游蛋白HO-1、NQO1和GCLM表达明显上升(P＜0.01)，且呈现浓度依赖性。结 果表明多肽H1和H5可能是通过Keap1/Nrf2通路发挥保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保护功能的抗氧化肽及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Ala Ala Ser His
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Pro Phe Asn Phe
1 5
Claims (8)
1.一组从厚壳贻贝肉中分离的具有肝保护功能的抗氧化肽，其特征在于，所述抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述抗氧化肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将洁净的厚壳贻贝肉脱脂后烘干和粉碎，得脱脂肉粉；
(2)利用胰蛋白酶对所述脱脂肉粉进行酶解，收集分子量小于1kDa的酶解液；
(3)将所述酶解液依次经过Q-琼脂糖凝胶FF离子交换层析和Sephadex G-15层析，于214nm处收集各峰，收集液中包含所述抗氧化肽。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述脱脂包括利用乙酸乙酯脱脂。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述酶解时，胰蛋白酶的加酶量为2～4％，在40℃条件下酶解3～5h。
5.根据权利要求2或4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述酶解前，将所述脱脂肉粉与水混合，所述脱脂肉粉与水的体积比为1:30～50。
6.一种抗氧化剂，其特征在于，所述抗氧化剂以权利要求1所述抗氧化肽为有效成分。
7.权利要求1所述抗氧化肽或权利要求2～5任一项所述制备方法制备得到的抗氧化肽在制备对氧化损伤细胞具有保护作用的制剂中的应用。
8.一种对氧化损伤细胞具有保护作用的制剂，其特征在于，所述制剂以权利要求1所述抗氧化肽或权利要求2～5任一项所述制备方法制备得到的抗氧化肽为有效成分。
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| CN112457387A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-03-09 | 舟山市和朴海洋生物科技有限公司 | 一种厚壳贻贝寡肽及其用途 |
-
2021
- 2021-12-07 CN CN202111484317.3A patent/CN114057837B/zh active Active
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