CN106434804B - 一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106434804B CN106434804B CN201610867457.1A CN201610867457A CN106434804B CN 106434804 B CN106434804 B CN 106434804B CN 201610867457 A CN201610867457 A CN 201610867457A CN 106434804 B CN106434804 B CN 106434804B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- flesh
- fish
- protein peptides
- preparation
- enzymolysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 69
- 239000002002 slurry Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 28
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims abstract description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 claims description 7
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 claims description 7
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 claims description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 5
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 241000276457 Gadidae Species 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 abstract 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 abstract 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 10
- -1 oxygen radical Chemical class 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 8
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 5
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O KPYAOIVPJKPIOU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 4
- 239000007970 homogeneous dispersion Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N Trolox Chemical compound O1C(C)(C(O)=O)CCC2=C1C(C)=C(C)C(O)=C2C GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical class [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- HAUGRYOERYOXHX-UHFFFAOYSA-N Alloxazine Chemical compound C1=CC=C2N=C(C(=O)NC(=O)N3)C3=NC2=C1 HAUGRYOERYOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OCZVHBZNPVABKX-UHFFFAOYSA-N 1,1-diphenyl-2-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazine;ethanol Chemical compound CCO.[O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1NN(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OCZVHBZNPVABKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LXEKPEMOWBOYRF-QDBORUFSSA-N AAPH Chemical compound Cl.Cl.NC(=N)C(C)(C)\N=N\C(C)(C)C(N)=N LXEKPEMOWBOYRF-QDBORUFSSA-N 0.000 description 1
- CPMKYMGGYUFOHS-FSPLSTOPSA-N Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CPMKYMGGYUFOHS-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 108010028690 Fish Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 229910021577 Iron(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000021245 dietary protein Nutrition 0.000 description 1
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229910001448 ferrous ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 239000008236 heating water Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000019394 potassium persulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/10—General cosmetic use
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
- A61K2800/52—Stabilizers
- A61K2800/522—Antioxidants; Radical scavengers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Birds (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法，属于水产品食品加工技术领域。本发明蛋白肽的制备方法包括：(1)超声处理去脂的鱼肉浆液；(2)加入复合蛋白酶进行酶解，酶解过程无需添加酸或碱调节pH值；(3)对酶解液离心并取上清液超滤；(4)滤液过柱分离，收集洗脱峰；洗脱液通过反向高效液相色谱进行分离，即得。本发明方法操作简单，适于产业化生产，制备过程无需添加酸或碱调节pH值，且不添加任何添加剂，较好地保持产品的功能特性，产品得率高，风味好，所制得的蛋白肽具有优异的抗氧化功能，可广泛应用于特需食品和营养食品的制造。
Description
技术领域
本发明涉及水产食品加工技术领域，具体地涉及一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法。
背景技术
蛋白质经过酶解得到多肽，使其蛋白质的结构发生改变，疏水区的活性官能基团暴露，随着肽键的裂解，小分子蛋白肽和氨基酸增加，从而可以提供质子或电子源，保持较高的氧化还原电位，使其具有清除活性自由基的能力。氧化对需氧生物特别是脊椎动物和人类是一个重要的代谢过程，但是它却导致了自由基的形成。活性氧自由基(ROS)被认为能引起氧化应激。在食品体系中，脂类或蛋白质可能会受到ROS的攻击经历氧化过程，从而导致食品产生不愉快味道，颜色发暗，同时也可能产生潜在的毒性终产物。抗氧化多肽的应用能防止食品成分由于捐献电子给活性氧自由基以及中和活性氧自由基的负面作用而变质。抗氧化肽在医学、化妆品、生物、食品领域有广泛的应用价值。
化学合成抗氧化肽不同程度上损伤人体的肝脏、肾脏等器官，部分国家和地区已经明确限量或禁止使用。因此，研发高效、安全的天然抗氧化剂成为热点。食用级抗氧化肽的安全性要求更高，抗氧化性较其他体内抗氧化生物分子更为显著，可以稳定脂质或含脂质产品。天然的抗氧化多肽因分子量小、易吸收、活性强等特点。目前天然抗氧化肽主要是通过酶解大豆蛋白、奶酪、乳清蛋白、动物胶、面筋等各种食物蛋白获得。最近几年发展到海洋产品如海藻、虾皮、两栖动物裸露皮肤分泌物、真菌等。
有关天然抗氧化活性肽的制备方法，现有技术的不足在于大多数蛋白肽酶解过程中通过添加酸或碱调节pH，明显地影响产品的风味，同时产品的灰分较高。
目前还没有以鱼肉为原料制备抗氧化肽的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种具有抗氧化活性的蛋白肽。
本发明的另一目的在于提供上述蛋白肽的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述蛋白肽的应用。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法，包括以下步骤:
(1)超声处理去脂的鱼肉浆液；
(2)加入复合蛋白酶进行酶解，酶解过程无需添加酸或碱调节pH值；
(3)对酶解液离心并取上清液进行超滤；
(4)滤液过柱层析分离，收集洗脱峰，洗脱液通过反向高效液相色谱进行分离即得。
可选的，所述鱼肉为淡水鱼肉或海水鱼肉。在本发明的实施例中选用鳙鱼和鳕鱼。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)所述去脂的鱼肉浆液通过以下方法制备得到：洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入0.8-2.0倍鱼肉重量的水，在85-95℃下水浴10-15min，再用分散均质机在8000-10000rpm下匀浆1-3min，得鱼肉浆液；通过6000-8000g离心10-15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液。本领域技术人员应当理解，去脂的鱼肉浆液的制备方法包括但不限于上述方法。
步骤(1)超声处理方法为将去脂的鱼肉浆液温度调至50-65℃，30-45kH的超声频率处理15-25min。
本发明通过大量实验发现，鱼肉浆液温度调至50-65℃进行超声处理，效果最好，能够较好地改变鱼肉蛋白的组织结构，使下面酶解步骤在较短酶解时间和较小的用酶量就能够获得优质的蛋白肽。
步骤(2)酶解加入的复合蛋白酶为碱性蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶，三者质量比为(2-3):(1-2):(1-2)，且加入的复合蛋白酶总质量与鱼肉质量比为1：300-500。
优选地，所述碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L碱性蛋白酶。
步骤(2)中酶解条件为55-65℃酶解2-5h。
步骤(2)酶解后将酶解液在95-100℃下保温3-5min，冷却至室温。
步骤(3)离心条件为5000-7000g 10-15min；采用2000D的超滤膜进行超滤。
在本发明的一个实施例中，是利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液(0-5min乙腈溶液为5％，5-40min乙腈溶液从5％到40％，40-50min乙腈溶液从40％到90％)作为洗脱液，流速为5-8mL/min，得到含抗氧化活性肽的溶液。
制备方法制备得到的蛋白肽属于本发明的保护范围。在制得的蛋白肽中，氨基酸序列为Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu(SEQ ID NO.1)和Lys-Gln-Ser-Asp-Val(SEQ IDNO.2)的肽的含量大于40％。
通过进一步功能验证，发现上述肽具有优异的抗氧化活性。进而本发明提供一种具有抗氧化活性的蛋白肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明上述方法制得的蛋白肽或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示肽的抗氧化用途属于本发明的保护范围。
含有本发明上述方法制得的蛋白肽或氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示肽的食品、保健品、化妆品或药物属于本发明的保护范围。
本发明的优点在于：
(1)本发明开发的生产工艺中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，较易实现产业化生产。
(2)本发明鱼肉抗氧化活性肽中Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量40％以上。具有很好的抗氧化功能，其清除DPPH自由基能力可达92％以上。
(3)本发明鱼肉抗氧化活性肽是以天然产物为原料、经过食品级复合蛋白酶酶解获得的产物，将其作为食品、化妆品的配料，安全，无毒。
(4)本发明鱼肉抗氧化活性肽制备方法简单，易实现产业化生产，有效地解决了目前抗氧化多肽难以实现产业化生产的问题。
(5)本发明开发的抗氧化肽具有较好的风味和热稳定性，能广泛应用于功能食品。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1鳙鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备
(1)将鳙鱼鱼肉100克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆,得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1.5倍鱼肉重量的水150克，在95℃中水浴20min，再用分散均质机在10000rpm下匀浆2min，得到鱼肉浆液250克。通过6000g离心10～min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液230克。将去脂鱼肉浆液的温度调整到55℃，于超声波发生器中经超声波(频率为35kH)处理15分钟。
(2)调节步骤(1)鱼肉浆液的温度为55℃，然后按照复合蛋白酶与鱼肉质量比为1：300的比例加入复合蛋白酶(碱性蛋白酶：风味蛋白酶:菠萝蛋白酶＝2:1：1)0.33克，在55℃下酶解2小时，然后在95℃下保温3min，冷却至室温，再在5000g条件下离心15min，收集上清液；
(3)利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过Sephadex G-25(长60cm，直径4.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行测量，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液；
(4)将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。
通过LC-MS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量为40.3％。
实施例2鳙鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备
(1)将鳙鱼鱼肉500克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入2.0倍鱼肉重量的水1000克，在90℃中水浴20min，再用分散均质机在12000rpm下匀浆2min，得到鱼肉浆液1500克。通过8000g离心10min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液1430克。将去脂鱼肉浆液的温度调整到60℃，于超声波发生器中经超声波(频率为45kH)处理20分钟。
(2)调节(1)鱼肉浆液的温度为60℃，然后按照复合蛋白酶(碱性蛋白酶：风味蛋白酶:菠萝蛋白酶＝2:2：1)与鱼肉质量比为1：400加入复合蛋白酶1.25克，在65℃下酶解3小时，然后在95℃下保温4min，冷却至室温，再在5000g条件下离心15min，收集上清液；
(3)利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过Sephadex G-25(长60cm，直径4.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高校液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是为5～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液；
(4)将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得鱼肉抗氧化活性肽。
通过LC-MS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量为41.6％。
实施例3鳕鱼肉抗氧化活性肽的制备
(1)将鳕鱼鱼肉1000克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入2.0倍鱼肉重量的水2000克，在90℃中水浴15min，用分散均质机在12000rpm匀浆2min，得到鱼肉浆液3000克。通过6000g离心15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉浆液2880克。将去脂鱼肉浆液的温度调整到60℃，于超声波发生器中经超声波(频率为40kH)处理15分钟。
(2)调节步骤(1)鱼肉浆液的温度为65℃，然后按照复合蛋白酶(碱性蛋白酶：风味蛋白酶:菠萝蛋白酶＝3:1：1)与鱼肉质量比为1：400加入2.5克，在65℃下酶解4小时，然后在95℃下保温5min，冷却至室温，再在5000g条件下离心15min，收集上清液；
(3)利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过Sephadex G-25((长60cm，直径4.6cm)凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行测量，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高校液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是为5～90％乙腈溶液作为洗脱液，流速为1mL/min，得到高活性的抗氧化肽溶液；
(4)将步骤(3)得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽，
通过LC-MS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Lys-Ala-Gln–Arg-Leu-Lys-Glu和Lys-Gln-Ser-Asp-Val的肽的含量为40.9％。
实施例4本发明鱼肉抗氧化活性肽的抗氧化活性的测定试验
试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的鱼肉抗氧化活性肽。
按照如下方法进行：
(1)清除DPPH自由基能力：取1mg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)还原力测定：取1mg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH 6.6)2.5mL和1％(质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。
(3)氧化自由基吸收能力(ORAC)：不同浓度的抗氧化活性肽溶液10μL与75mM磷酸盐缓冲液90μL(pH 7.4)及200nM的荧光试剂50μL充分混合，然后在37℃温育15min，再加入80mM的AAPH溶液50μL。用酶标仪每分钟读取荧光值共进行100min。荧光的激发波长和发射波长分别是485nm和538nm。用磷酸缓冲溶液代替样品作为空白。以Trolox作为标准对照，使用的浓度为0，2，4，8，12，16μM，绘制荧光淬灭曲线，并计算荧光淬灭曲线下的积分面积(AUC)。AUC的计算公式如下：
其中：f0是0min时荧光值，fi是第i min时的荧光值。
ORAC值用样品曲线的斜率与Trolox曲线的斜率之比，ORAC值得单位表示为μMTrolox/mg肽。
(4)清除ABTS自由基的测定
称取17mg过硫酸钾加26mL水得过硫酸钾溶液，取上述过硫酸钾溶液2.6mL，加入10mg ABTS，配制成ABTS母液，暗处放置12-16h后，取上述母液0.8mL，0.2M pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释至在734nm下读数为0.70±0.02。取1.0mg/mL的样品溶液0.04mL与4mL稀释后的ABTS溶液混合震荡30s后避光放置6min在734nm下检测其吸光值，吸光值越小代表自由基清除能力越强。空白用蒸馏水代替样品。清除ABTS自由基能力计算公式如下：
ABTS自由基清除率％＝(1-A1-734/A2-734)×100
其中A1-734为样品在734nm下的读数，A2-734为对照品在734nm下的读数。
(5)Fe2+螯合能力的测定
取蛋白质浓度为1mg/mL的酶解产物待测液1.0mL与3.7mL浓度为99.5％的无水乙醇及0.1mL 2mM FeCl2混匀，加入5mM的啡咯嗪0.2mL启动反应，在室温下静置20分钟后在562nm出处检测吸光值，吸光值越小表示金属螯合能力越强。对照组中以0.1mL去离子水代替酶解产物溶液。亚铁离子螯合能力的计算公式如下：
Fe2+螯合率％＝(1-A1/A2)×100
其中A1为对照的吸光值，A2为样品的吸光值。
结果(见表1)本发明鱼肉抗氧化活性肽具有较好的抗氧化能力，在1mg/mL的条件下，其清除DPPH自由基能力达到92％以上，还原力达到0.88以上，其ORAC为18.5以上,ABTS自由基清除率85％以上，Fe2+螯合能力91％以上。是一种较理想的抗氧化肽。
表1本发明鱼肉抗氧化活性肽的分子量及抗氧化活性试验结果
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种具有抗氧化活性的蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）超声处理去脂的鱼肉浆液；所述去脂的鱼肉浆液是通过将鱼肉打成浆、加入水均质后，再离心去除上层脂肪得到；超声处理方法为将去脂的鱼肉浆液温度调至50-65℃，30-45kH的超声频率处理15-25 min；所述鱼肉为鳙鱼肉或鳕鱼肉；
（2）加入复合蛋白酶进行酶解，酶解过程无需添加酸或碱调节pH值；所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶，三者质量比为（2-3）:（1-2）: 1，且加入的复合蛋白酶总质量与鱼肉质量比为1：300-500；酶解条件为55-65℃酶解2-5 h；酶解后将酶解液在95-100℃下保温3-5 min，冷却至室温；
（3）对酶解液离心并取上清液，采用2000D的超滤膜进行超滤；
（4）滤液经过长60cm，直径4.6cm的 Sephadex G-25凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为0.8mL/min，洗脱峰在280nm下进行测量，收集第1个洗脱峰，洗脱液通过反向高效液相色谱进行分离即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）离心条件为5000-7000g 10-15min。
3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法制备得到的蛋白肽。
4.一种具有抗氧化活性的蛋白肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求3或4所述的蛋白肽的非疾病治疗目的的抗氧化用途。
6.含有权利要求3或4所述蛋白肽的食品、保健品、化妆品或药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610867457.1A CN106434804B (zh) | 2016-09-29 | 2016-09-29 | 一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610867457.1A CN106434804B (zh) | 2016-09-29 | 2016-09-29 | 一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106434804A CN106434804A (zh) | 2017-02-22 |
| CN106434804B true CN106434804B (zh) | 2018-01-12 |
Family
ID=58171516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610867457.1A Active CN106434804B (zh) | 2016-09-29 | 2016-09-29 | 一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106434804B (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107164444B (zh) * | 2017-06-08 | 2020-10-20 | 天津市宽达水产食品有限公司 | 具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽及其制备方法与应用 |
| CN107904275A (zh) * | 2017-12-31 | 2018-04-13 | 舟山市常青海洋食品有限公司 | 一种利用北太鱿鱼生产蛋白小肽的方法 |
| CN108103132A (zh) * | 2017-12-31 | 2018-06-01 | 舟山市常青海洋食品有限公司 | 一种鱿鱼蛋白小肽的制备方法 |
| CN107937468B (zh) * | 2018-01-15 | 2021-05-25 | 中国海洋大学 | 一种鳕鱼源功能低苦味寡肽及其制备方法 |
| CN108794574B (zh) * | 2018-06-06 | 2021-03-19 | 华中科技大学 | 一种抗氧化的活性肽及其应用 |
| CN109402075A (zh) * | 2018-11-28 | 2019-03-01 | 深圳先进技术研究院 | 一种用于清除氧自由基的小分子蛋白质及其应用 |
| CN109457010A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-03-12 | 武汉天天好生物制品有限公司 | 一种抗氧化富硒茶肽及其制备方法和应用 |
| CN112741203B (zh) * | 2021-01-19 | 2022-09-06 | 西南民族大学 | 一种肝磷酸化肽的制备方法、肝磷酸化肽、抗氧化肉制品及制备方法 |
| CN114711324A (zh) * | 2021-02-04 | 2022-07-08 | 云南海王水产有限公司 | 一种具有促进益生菌生长和抗氧化作用的鱼鳞胶原蛋白肽及制备方法 |
| CN114836491B (zh) * | 2022-05-30 | 2023-03-14 | 广州恒雅生物化工有限公司 | 一种抗老亮肤的肌肽制备方法及其在化妆品的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104558115A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-04-29 | 浙江海洋学院 | 一种孔鳐鱼肉蛋白抗氧化多肽及其制备方法和用途 |
| CN104926925B (zh) * | 2015-03-18 | 2020-09-08 | 浙江海洋学院 | 一种带鱼鱼肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途 |
-
2016
- 2016-09-29 CN CN201610867457.1A patent/CN106434804B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106434804A (zh) | 2017-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106434804B (zh) | 一种具有抗氧化活性的蛋白肽及其制备方法 | |
| Ashaolu et al. | Phycocyanin, a super functional ingredient from algae; properties, purification characterization, and applications | |
| CN101787078B (zh) | 一种胶原蛋白多肽及其制备方法和用途 | |
| CN106632642B (zh) | 一种具有ace抑制和抗氧化功能的甲鱼蛋白肽及其制备方法 | |
| CN103073621B (zh) | 一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途 | |
| CN107164444A (zh) | 具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽及其制备方法与应用 | |
| CN108342441B (zh) | 一种缓解疲劳和抗氧化的牦牛骨蛋白肽及制备方法 | |
| CN104250285B (zh) | 一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽及其制备方法和用途 | |
| CN107779489A (zh) | 一种具有抗氧化和ace抑制功能的蚕蛹蛋白肽 | |
| ES2319475A1 (es) | Peptidos bioactivos identificados en hidrolizados enzimaticos de caseinas lacteas y procedimiento de obtencion. | |
| Zhang et al. | Ultrasonic pretreatment enhanced the glycation of ovotransferrin and improved its antibacterial activity | |
| CN110042138B (zh) | 一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法及其分离方法与用途 | |
| CN105463046B (zh) | 一种鳄鱼骨胶原蛋白肽粉的制备方法及其用途 | |
| Li et al. | The purification and identification of immunoregulatory peptides from oyster (Crassostrea hongkongensis) enzymatic hydrolysate | |
| WO2005012355A1 (es) | Péptidos bioactivos derivados de proteínas de la clara de huevo mediante hidrólisis enzimática | |
| CN104177477A (zh) | 一种鱼肉抗氧化活性肽及其制备方法 | |
| Petsantad et al. | The antioxidant potential of peptides obtained from the spotted babylon snail (Babylonia areolata) in treating human colon adenocarcinoma (Caco-2) cells | |
| Ma et al. | Effect of gelatin on gelation properties of oyster (Crassostrea gigas) protein | |
| Li et al. | Determination of the iron bioavailability, conformation, and rheology of iron‐binding proteins from Tegillarca granosa | |
| Polidori et al. | Differences of protein fractions among fresh, frozen and powdered donkey milk | |
| CN107245094B (zh) | 一种抗氧化肽及其分离制备方法和用途 | |
| KR20130099104A (ko) | 피부 콜라겐 생성 촉진제 | |
| Wang et al. | Structural properties, anti-fatigue and immunological effect of low molecular weight peptide from Monkfish | |
| RU2509775C1 (ru) | Средство, обладающее противоопухолевой, антикоагулянтной, ранозаживляющей, противовоспалительной, антиоксидантной активностью, способностью ингибировать коллагеназу и ангиотензинпревращающий фермент (апф), и способ его получения | |
| Shi et al. | Metabolic effects of a novel microfiltered native whey protein in diet-induced obese mice |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230506 Address after: A611F, No. 99, Wangfujing Street, Dongcheng District, Beijing, 100010 Patentee after: People's peptide Group Co.,Ltd. Address before: No. 60 Gulou Outer Street, Dongcheng District, Beijing, 100029 Patentee before: GUOTAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |