ES2319475A1 - Peptidos bioactivos identificados en hidrolizados enzimaticos de caseinas lacteas y procedimiento de obtencion. - Google Patents
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Abstract
Péptidos bioactivos identificados en hidrolizados enzimáticos de caseínas lácteas y procedimiento de obtención. La invención consiste en la producción de productos bioactivos derivados de las proteínas lácteas para producción de lactoproductos bioactivos derivados de proteínas de lacteas en especial caseinas. Los diez péptidos objeto de la patente se pueden obtener químicamente, biotecnológicamente o por tratamiento enzimático a partir de proteínas que los contengan y dan lugar a péptidos con actividad antimicrobiana, inhibidora de la enzima convertidora de la anqiotensina in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante. Estos productos nutraceúticos, ya sea como hidrolizado o como péptido biactivos, son tanto útiles para la industria alimentaria como para la farmacéutica.
Description
Péptidos bioactivos identificados en
hidrolizados enzimáticos de caseínas lácteas y procedimiento de
obtención.
La invención consiste en la producción de
productos bioactivos derivados de las proteínas lácteas. Estas
proteínas dan lugar, tras un tratamiento enzimático, a péptidos con
actividad antimicrobiana y/o actividad inhibidora de la enzima
convertidora de angiotensina (actividad IECA) in vitro y/o
actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante, que pueden
aplicarse a la industria alimentaria y farmacéutica.
El papel de la leche en la nutrición humana es
esencial desde el momento del nacimiento y constituye un alimento
con un alto valor nutritivo y funcional. El reciente desarrollo de
nuevas técnicas biotecnológicas y de separación permite el
fraccionamiento de distintos componentes de la leche para ser
usados con nuevos propósitos alimenticios o no alimenticios y, de
este modo, están apareciendo nuevas aplicaciones que contribuyen a
aumentar su consumo. Así, distintas empresas dedicadas a la
producción de proteínas aisladas a partir de fracciones de la
leche, están interesadas en aumentar y diversificar los usos de
algunos componentes, como las caseínas y las seroproteínas. Este es
el caso de las industrias dedicadas a la producción de
lactoferrina, utilizada como agente antimicrobiano y que ya se
utiliza en alimentos infantiles, yogures, suplementos alimenticios,
formulaciones especiales, productos dentales y dermatológicos. La
lactoferrina también se emplea por su actividad antimicrobiana como
aditivo en leche fresca para alargar su duración.
En los últimos años, los alimentos funcionales
han irrumpido con fuerza en el sector alimentario, debido a la
mayor concienciación de los consumidores de la relación existente
entre la dieta y la salud. Dentro de los ingredientes funcionales,
definidos como aquellos componentes que, incorporados al alimento,
ejercen actividades biológicas específicas que van más allá del
mero papel nutricional, ocupan un lugar destacado, por su
diversidad y multifuncionalidad, los péptidos bioactivos. Estos
péptidos corresponden a fragmentos inactivos dentro de la proteína
precursora, pero que tras liberarse mediante procesos de hidrólisis
in vivo y/o in vitro, ejercen distintas funciones
fisiológicas en el organismo. Desde su descubrimiento, en 1979, se
han descrito péptidos derivados de proteínas alimentarias con
diferentes actividades biológicas: antimicrobiana,
antihipertensiva, inmunomodulante, antitrombótica, opiácea,
antioxidante, etc. Estos péptidos tienen un potencial uso
alimentario y o farmacéutico y pueden liberarse mediante diversas
estrategias, siendo la hidrólisis enzimática y la fermentación
microbiana las más empleadas en la
actualidad.
actualidad.
Entre los péptidos bioactivos, cabe destacar
aquellos que ejercen propiedades antimicrobianas (R. Floris, I.
Recio, B. Berkhout, y S. Visser, Antibacterial and antiviral
effects of milk proteins and derivatives thereof, Current
Pharmaceutical Design, 2003, 9: 1257-1275). La
actividad antimicrobiana de la leche ha sido estudiada desde hace
mucho tiempo y tradicionalmente se ha atribuido a distintas
proteínas con actividad antimicrobiana presentes de este alimento
(inmunoglobulinas, lactoferrina, lactoperoxidasa, lisozima, etc.).
Sin embargo, recientemente, también se ha demostrado la actividad
antimicrobiana de péptidos derivados de proteínas lácteas. Aunque
hasta el momento no hay estudios concluyentes sobre el mecanismo de
acción de los péptidos antimicrobianos derivados de las proteínas
lácteas, resultados preliminares han descrito la capacidad de
algunas de estas secuencias bioactivas de interaccionar y lisar las
membranas bacterianas (D. Chapple, D. J. Mason, C. L. Joannou, E. W.
Odell, V. Gant, R. W. Evans, Structure-function
relationship of antibacterial synthetic peptides homologous to a
helical surface region on human lactoferrin against Escherichia
coli serotype O111, Infection and Immunity, 1998, 66,
2434-2440). Se han descrito péptidos con actividad
antimicrobiana obtenidos a partir de hidrolizados enzimáticos de
caseínas de origen bovino, como la
\alpha_{s2}-caseína (EP 1114060, Process for
producing cationic peptides from biological fluids) y la
\beta-caseína y \kappa-caseína
(WO99/26971, Antimicrobial peptides). Por procesos similares de
hidrólisis se han aislado e identificado péptidos con propiedades
antimicrobianas derivados de proteínas de suero, como la
lactoferrina (WO2004/089986, Antimicrobial peptide from transferrin
family).
Otro grupo de péptidos bioactivos de gran
importancia es el de los péptidos con actividad antihipertensiva
dada la elevada incidencia de enfermedades coronarias relacionadas
con la hipertensión en países desarrollados. Muchos de estos
péptidos actúan regulando el sistema
renina-angiotensina mediante la inhibición de la
enzima convertidora de angiotensina (ECA) (T. Takano, Milk derived
peptides and hypertension reduction, International Dairy Journal,
1998, 8: 375-381) aunque no se descarta que puedan
actuar mediante otros mecanismos. Se han descubierto distintos
péptidos con actividad inhibidora de la ECA (IECA), obtenidos a
partir de hidrolizados enzimáticos de caseínas (US 6514941, Method
of preparing a casein hydrolysate enriched in
anti-hypertensive peptides) y de proteínas de suero
lácteo (WO01/85984, Enzymatic treatment of whey proteins for the
production of antihypertensive peptides, the resulting products and
treatment of hypertension in mammals). Estudios sobre la relación
estructura/actividad de los péptidos con actividad antihipertensiva
han puesto de manifiesto el papel fundamental de ciertos
aminoácidos hidrofóbicos en el desarrollo de esta actividad (H.-S.
Cheung, F.-L. Wang, M. A. Ondetti, E. F. Sabo, y D. W. Cushman,
Binding of peptide substrates and inhibitors of
angiotensin-converting enzyme. Importance of the
COOH-terminal dipeptide sequence. Journal of
Biological Chemistry 1980, 255: 401-407). La
presencia de algunos de estos aminoácidos también ha sido
considerada como esencial en el desarrollo de la actividad
antioxidante y esta actividad ha adquirido una gran importancia en
los últimos años (H. M. Chen, K. Muramoto, F. Yamauchi, K. Fujimoto
y K. Nokihara, Antioxidative properties of
histidine-containing peptides designed from peptide
fragments found in the digests of a soybean protein, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46: 49-53).
Diferentes enfermedades degenerativas, como el cáncer, el Alzheimer,
las cataratas, o el propio envejecimiento están relacionadas con la
oxidación de componentes celulares, lípidos, proteínas o ADN. Estas
patologías pueden producirse como consecuencia del desequilibrio
entre agentes oxidantes y los sistemas antioxidantes del organismo,
por lo que la ingestión de compuestos antioxidantes en la dieta
podría ser de utilidad en la prevención de este tipo de
enfermedades. Además, estos compuestos antioxidantes presentes en
los alimentos retardan los procesos de oxidación de las grasas, que
se consideran responsables de alteraciones y de la aparición de
olores y sabores desagradables en dichos alimentos. Recientes
investigaciones han puesto de manifiesto la capacidad de distintas
proteínas lácteas y de péptidos derivados de las mismas para
ejercer una actividad antioxidante mediante diversos mecanismos de
acción. Así, se han descrito péptidos con capacidad quelante de
radicales libres procedentes de hidrolizados de caseínas (K.
Suetsuna, H. Ukeda y H. Ochi, Isolation and characterization of free
radical scavenging activities peptides derived from casein, Journal
of Nutritional Biochemistry, 2000, 11:128-131;
EP1188767, Isolated antioxidant peptides from casein and methods
for preparing, isolating and identifying antioxidant peptides) y de
proteínas de suero (B. Hernández-Ledesma, A.
Dávalos, B. Bartolomé y L. Amigo, Preparation of antioxidant
enzymatic hydrolyzates from \alpha-lactalbumin and
\beta-lactoglobulin. Identification of active
peptides by HPLC-MS/MS, Journal of Agricultural and
Food Chemistry 2005, 53, 588-593). Además, las
caseínas se han convertido en una fuente importante de péptidos con
actividad inhibitoria de las enzimas catalizadoras de los procesos
de oxidación de grasas (S. G. Rival, S. Fornaroli, C. G. Boeriu y H.
J. Wichers, Caseins and casein hydrolysates. I. Lipoxygenase
inhibitory properties, Journal of Agricultural and Food Chemistry,
2001, 49:
287-294).
287-294).
La mayoría de los estudios llevados a cabo hasta
el momento se han centrado en la actividad biológica de péptidos
derivados de caseínas bovinas. Sin embargo, existen pocos datos
acerca de las actividades biológicas ejercidas por péptidos
procedentes de caseínas de otras especies, como la ovina o la
caprina. J. A. Gómez-Ruiz, I. Recio, y A. Pihlanto
(Antimicrobial activity of ovine casein hydrolysates. A preliminary
study. Milchwissenschaft-Milk Science Internacional
2005, 60:41-45) describieron el potente efecto
inhibidor, dosis dependiente, de la actividad metabólica de
Escherichia coli JM103 ejercida por hidrolizados de
\beta-caseína. Sin embargo, en este estudio no se
llevó a cabo la identificación de los péptidos responsables de
dicho efecto. Por el contrario, se han identificado varias
secuencias liberadas a partir de las caseínas ovinas durante los
procesos de fermentación y maduración característicos de la
elaboración del queso Manchego y algunas de ellas han demostrado
actividad IECA (J. A. Gómez-Ruiz, M. Ramos e I.
Recio, Identification and formation of
angiotensin-converting
enzyme-inhibitory peptides in Manchego cheese by
high-performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of
Chromatography A, 2004, 1054: 269:277). Los valores de IC_{50}
(concentración que inhibe el 50% de la actividad de la enzima) de
estas secuencias estuvieron comprendidos entre 24,1 y 1275,4
\muM. En este estudio el péptido con mayor actividad inhibidora
de la ECA correspondió al fragmento
\alpha_{s2}-caseína
f(205-208) de secuencia VRYL (SEQ. ID. N°
11), que presentó un valor de IC_{50} de 24.1 \muM (J.A.
Gómez-Ruiz, M. Ramos, y I. Recio, Angiotensin
converting enzyme-inhibitory activity of peptides
isolated from Manchego cheese. Stability under simulated
gastrointestinal digestion. Int. Dairy Journal 2004,
1075-1080). Sin embargo, no hay datos sobre la
capacidad de estos péptidos para atravesar la barrera intestinal y
sobre su capacidad para ejercer el efecto antihipertensivo in
vivo. Hay que destacar que con frecuencia, muchos péptidos que
se muestran como potentes inhibidores de la ECA in vitro
pierden toda o parte de su actividad cuando son ensayados in
vivo, o incluso, péptidos que in vitro no presentan gran
actividad como IECA la adquieran in vivo debido a la
actuación de enzimas digestivas (M. Maeno, N. Yamamoto y T. Takano,
Identification of an anti-hypertensive peptide from
casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus
helveticus CP790, Journal of Dairy Science, 1996, 79:
1316-1321). Tampoco hay estudios sobre la capacidad
multifuncional de los péptidos liberados de las caseínas de
diferentes especies para ejercer varias actividades biológicas,
como la antihipertensiva, la antimicrobiana y/o la
antioxidante.
antioxidante.
Dada la alta calidad biológica de las proteínas
de la leche, es de gran interés obtener, a partir de éstas,
péptidos bioactivos que consumidos como parte de la dieta, además
de ejercer sus funciones nutricionales básicas, sean capaces de
producir efectos metabólicos o fisiológicos, útiles en el
mantenimiento de la salud y en la prevención de enfermedades. La
producción de péptidos bioactivos a partir de las proteínas de la
leche permitiría encontrar nuevos usos a este alimento, más allá de
su valor alimenticio clásico, incluyendo la producción de productos
medicinales y nutracéuticos. Esto contribuiría al desarrollo de
alimentos saludables, seguros y de alta calidad, contribuyendo al
aprovechamiento y revalorización de los productos lácteos.
La presente invención consiste en la producción
de productos derivados de proteínas lácteas que contienen péptidos
bioactivos con actividad antimicrobiana y/o actividad IECA in
vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante,
mediante hidrólisis enzimática de la fracción caseínica.
Los péptidos bioactivos se producen mediante la
hidrólisis de una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los
mismos, que contienen la secuencia de aminoácidos de dichos
péptidos bioactivos (preferentemente que contengan
\alpha_{s2}-caseína), empleando enzimas
preferentemente pepsina) y condiciones de hidrólisis que permitan
la ruptura de la cadena proteica en los lugares adecuados para su
liberación. También pueden obtenerse mediante síntesis química o
mediante métodos recombinantes etc. Dichos péptidos pueden
consumirse como tales, o a partir de los hidrolizados crudos, de
concentrados de bajo peso molecular, o de otras subfracciones
activas obtenidas mediante métodos de separación por tamaño o
métodos cromatográficos.
Estos hidrolizados, sus fracciones o los
péptidos, podrían formar parte de productos alimenticios, actuando
como conservantes de los mismos, y reforzando tras su ingestión las
defensas naturales del organismo. Además, podrían emplearse en la
elaboración de productos farmacéuticos, principalmente destinados a
prevenir y tratar enfermedades, como la hipertensión arterial y/o
infecciones bacterianas. La invención amplía las aplicaciones de
las proteínas lácteas contribuyendo a su aprovechamiento y
revalorización.
La invención proporciona un método para producir
péptidos bioactivos a partir de las caseínas de la leche. Dichos
péptidos bioactivos son los identificados con las secuencias de
aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID.
N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°.
7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N° 9 y SEQ. ID. N° 10 (tabla 1),
algunos de los cuales poseen actividad antimicrobiana y/o actividad
IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad
antioxidante.
El material de partida de la presente invención
sería cualquier sustrato apropiado que comprendiese una o más
proteínas o péptidos, de origen animal, vegetal, o procedentes de
microorganismos, que contengan la secuencia de aminoácidos de los
péptidos bioactivos de interés (SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ.
ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID.
N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N° 9 y SEQ. ID. N° 10, tabla 1),
preferiblemente \alpha_{s2}-caseína ovina. Dado
que todos ellos pertenecen a la secuencia de la
\alpha_{s2}-caseína, resulta obvio que podría
usarse cualquier preparado que contenga
\alpha_{s2}-caseína de diferentes especies, o
péptidos o fragmentos de \alpha_{s2}-caseína de
cualquier tamaño, solos o mezclados con otras proteínas. Por
ejemplo: \alpha_{s2}-caseína pura, caseína
entera, caseinatos y leche en sus diferentes formas de presentación,
productos lácteos fermentados, hidrolizados de proteínas lácteas,
subproductos lácteos, derivados lácteos para alimentación animal,
etc.
Dicho material de partida se disuelve o
dispersa, a una concentración apropiada, en agua o en una
disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima
proteolítica. Puede emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de
romper la proteína presente en el material de partida y
proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina
a pH 2,0-3,0. También podrían emplearse
microorganismos proteolíticos que llevasen a cabo una fermentación
del sustrato y la hidrólisis de la proteína.
Las condiciones de hidrólisis: pH, temperatura,
relación enzima-sustrato, interrupción de la
reacción etc., se optimizan con el fin de seleccionar los
hidrolizados más activos. En una realización particular, se
obtienen los péptidos bioactivos empleando pepsina a pH 3,0, en una
relación enzima/sustrato 3,7/100 (p/p) y realizando la hidrólisis a
37°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 minutos y 24
horas, pero, preferiblemente durante un tiempo inferior a 30
minutos.
A continuación, si se desea concentrar los
péptidos bioactivos, y dado que los péptidos con actividad
antimicrobiana poseen carácter catiónico se puede llevar a cabo la
separación de las fracciones conteniendo los péptidos bioactivos
mediante cromatografía de intercambio catiónico (FPLC). A partir de
las fracciones con mayor carácter catiónico pueden aislarse
subfracciones activas mediante un nuevo paso de cromatografía de
intercambio catiónico, cromatografía hidrofóbica, etc., o
preferiblemente cromatografía líquida de alta eficacia en fase
inversa (RP-HPLC). Alternativamente, a partir del
hidrolizado, pueden concentrarse los péptidos bioactivos mediante
métodos tales como ultrafiltración, diálisis, electrodiálisis con
membranas de poro adecuado, cromatografía de filtración por
gel,
etc.
etc.
Además de los hidrolizado completos y sus
fracciones, los péptidos mostrados en la tabla 1 y señalados con
las SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4,
SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ.
ID. N° 9 y SEQ. ID. N° 10, poseen propiedades bioactivas,
fundamentalmente actividad antimicrobiana y/o actividad IECA y/o
actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante y son también
objeto de la presente invención. En concreto, los péptidos
identificados con las secuencias SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2,
SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6,
SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N°. 9 y SEQ. ID. N°. 10
presentan actividad antimicrobiana frente a bacterias
Gram-positivas y al menos la secuencia SEQ. ID. N° 3
ejerce además un potente efecto antimicrobiano frente a
Escherichia coli. Además, los péptidos identificados con las
secuencias SEQ. ID. N°. 1 y SEQ. ID. N°. 7 muestran una potente
actividad IECA in vitro y las secuencia SEQ. ID. N°. 7 posee
actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas
(SHR) cuando se administra por vía oral a estos animales. Por otra
parte, al menos el péptido identificado como SEQ. ID. N°. 7, posee
una notable actividad antioxidante mediante un mecanismo de
quelación de radicales de oxígeno. Debe destacarse que se trata de
péptidos naturales procedentes de productos de amplio consumo de
los que cabe esperar pocos efectos secundarios y buena
tolerancia.
Asimismo, los péptidos bioactivos identificados
en los hidrolizados (SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°.
3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7,
SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N° 9 y SEQ. ID. N° 10, tabla 1) al
conocerse su secuencia, la tecnología disponible permite que pueden
obtenerse por síntesis química y/o enzimática de péptidos o por
métodos recombinantes.
No se había descrito previamente la obtención de
péptidos bioactivos a partir de hidrolizados de
\alpha_{s2}-caseína ovina con pepsina aunque sí
se habían identificado péptidos antimicrobianos derivados de esta
proteína de origen bovino (EP 1114060, Process for producing
cationic peptides from biological fluids). También se habían
identificado previamente algunos péptidos derivados de
\alpha_{s2}-caseína y otras caseínas ovinas en
queso Manchego con actividad IECA (J. A. Gómez-Ruiz,
M. Ramos e I. Recio, Identification and formation of
angiotensin-converting
enzyme-inhibitory peptides in Manchego cheese by
high-performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of
Chromatography A, 2004, 1054: 269:277), aunque no se había estudiado
su actividad antihipertensiva in vivo. Entre los péptidos
con actividad IECA previamente identificados se encuentra el
fragmento 205-208 de la
\alpha_{s2}-caseína ovina de secuencia VRYL
(SEQ. ID. N° 11) (IC_{50} 24,1 \muM). Sin embargo, la secuencia
SEQ. ID. N°. 7 de la presente invención, PYVRYL (IC_{50} 1.94)
presenta una actividad IECA 12 veces más potente que la previamente
descrita, lo que justifica la necesidad la totalidad de la
secuencia que se encuentra en la presente invención para ejercer una
notable actividad IECA. Además, también se requiere la totalidad de
la SEQ. ID. N°. 7 para ejercer la actividad antihipertensiva y/o
antioxidante y/o antimicrobiana.
Estos productos derivados de la leche: los
hidrolizados completos, las fracciones de los mismos, o uno o más
de sus péptidos bioactivos constituyentes (incluyendo sus
derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas),
podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad
antimicrobiana y/o actividad IECA y/o con actividad
antihipertensiva y/o actividad antioxidante. Dichos productos
lácteos pueden ser sometidos a un tratamiento térmico, como la
pasteurización, o bien someterse a secado o liofilización etc.,
para emplearse como productos alimentarios funcionales, aditivos o
ingredientes alimentarios, o productos farmacéuticos, para el
tratamiento y/o prevención de infecciones y/o la hipertensión
arterial en todas sus formas, principalmente en seres humanos,
aunque también en animales. La cantidad de hidrolizado, fracción de
bajo peso molecular, péptidos, sus derivados o sales
farmacéuticamente aceptables y sus mezclas, así como su dosificación
para el tratamiento de alguna patología, variará dependiendo de
numerosos factores, como la edad, severidad de la patología o
disfunción, vía de administración y frecuencia de la dosis. Estos
compuestos podrían presentarse en cualquier forma de administración,
sólido ó líquido, y administrarse por cualquier vía apropiada,
oral, respiratoria, rectal o tópica, aunque particularmente están
diseñados para una administración sólida o líquida por vía
oral.
En general, el proceso de obtención de estos
productos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos
y sus péptidos constituyentes, se podrá optimizar, dirigiéndolo a
la producción de la mayor cantidad posible de péptidos bioactivos o
para controlar en lo posible la aparición de amargor, originado
normalmente por una elevada concentración de péptidos hidrófobos de
peso molecular intermedio o bajo.
La actividad antimicrobiana se determina de
acuerdo con el método de A. Pellegrini, C. Deltting, U. Thomas, P.
Hunziker (Isolation and characterization of four bactericidal
domains in the bovine \beta-lactoglobulin.
Biochimica et Biophysica Acta, 2001, 1526:131-140),
empleando como microorganismos Escherichia coli [American
Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA] ATCC 25922,
Listeria innocua [Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)
Valencia, España] CECT 910T, Sthaphylococcus epidermidis
CECT 231, Enterococcus faecalis CECT 795, Serratia
marcescens CECT 854 y Sthaphylococcus carnosus CECT
4491T.
Las suspensiones bacterianas se inoculan al 1%
en el medio de cultivo Triptosa- Soja (TSB) para Escherichia
coli, Serratia marcescens y las cepas del género
Sthaphylococcus, o en el caldo infusión
cerebro-corazón (BHI) para Enterococcus
faecalis y Listeria innocua. La incubación se lleva a
cabo a 37°C, excepto en el caso de Serratia marcescens, que
se realiza a 30°C.
El inóculo bacteriano, a partir del cual se
inicia el trabajo, se obtiene tras incubar una colonia crecida en
TSB-Agar ó BHI-Agar en 10 mL de TSB
o BHI durante toda la noche a 37°C o 30°C. La suspensión bacteriana
(1 mL) se diluye 1/50 con el medio de cultivo correspondiente,
incubándose a la temperatura adecuada para cada cepa hasta alcanzar
una densidad de población de 1-4x10^{8} unidades
formadoras de colonias (UFC) por mL. El cultivo se centrifuga a
2000 \times g durante 10 minutos, se lavan las bacterias
sedimentadas dos veces con 15 mL de tampón fosfato (pH 7,4) y se
ajusta la población a 10^{6} UFC/mL. En una placa multipocillo
estéril (Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Alemania) se mezclan
50 \muL de la suspensión bacteriana, 50 \muL de la sustancia a
ensayar y 100 \muL del tampón fosfato con un 2% del medio de
cultivo adecuado en cada caso, y se incuba la mezcla a 37°C o 30°C
durante 2 horas. Pasado este tiempo, la mezcla se diluye hasta
10^{-5}, se añaden 100 \muL de cada una de las diluciones a
placas de TSB-Agar ó BHI-Agar y se
incuban las placas durante 24 horas, pasadas las cuales se lleva a
cabo el recuento de las
colonias.
colonias.
Para calcular la actividad antimicrobiana se
emplea la fórmula siguiente:
Actividad\
antimicrobiana = log\
\frac{N_{0}}{N_{f}},
donde
N_{0} corresponde al número de UFC/mL
inicial
N_{f} corresponde al número de UFC/mL
final
La actividad IECA se mide in vitro de
acuerdo con el método de D. W. Cushman y H. S. Cheung
(Spectrophotometric assay and properties of the
angiotensin-converting enzyme of rabbit lung,
Biochemical Pharmacology, 1971, 20:1637-1648),
modificado posteriormente por Y. K. Kim, S. Yoon, D. Y. Yu., B.
Lónnerdal y B. H. Chung (Novel
angiotensin-I-converting enzyme
inhibitory peptides derived from recombinant human
\alpha_{s2}-casein expressed in Escherichia
coli. Journal of Dairy Research 1999, 66,
431-439).
El sustrato, hipuril histidil leucina (HHL,
Sigma, Chemicals Co, St. Louis, MO, USA), se disuelve en tampón
borato 0.1 M con NaCl 0.3 M, pH 8.3, para obtener una concentración
final 5 mM. A 100 \muL de sustrato se le añaden 40 \muL de cada
una de las muestras cuya actividad IECA se quiere determinar. Se
adiciona la enzima ECA (EC 3.4.15.1, Sigma), disuelta en glicerol
al 50%, y diluida en el momento de realizar el ensayo 1/10 en agua
bidestilada. La reacción se lleva a cabo a 37°C, durante 30 minutos
en un baño de agua. La enzima se inactiva descendiendo el pH con 150
\mul de HCl 1N. El ácido hipúrico formado se extrae con 1000
\muL de acetato de etilo. Tras agitación en vórtex durante 20
segundos, se centrifuga a 3000 \times g durante 10 minutos y a
temperatura ambiente. Se toman 750 \muL de la fase orgánica que se
evapora por calentamiento a 95°C durante 10 minutos. El residuo de
ácido hipúrico se redisuelve en 800 \muL de agua bidestilada y,
tras agitar durante 20 segundos, se mide la absorbancia a 228 nm en
un espectrofotómetro Dur-70 de Beckman Instruments,
Inc., Fullerton, EEUU.
Para calcular el porcentaje de actividad IECA se
emplea la fórmula siguiente:
%\ IECA =
\frac{Acontrol-Amuestra}{Acontrol-Ablanco}
*
100
El blanco se utiliza para corregir la
absorbancia de fondo. Este contiene sustrato, enzima y 20 \mul de
agua bidestilada en lugar de muestra, y la reacción se para a tiempo
cero. El control supone el cien por cien de la acción enzimática
sobre el sustrato en ausencia de inhibidores, y contiene 20 \mul
de agua en lugar de muestra y se incuba el mismo tiempo que la
muestra.
Los resultados se presentan como IC_{50}
(\muM) o concentración a la que se inhibe el 50% de la actividad
de la enzima. La concentración de proteína se determina mediante el
ensayo del ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL, EEUU)
empleando como patrón seroalbúmina bovina.
\newpage
La capacidad de absorción de radicales de
oxígeno (ORAC) se determina siguiendo el método desarrollado por B.
X. Ou, M. Hampsch-Woodill, RL. Prior (Development
and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity
assay using fluorescein as the fluorescent probe, 2001,
49:4619-4626). Este método se basa en la oxidación
de la fluoresceína por los radicales peroxilos producidos in
situ por descomposición térmica del 2,2'-azobis
2-amidinopropano dihidrocloruro (AAPH). La
oxidación de la fluoresceína causa un descenso de la fluorescencia a
\lambda_{exc} = 493 nm y \lambda_{em} = 515 nm. La
presencia de antioxidantes evita o retrasa la descomposición de la
fluores-
ceína.
ceína.
La solución de trabajo de la fluoresceína se
prepara diariamente a una concentración 60 nM a partir de una
solución madre de fluoresceína 100 \muM en tampón fosfato 75 mM
(pH 7,5). Como antioxidante de referencia se utiliza ácido
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico
(Trolox), que se prepara a una concentración 20 mM (solución madre)
en tampón fosfato y se conserva a -20°C. Se obtiene una curva de
calibrado de Trolox por el análisis de las soluciones patrón de
concentraciones 12,5; 25; 40; 50 y 100 \muM, preparadas a partir
de la solución madre. El AAPH se disuelve en el tampón fosfato
hasta una concentración final de 143 mM, manteniéndose a baja
temperatura para impedir su degradación.
Para llevar a cabo el ensayo, se mezclan 375
\muL de la muestra con 375 \muL del AAPH y 2,225 mL de
fluoresceína, incubando esta mezcla a 37°C. Cada 5 minutos se mide
la fluorescencia (\lambda_{exc} = 493 nm y \lambda_{em} =
515 nm) en el fluorimetro RF-1501 (Shimadzu). Se
realizan controles del ensayo consistentes en un blanco que contiene
fluoresceína y tampón fosfato, para comprobar la estabilidad de la
fluoresceína durante el experimento, y un control positivo de
oxidación máxima que contiene fluoresceína, AAPH y tampón fosfato.
Como control de la medida de actividad antioxidante, se incluye una
solución de trolox 40 \muM en cada set de muestras a analizar.
Todas las muestras se analizaron por triplicado.
La actividad antioxidante se cuantifica a través
de la medida del "área bajo la curva" (AUC) de la curva de
decadencia de la fluorescencia de fluoresceína y se expresa como
equivalentes de Trolox (valor de ORAC). El AUC se calcula empleando
la siguiente fórmula:
AUC = (0.5 +
f_{5}/f_{0} + f_{10}/f_{0} + f_{15}/f_{0} +.....+
f_{30}/f_{0})
Donde f_{0} es la fluorescencia a tiempo cero
y f_{i} es la fluorescencia a tiempo i.
El valor relativo ORAC para los péptidos se
determina con la siguiente fórmula:
ORAC =
[(AUC_{muestra} - AUC_{blanco})/(AUC_{trolox} - AUC_{blanco})]\ x\
[(molaridad\ del\ trolox/ molaridad de\ la\
muestra)]
\vskip1.000000\baselineskip
El aislamiento de fracciones peptídicas se lleva
a cabo siguiendo el método de I. Recio, S. Visser (Identification
of two distinct antibacterial domains within the sequence of bovine
\alpha_{s2}-casein. Biochimica et Biophysica
Acta 1999, 1428:314-326) con algunas
modificaciones, en un equipo de FPLC, usando una columna de
intercambio catiónico HiLoad^{TM} 26/10 SP Sepharose Fast Flow
(Pharmacia, Uppsala, Suecia). Las fases A y B están constituidas por
NH_{4}HCO_{3} 10 mM (ajustada a pH 7,0 con HCOOH) y NH_{3}
1,5 M, respectivamente. Las muestras se disuelven en la fase A
preparadas a una concentración de 5 mg/mL, inyectándose un volumen
de 5 mL mediante un Superloop^{TM} (Pharmacia) de 50 mL. El
hidrolizado eluye a un flujo de 5 mL/min. Tras 20 minutos con 100%
de solvente A, se aplica un gradiente del 0 al 50% del solvente B
en A en 60 minutos, seguido de 20 minutos con el 50% del solvente B.
La detección se lleva a cabo a una absorbancia de 214 nm. La
temperatura de la columna y de las fases móviles es de 9°C. Las
fracciones se recogen tras varios análisis cromatográficos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utiliza un equipo formado por dos bombas
programables modelo Waters Delta 600, un detector de diodos
alineados modelo 966, un inyector automático modelo 717 plus, y un
colector de fracciones automático (Waters Corp., Mildford, MA,
EEUU). Se usa una columna C_{18} Prep NovaPack® HR, 7.8 x 300 mm
y 6 \mum de tamaño de poro (Waters), con un cartucho C_{18}
(Waters) como guardacolumna. Los análisis se realizan a 30°C y la
detección a 214 y 280 nm. La adquisición de los datos se lleva a
cabo con el Software Millennium versión 3.2 (Waters). Las muestras
se preparan a una concentración de 2,5 mg/mL y, previamente a la
inyección, se centrifugan a 16 000 \times g durante 10 minutos.
Para la elución de las muestras se utiliza un gradiente binario de
agua milliQ® (fase A) y acetonitrilo (fase B) con 0,1% y 0,08% de
ácido trifluoroacético, respectivamente, y un flujo de 4 mL/min. El
gradiente de fase B es del 0% al 40% en 50 minutos y del 40% al 70%
durante 5 min, lavándose la columna con 70% de B durante 5 minutos
y acondicionando de nuevo la columna en las condiciones iniciales
durante 25 min. El volumen de muestra inyectado es de 300
\mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplea un equipo de trampa iónica Esquire
3000 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Las muestras se
preparan a una concentración de 2 mg/mL en una solución de
agua:acetonitrilo al 50% (v/v) con ácido fórmico al 0,01% (v/v). La
muestra se inyecta en el nebulizador de electrospray a un flujo de
4 \mul/min, utilizando una bomba de jeringa tipo 22 (Harvard
Apparatus, South Natick, MA, EEUU). El equipo emplea nitrógeno como
gas nebulizador y de secado, y opera con una presión de helio de 5 x
10^{-3} bar. Los espectros de masas se adquieren en un intervalo
de 100-2000 m/z, y a una velocidad de 13000
Da/segundo. La interpretación de los espectros de masas en tandem
para la identificación de las secuencias peptídicas se realiza con
el programa Biotools 2.1 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen,
Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Se emplea un equipo Esquire-LC
(Bruker Daltonik GMBH, Bremen, Alemania). El equipo de HPLC (serie
1100) está formado por una bomba cuaternaria, un inyector
automático, un sistema de desgasificación de eluyentes y un detector
ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent Technologies,
Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un espectrómetro de masas
de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik). La columna es una
columna Hi-Pore C18 (250 x 4,6 mm d.i., 5 \mum de
tamaño de partícula) (Bio-Rad Laboratories,
Richmond, CA, EEUU). El disolvente A es una mezcla de agua y ácido
trifluoroacético (1000:0.37) y el disolvente B una mezcla de
acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0.27). Se inyectan 50
\mul de muestra preparada a una concentración de 4,5 mg/ml. Se
emplea un flujo de 0.8 ml/min, con un gradiente lineal del 0% al
50% de disolvente B en A en 60 minutos. El eluyente se monitoriza a
214 nm, mediante espectrofotometría de masas, bajo las mismas
condiciones que las indicadas en el apartado anterior, salvo que el
flujo de inyección de la muestra a través del nebulizador es
de
275 \mul/min.
275 \mul/min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudia el efecto de varios de los péptidos
identificados sobre la presión arterial de ratas SHR. Los péptidos
se sintetizan químicamente para este estudio.
El estudio se realiza con ratas macho SHR, de
17-20 semanas de edad, y peso comprendido entre 300
y 350 g, procedentes de Charles River Laboratories España S.A. Las
ratas se almacenan en jaulas de cinco en cinco, y se mantienen a una
temperatura estable de 25°C, con ciclos de
luz-oscuridad de 12 horas, ingiriendo agua y comida
a libre disposición. Se llevan a cabo medidas de presión arterial
sistólica (PAS) y diastólica (PAD), y para ello se utiliza el
método del manguito en la cola ("tail cuff") (RD. Buñag,
Validation in awake rats of a tail-cuff method for
measuring systolic pressure, J. Appl. Physiol., 1973, 34:
279-282). El equipo que se utiliza (Le5001, Letica)
proporciona valores digitales de la PAS y de la PAD automáticamente.
Este equipo registra y facilita también la medida de la frecuencia
cardíaca de los animales. Antes de colocar el manguito y el
transductor en la cola de las ratas, éstas se exponen a una
temperatura próxima a los 37°C para facilitar la dilatación de la
arteria caudal. Además, para asegurar la fiabilidad de la medida,
los animales se acostumbran al procedimiento 2 semanas antes de
llevar a cabo el ensayo en cuestión. El valor de la PAS y de la PAD
se establece realizando 3 medidas consecutivas, y calculando la
media de los tres valores correspondientes a cada una de estas dos
variables.
Las ratas SHR utilizadas para el estudio tenían
valores de PAS comprendidos entre 190 mm Hg y 220 mm Hg, y valores
de PAD comprendidos entre 130 mm Hg y 180 mm Hg.
La administración de los productos a ensayar se
realiza mediante sonda intragástrica en un margen de tiempo
comprendido entre las 9 y las 10 h de la mañana, y la dosis
ensayada se administra disuelta en 1 ml de agua destilada. Se toman
medidas de la PAS y de la PAD antes de la administración, y se
toman también medidas periódicas de estas variables cada 2 horas
después de la administración, hasta 8 horas
post-administración. Adicionalmente, se toman
también medidas de la PAS y de la PAD 24 horas después de la
administración de dichos productos. Como control negativo (para
establecer la variación circadiana de la PAS y de la PAD en ratas
sondadas) se utilizan las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas
en ensayos semejantes con ratas a las que se administra mediante
sonda intragástrica 1 ml de agua. Como control positivo, se
utilizan las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ensayos
semejantes con ratas a las que se administra mediante sonda
intragástrica 50 mg/kg de captopril (fármaco IECA prototipo). Esta
dosis de captopril se administra a cada rata disuelta en 1 ml de
agua
destilada.
destilada.
Los resultados se agrupan y se obtiene la media
\pm el error estándar de la media (ESM) para un mínimo de 6
ensayos homogéneos. Para compararlos se utiliza un análisis de
varianza de una vía, seguido del test de Bonferroni. Se considera
significativa la diferencia para valores de p<0.05.
La figura 1 representa un cromatograma, obtenido
utilizando cromatografía de intercambio catiónico (FPLC), del
hidrolizado de la \alpha_{s2}-caseína ovina con
pepsina durante 30 minutos, en el que se seleccionan 5 fracciones
(FA-FE), que fueron recogidas manualmente. En el
eje de abcisas se representa el tiempo en minutos.
La figura 2A es un cromatograma, obtenido
utilizando cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase
inversa (RP-HPLC) a escala semipreparativa, de la
fracción FC recogida a partir del hidrolizado de
\alpha_{s2}-caseína ovina con pepsina durante 30
minutos. Se seleccionan 4 subfracciones (FC1-FC4),
que fueron recogidas automáticamente. En el eje de abscisas se
representa el tiempo en minutos.
La figura 2B es un cromatograma, obtenido
utilizando cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase
inversa (RP-HPLC) a escala semipreparativa, de la
fracción FD recogida a partir del hidrolizado de
\alpha_{s2}-caseína ovina con pepsina durante 30
minutos. Se seleccionan 2 subfracciones (FD1-FD2),
que fueron recogidas automáticamente. En el eje de abscisas se
representa el tiempo en minutos.
La figura 3 representa la actividad
antimicrobiana de las distintas subfracciones obtenidas a partir de
las fracciones FC y FD mediante RP-HPLC a escala
semipreparativa.
La figura 4 representa la disminución de la
presión arterial sistólica (PAS), y la disminución de la presión
arterial diastólica (PAD), obtenidas en ratas espontáneamente
hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de
1 ml de agua (\medcirc), 50 mg/kg de Captopril (\Box), 3 mg/kg
de PYVRYL (\blacktriangle), y 3 mg/kg de
LKKISQ(\blacklozenge). T(h) representa el tiempo
transcurrido desde la administración expresado en horas. Los datos
representan la media \pm ESM para un mínimo de 6 animales.
^{a}P<0.05 vs agua; ^{b}P<0.05 vs
Captopril; ^{c}P<0.05 vs PYVRYL.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención,
aunque no deben considerarse como limitativos del alcance de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El hidrolizado se obtuvo empleando como sustrato
\alpha_{s2}-caseína ovina, obtenida tras la
separación del resto de las caseínas mediante el método de H. J.
Vreeman, J. A. M. van Riel (The large-scale
isolation of \alpha_{s2}-casein from bovine
casein. Netherlands Milk and Dairy Journal, 1990,
44:43-48). Como enzima se utilizó pepsina porcina
(E.C. 3.4.23.1. 570 U/mg de proteína), procedente de estómago de
cerdo (Sigma Chemical, St. Louis, USA). Se preparó una disolución
acuosa de la \alpha_{s2}-caseína ovina al 0,5% y
el pH se ajustó a 3,0 con HCl 1 M. Se añadió pepsina (relación
enzima/sustrato 3,7/100, p/p). La hidrólisis se llevó a cabo a 37°C
durante 30 minutos. La inactivación de la pepsina se consiguió por
calentamiento a 80°C durante 15 minutos y posterior ajuste del pH a
7,0 con NaOH 1 M. El sobrenadante recogido tras la centrifugación
del hidrolizado a 16000 g durante 15 minutos a 5°C se analizó
mediante FPLC (Figura 1), se separaron cinco fracciones
(FA-FE), que se recogieron manualmente y
posteriormente se
liofilizaron.
liofilizaron.
Se midió la actividad antimicrobiana de estas
cinco fracciones a una concentración de 2,5 mg/mL, empleando como
control E. coli a 5,9 \times 10^{5} UFC/mL. Los
resultados revelaron que las fracciones FC y FD presentaban
actividad antimicrobiana, reduciendo el número de microorganismos
en 2,54 y 0,6 órdenes de magnitud, respectiva-
mente.
mente.
Con objeto de identificar los péptidos
responsables de la actividad antimicrobiana las fracciones FC y FD
se analizaron mediante RP-HPLC a escala
semipreparativa. En la Figura 2 se muestra el perfil cromatográfico
de la fracción FC (Figura 2A) y la fracción FD (Figura 2B). A
partir de la fracción FC se separaron cuatro subfracciones
(FC1-FC4) y a partir de la fracción FD dos
subfracciones (FD1-FD2). Cada una de estas
subfracciones se recogieron y, tras la evaporación del acetonitrilo,
se liofilizaron. Se midió la actividad antimicrobiana de estas
subfracciones a una concentración de 2,5 mg/mL contra E.
coli (6,2 x 10^{6} UFC/mL). En la Figura 3 se muestran los
valores de actividad antimicrobiana frente a E. coli de estas
subfracciones. De todas las subfracciones, cabe destacar la FC1,
que fue la que exhibía mayor actividad antimicrobiana, ya que tuvo
efecto bactericida a la concentración ensayada (log N_{f}/N_{0}
mayor de 6). Las subfracciones FC4, FD1 y FD2 mostraron una moderada
actividad antimicrobiana, con valores de reducción del número de
microorganismos de 1,24, 1,31 y 1,64 órdenes de magnitud,
respectivamente.
respectivamente.
Las subfracciones FC1, FC4, FD1 y FD2 se
analizaron por espectrometría de masas, utilizando un analizador de
trampa iónica siguiendo la metodología previamente descrita. Los
péptidos identificados se muestran en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se sintetizaron químicamente los péptidos
mayoritarios presentes en las subfracciones obtenidas del
hidrolizado de \alpha_{s2}-caseína ovina con
pepsina durante 30 minutos (SEQ. ID. N°. 1; SEQ. ID. N°. 2; SEQ.
ID. N°. 3 y SEQ. ID. N° 7). Estos péptidos se sintetizaron mediante
el método Fmoc en fase sólida y su pureza se verificó mediante
RP-HPLC-MS/MS.
Se midió la actividad antimicrobiana de los
péptidos sintéticos a una concentración de 0,5 mM, frente a
Escherichia coli, Serratia marcescens,
Staphylococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus
faecalis y Listeria innocua. Los resultados de actividad
se muestran en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad antimicrobiana de estos péptidos
contra bacterias Gram positivas es elevada, sobre todo frente a las
especies ensayadas del género Staphylococcus. Tres de estos
péptidos SEQ. ID. N°. 1; SEQ. ID. N° 2 y SEQ. ID. N°. 3 presentaron
actividad bactericida frente a S. carnosus. Sin embargo, las
bacterias Gram negativas (E. coli y S. marcescens)
son muy resistentes a la acción de todos estos péptidos, aunque cabe
destacar que el péptido identificado como SEQ. ID. N°. 3 mostró una
elevada actividad antimicrobiana frente a E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se midió la actividad IECA de dos de los
péptidos sintetizados químicamente, concretamente las secuencias
SEQ. ID. N°. 1 y SEQ. ID. N° 7, mencionados en el ejemplo 1. Los
resultados de actividad, expresada como IC_{50}, o concentración
proteica necesaria para inhibir el 50% de la actividad de la enzima
se muestran en la Tabla 3.
Los dos péptidos presentan una potente actividad
IECA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó la actividad antihipertensiva de los
péptidos SEQ. ID. N°. 1 y SEQ. ID. N°. 7, para lo cual se
administraron dichos péptidos (3 mg/kg) a ratas SHR. Los péptidos
se disolvieron en agua destilada y la dosis correspondiente se
administró a cada rata en un volumen de 1 mL.
La Figura 4 muestra las disminuciones de la PAS
y de la PAD obtenidas en ratas SHR, en distintos momentos, tras la
administración de 3 mg/kg de los péptidos SEQ. ID. N°. 1 y SEQ. ID.
N°. 7. Se puede observar que la administración del péptido SEQ ID
N° 7 ocasiona una disminución significativa de la PAS y de la PAD en
estos animales. La disminución de estas variables es máxima 4 horas
después de la administración de este péptido La disminución
presenta, además, un curso temporal semejante al de la disminución
de PAS y de PAD producida por la administración de captopril, que es
un compuesto de probada actividad antihipertensiva. Estos
resultados demuestran que el péptido identificado por la secuencia
SEQ. ID. N°. 7 tiene un claro y pronunciado efecto antihipertensivo
cuando se administra de forma aguda por vía oral.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se midió la actividad antioxidante de la
secuencia SEQ. ID. N°. 7, mencionada en el ejemplo 1. El valor de
actividad quelante de radicales peroxilo se muestra a
continuación:
ORAC_{PYVRYL}
= 1 . 82\ \mu mol\ Trolox\ equivalentes/\mu mol\
péptido
Los resultados muestran, por tanto, que el
péptido PYVRYL (SEQ. ID. N°. 7) presenta una actividad antioxidante
1.82 veces superior a la actividad de 1 \mumol de Trolox.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
{}\hskip1cm Amigo Garrido, Lourdes
{}\hskip1cm Ramos González, Mercedes
{}\hskip1cm Recio Sánchez, Isidra
{}\hskip1cm Miguel Castro, Marta
{}\hskip1cm López Expósito, Iván
{}\hskip1cm Gómez Ruiz, José Ángel
{}\hskip1cm Hernández Ledesma, Blanca
{}\hskip1cm Quirós del Bosque, Ana
{}\hskip1cm Aleixandre de Artiñano, Amaya
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS BIOACTIVOS IDENTIFICADOS EN
HIDROLIZADOS ENZIMÁTICOS DE CASEÍNAS LÁCTEAS Y PROCEDIMIENTO DE
OBTENCIÓN.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PEPCAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Includes SEQ ID N°l
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Includes SEQ ID N°1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Includes SEQ ID N°1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Includes SEQ ID N°7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Includes SEQ ID N°7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Includes SEQ ID N°7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived from casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Includes SEQ ID N°7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Derived of ovine casein
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (21)
1. Péptido bioactivo caracterizado
por
- a.
- poseer actividad antimicrobiana y/o actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante
- b.
- presentes en hidrolizados enzimáticos de caseínas lácteas con pepsina y
- c.
- las secuencias de aminoácidos del grupo siguiente: SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N° 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N° 9 y SEQ. ID. N° 10.
2. Péptido bioactivo según la reivindicación 1
de secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ.
ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, o SEQ. ID. N° 10 caracterizados
por comprender la SEQ. ID. N°. 7.
3. Péptido bioactivo según la reivindicación 1
de secuencias SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, o
SEQ. ID. N° 9 caracterizados por comprender la SEQ. ID. N°.
1.
4. Péptido bioactivo según las reivindicaciones
1 a 3 caracterizado por presentar actividad antimicrobiana
frente a bacterias Gram-positivas
5. Péptido bioactivo según las reivindicaciones
1 a 3 caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEQ. ID.
N° 3 y presentar actividad antimicrobiana frente a bacterias
Gram-negativas como Escherichia coli.
6. Péptido bioactivo según las reivindicaciones
1 a 3 caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEQ. ID.
N° 1 ó SEQ. ID. N°. 7 y presentar actividad IECA in
vitro.
7. Péptido bioactivo según las reivindicaciones
1 y 2 caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEQ ID
N° 7 y por presentar actividad antihipertensiva.
8. Péptido bioactivo según las reivindicaciones
1 y 2 caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEQ ID
N° 7 y por presentar actividad antioxidante mediante quelación de
radicales de oxígeno.
9. Péptido bioactivo según las reivindicaciones
1 a 8, caracterizado por obtenerse mediante un procedimiento
de síntesis química o enzimática o mediante métodos
recombinantes.
10. Péptido bioactivo según las reivindicaciones
9, caracterizado por obtenerse por un procedimiento de
hidrólisis enzimática de \alpha_{s2}-caseína o
caseína entera o leche en sus diferentes formas de presentación,
subproductos lácteos, o productos lácteos fermentados.
11. Procedimiento para producir cualquiera de
los péptidos bioactivos según la reivindicación 1 a 8,
caracterizado por:
- a.
- obtenerse por hidrólisis del material de partida que seria cualquier sustrato apropiado que contenga una o más proteínas o péptidos, de origen animal o vegetal, o procedentes de microorganismos, preferiblemente \alpha_{s2}-caseína o caseína o leche entera, cuya secuencia de aminoácidos comprendiese la secuencia de aminoácidos de alguno de los péptidos bioactivos de interés indicados en la reivindicación 1,
- b.
- disolverse o dispersarse dicho material de partida, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolítica,
- c.
- emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de romper la proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 3,0; o microorganismos proteolíticos que llevaran a cabo una fermentación del sustrato, y
- d.
- el tiempo de reacción estaría comprendido entre 10 minutos y 24 horas, pero que preferiblemente fuera de 30 minutos.
12. Péptido bioactivo según las reivindicaciones
1 a 3 caracterizado porque para su obtención se emplean los
procedimientos indicados en la reivindicación 11.
13. Producto bioactivo caracterizado
porque contiene al menos alguno de los péptidos indicados en las
reivindicaciones 1 a 3 al tratarse del propio hidrolizado
enzimático, cualquiera de sus fracciones, o una purificación de los
mismos.
\newpage
14. Péptido bioactivo caracterizados por
ser derivados o sales farmacéuticamente aceptables, o las mezclas
de cualquiera de los productos bioactivos indicados en las
reivindicaciones 1 a 10 y 12 y 13.
15. Composición farmacéutica
caracterizada por comprender al menos alguno de los
productos bioactivos con actividad antimicrobiana y/o actividad IECA
in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o
actividad antioxidante según las reivindicaciones 1 a 10 y 12, 13 y
14.
16. Aditivo, ingrediente, o suplemento
alimentario funcional caracterizado por comprender al menos
alguno de los productos bioactivos con actividad antimicrobiana,
IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo
y/o actividad antioxidante según las reivindicaciones 1 a 10 y 12,
13 y 14.
17. Producto alimentario funcional
caracterizado por comprender al menos alguno de los
productos bioactivos con actividad antimicrobiana, IECA in
vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o
actividad antioxidante según las reivindicaciones 1 a 10 y 12, 13
14 y 16.
18. Composición farmacéutica según la
reivindicación 15 para su uso en la elaboración de un medicamento
destinado a la prevención y/o el tratamiento de infecciones
microbianas.
19. Composición farmacéutica según la
reivindicación 15 para su uso en la elaboración de un medicamento
destinado al tratamiento de la hipertensión.
20. Uso de aditivo, ingrediente, alimentario
funcional según la reivindicación 16 en la elaboración de un
producto alimentario funcional favorable para prevenir infecciones
microbianas.
21. Uso de aditivo, ingrediente, alimentario
funcional según la reivindicación 16 en la elaboración de un
producto alimentario funcional favorable para mitigar la
hipertensión.
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