WO2010005012A1 - アポラクトフェリン含有組成物 - Google Patents

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WO2010005012A1
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derived
age
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彩子 母里
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株式会社アップウェル
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Definitions

  • the present invention relates to a composition containing apolactoferrin.
  • Lactoferrin is a transferrin family iron-binding glycoprotein responsible for iron transport in the living body and was isolated in 1960. Regarding the function of lactoferrin, many studies have been conducted on bactericidal or bacteriostatic action, immune function regulating action, protection and growth of useful intestinal bacteria, suppression of free radicals (containing active oxygen), Research has progressed because bactericidal or bacteriostatic effects are clear. The mechanism of bactericidal or bacteriostatic is that lactoferrin attaches to bacterial and viral cell membranes and kills the bacteria directly by breaking the cell membrane, or lactoferrin takes away the iron necessary for the growth and maintenance of the bacteria, This is thought to be due to the effect of suppressing the survival of bacteria in a deficient state.
  • Lactoferrin consists of about 690 chain amino acids, and its three-dimensional structure has two iron binding pockets, and iron binds to the pockets one by one.
  • a material in which 100% of iron is bound to this pocket is called “hololactoferrin”, and a material in which iron is not bound is called “apolactoferrin”. Since normal bovine lactoferrin contains iron in 15 to 20% of the pockets, the powder and solution are pink, and the redness increases as the degree of binding of iron increases. On the other hand, apolactoferrin from which iron has been removed is white and can be easily distinguished by its appearance. Apolactoferrin has higher ironophilicity than normal lactoferrin and has a much higher antibacterial or bacteriostatic effect.
  • Lactoferrin is also classified as an antioxidant because it binds and fixes free iron. This apolactoferrin having a large iron-fering action has a higher ability as an antioxidant than lactoferrin.
  • apolactoferrin Since apolactoferrin has the useful properties as described above, it is used in various fields. For example, various compositions using apolactoferrin are known, such as ophthalmic compositions and cosmetics (Patent Documents 1 to 4).
  • the Maillard reaction that occurs between various reducing sugars and proteins proceeds by the processing or storage of foods, imparts color or fragrance to processed foods, and further stabilizes food components, It is known to increase antioxidant activity or antimutagenicity.
  • a terminal glycation product AGEs
  • AGEs terminal glycation product
  • Hemoglobin A 1C (HbA 1C ) is an Amadori transfer product in the early Maillard reaction and is not affected by diet, and thus is an important indicator for diagnosis of diabetes.
  • the Amadori transition product reduces oxygen (O 2 ) by one electron to generate a superoxide anion which is active oxygen.
  • the generated superoxide anion derives hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) and a hydroxy radical (.OH).
  • these active oxygens react with nitric oxide (NO) in the body to produce peroxynitrite (ONOO ⁇ ) having a high oxidizing power, and these free radicals are the organs of the delicate eye, kidney Injuries vascular endothelium.
  • NO nitric oxide
  • ONOO ⁇ peroxynitrite
  • free radicals are the organs of the delicate eye, kidney Injuries vascular endothelium.
  • generated (irreversible) AGEs are signaled into vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, or macrophage cells via AGEs receptors (Receptor of AGEs; abbreviated as RAGE).
  • RAGE AGEs receptors
  • lactoferrin has high binding properties with AGEs, but the detailed research results have been announced since the 1990s. Lactoferrin has two domains that bind to AGEs, which have been found to be a loop of 17 to 18 amino acids. Since each end of this loop has a cysteine, it is sometimes called a cysteine loop. This loop has been shown to exhibit significant hydrophilicity, and binding sites such as lysozyme and defensin, which are peptides that are relatively easy to bind to other AGEs, also exhibit high hydrophilicity. It has been suggested that a hydrophilic environment is advantageous for binding to.
  • the object of the present invention is to provide a useful composition containing apolactoferrin.
  • the present invention provides a composition comprising apolactoferrin and at least one selected from the group consisting of a terminal glycation product binder, an antioxidant substance and an antibacterial substance.
  • the glycation end product binder is a milk component hydrolyzate obtained by hydrolyzing whey with endoprotease, exoprotease, and endopeptidase.
  • a composition exhibiting a useful effect is provided by combining apolactoferrin with a terminal glycation product binder, an antioxidant or an antibacterial substance.
  • coli culture solution by apolactoferrin alone (no addition of glyceraldehyde-derived AGE), apolactoferrin when glyceraldehyde-derived AGE is added, and apolactoferrin and glycation end product binder when glyceraldehyde-derived AGE is added
  • It is. 2 is a graph showing the antioxidant power of combinations of apolactoferrin and various concentrations of ⁇ -tocopherol. It is a graph which shows the antioxidant power of the combination of apolactoferrin and various concentrations of ascorbic acid.
  • Apolactoferrin is a glycoprotein molecule from which iron bound in the lactoferrin molecule is released.
  • the apolactoferrin used in the present invention is not particularly limited, but preferably has the following characteristics.
  • Apolactoferrin preferably has an iron bond degree in the molecule of 5% or less, preferably 4% or less, more preferably 3% or less.
  • the degree of iron binding refers to the ratio of the number of moles of iron to the number of moles of apolactoferrin.
  • the degree of iron binding can be determined by measuring the absorbance of apolactoferrin by spectroscopic analysis, or by directly measuring the amount of iron in apolactoferrin by atomic absorption analysis or inductively coupled plasma (ICP) spectroscopy.
  • the degree of iron binding refers to a value obtained by dissolving apolactoferrin powder in pure water to make a 1 w / v% solution, and measuring this at an absorbance of 470 nm.
  • the total cation concentration in the aqueous solution is preferably 5 mmol / L or less.
  • the total cation concentration is determined by dissolving apolactoferrin powder in 0.1N hydrochloric acid to prepare a 0.1 w / v% solution, and measuring the amount of each cation by atomic absorption photometry. And add them together.
  • the total cation concentration may correspond to a salt (ion) contained as an impurity in the apolactoferrin powder.
  • the total cation concentration is preferably 3 mmol / L or less, more preferably 1 mmol / L or less.
  • Apolactoferrin can be usually produced by adjusting the pH of an aqueous solution containing lactoferrin to the acidic side to dissociate divalent iron ions of the lactoferrin molecule.
  • Lactoferrin which is a raw material for apolactoferrin, is separated and purified from mammalian secretions such as milk (eg, milk) or processed milk products such as skim milk and whey (eg, whey) (eg, adsorbed on a cation exchange resin). Then, it may be obtained by utilizing a method of desorption with a high-concentration salt solution, a separation method by electrophoresis, a separation method by affinity chromatography, or the like. Further, it may be produced by various genetically modified cells (including microorganisms, plant cells, animal cells, insect cells, etc.), plants, animals and the like. Lactoferrin may be commercially available as pharmaceuticals, reagents, and the like.
  • mammalian secretions such as milk (eg, milk) or processed milk products such as skim milk and whey (eg, whey) (eg, adsorbed on a cation exchange resin). Then, it may be obtained by
  • Lactoferrin is preferably derived from natural products, more preferably from whey. Whey obtained as a by-product generated when producing a dairy product (for example, cheese, casein, etc.) from cow milk or skim milk can be suitably used as a source of lactoferrin.
  • a dairy product for example, cheese, casein, etc.
  • Apolactoferrin can be preferably produced, for example, by adding an acid to the solution when the lactoferrin-containing solution is ultrafiltered to dissociate iron ions bound to lactoferrin.
  • the acid that can be used here include citric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, malic acid, and acetic acid (0.4 M or more), and citric acid is preferable.
  • apolactoferrin is partitioned by these membranes in which bipolar membranes and cation exchange membranes, which are composite ion exchange membranes having a structure in which a cation exchange membrane and an anion exchange membrane are laminated, are alternately arranged. It can be suitably manufactured also by using an electrodialyzer having an acid chamber and a base chamber (for example, Patent Document 5). In this case, hydrochloric acid produced during the manufacturing process in the electrodialyzer is used as the acid.
  • the pH on the acidic side to be adjusted is preferably 0.5 to 3, more preferably 1.5 to 2.5.
  • the pH is close to neutral (for example, 5.5)
  • the antibacterial properties of the obtained apolactoferrin may be weakened.
  • a pH adjuster of an aqueous solution containing lactoferrin not only the acid but also phthalic acid, glycine and the like can be used. These pH adjusting agents are added to an aqueous solution containing lactoferrin in an amount suitable for adjusting the pH to the above value.
  • the temperature at which the pH of the aqueous solution containing lactoferrin is adjusted to the acidic side is preferably not high considering protein denaturation. Usually, it is 5 ° C to 60 ° C, more preferably 15 ° C to 35 ° C, and even more preferably room temperature.
  • apolactoferrin in the present invention will be described in detail in Preparation Example 1 below, but the production method of apolactoferrin is not limited to these. Moreover, you may modify
  • apolactoferrin can usually be obtained in the form of an aqueous solution. You may use the form of aqueous solution, or you may use the form which removed the solvent and pulverized.
  • a milk component hydrolyzate As the terminal glycation product binder, a milk component hydrolyzate can be suitably used. Milk component hydrolysates can be prepared by treating whey with endoproteases, exopeptidases, and endopeptidases. For this reason, it is also referred to as “whey hydrolyzate”. Whey is a milk-derived component in which casein, which is the main component of milk protein, is removed from raw milk (eg, milk). Whey obtained as a by-product generated when producing a dairy product (for example, cheese, casein, etc.) from cow's milk or skim milk can be suitably used for preparing a milk component hydrolyzate.
  • casein which is the main component of milk protein
  • the type of enzyme for treating whey and the mode of action are not limited.
  • mammalian secretions such as milk (eg, milk) or skim milk can also be used, in which case the casein is removed prior to treatment with the enzyme. It is preferable to do.
  • the processing conditions (including temperature and time) of the proteolytic enzyme for milk-derived protein in whey can be appropriately determined in consideration of protein denaturation and the enzyme's working temperature.
  • the endoprotease is preferably bovine gastric mucosa-derived pepsin; EC3.4.23.1 is preferred, and the exopeptidase is preferably Aeromonas Proteolytica-derived aminopeptidase; EC3.4.11.10 is preferred, and the endopeptidase is bovine pancreas-derived chymotrypsin type II; EC3.4 .21.1 is preferred.
  • the processing temperature of the endoprotease, exopeptidase, and endopeptidase enzyme is preferably 20-60 ° C, more preferably 40-60 ° C, and even more preferably about 50 ° C.
  • the endoprotease, exopeptidase, and endopeptidase may act simultaneously or separately.
  • the treatment time is preferably 0.5 to 5 hours, more preferably 1 to 3.5 hours.
  • the ratio of the combination to act is Unit / 1 kg protein, preferably 1-1000: 1-10: 1-100, more preferably 100-1000: 1-2: 5-20 and even more Preferably, it is about 1000: 1: 10.
  • a proteolytic enzyme In order to prepare a milk component hydrolyzate, it is preferable to cause a proteolytic enzyme to act on whey in substantially the same manner as in Preparation Example 2 below.
  • the milk component hydrolyzate When the milk component hydrolyzate is contained in a product or composition, it may be in the form of an aqueous solution, or may be in the form of powder by removing the solvent (for example, by freeze drying).
  • the milk component hydrolyzate has binding properties to AGEs, particularly glyceraldehyde-derived AGEs.
  • AGEs particularly glyceraldehyde-derived AGEs.
  • a milk component hydrolyzate when ingested as a food, a milk component hydrolyzate adsorbs food AGEs and inhibits absorption from the intestinal tract, thereby reducing the amount of AGE derived from glyceraldehyde that is converted from food AGEs in the body. .
  • it when introduced into the body, it is useful as an anti-glyceraldehyde-derived AGE agent or as a preventive or therapeutic agent for diseases involving glyceraldehyde-derived AGE, for example, diabetes and its complications, or Alzheimer's disease.
  • Monocytes which are known to increase blood AGEs concentration in patients suffering from diabetes or with aging, and increase blood AGEs (especially glucose-derived AGE), which is a marker of vascular disorders in blood Chemotactic activator (MCP-1) can also increase, but milk component hydrolysates can suppress the increase in MCP-1 that can be attributed to such increased levels of AGEs in the blood.
  • MCP-1 Chemotactic activator
  • the milk component hydrolyzate can preferably penetrate the skin.
  • Such a milk component hydrolyzate can permeate a commercially available artificial skin membrane (for example, available from Toray Industries, Inc.).
  • the artificial skin membrane may be a membrane capable of cutting off a molecular weight of about 2000.
  • Such a milk component hydrolyzate can be used as a material for suppressing the accumulation of subcutaneous AGEs, and is used as a cosmetic.
  • Antioxidant means any substance having free radical scavenging ability. Those having an excellent antioxidant effect or those having high safety to living bodies are preferable. Antioxidants that are suitable for the products in the fields detailed below or approved for application thereto are preferred. Examples of antioxidants include ascorbic acid, ⁇ -tocopherol, polyphenols (catechin, curcumin, anthocyanin, cacao mass polyphenol, isoflavone, rutin, etc.), carotenoids (lycopene, ⁇ -carotene, capsaicin, etc.), allyl sulfide, saponin, Examples include, but are not limited to sesamin. Antioxidants are readily available to those skilled in the art and can be obtained commercially or by means such as in-house preparation.
  • the antibacterial substance refers to any substance having a bactericidal action, a sterilizing action, or a bacteriostatic action on bacterial cells. Those having excellent antibacterial action or those having high safety to living bodies are preferable. Antibacterial substances that are suitable for the products in the fields detailed below or approved for application thereto are preferred. As used herein, “antibacterial substance” excludes apolactoferrin.
  • Antibacterial substances include, for example, citric acid, nisin, ascorbic acid, poly-L-lysine, glycine, methylparaben, cetylpyridinium chloride (CPC), benzoic acid, sorbic acid, silver, vitamin K2 (menaquinone), picolinic acid, imidazole 1,2-hexanediol, 1,2-pentanediol, 1,2-octanediol, 1,3-butylene glycol and the like, but are not limited thereto.
  • the advanced glycation end product binders described above can also be used as antimicrobial substances.
  • Antibacterial substances are readily available to those skilled in the art and can be obtained commercially or by means such as self-preparation.
  • composition consisting of a combination can exert a useful action or effect in combination with at least one of a terminal glycation product binder, an antioxidant and an antibacterial substance.
  • Apolactoferrin can enhance antibacterial properties in combination with a terminal glycation product binder, and can also exhibit antibacterial properties even in a state of excessive AGEs.
  • Antioxidant power can be enhanced in combination with an antioxidant.
  • Antibacterial properties can be enhanced in combination with antibacterial substances. Therefore, a composition comprising the combination shown above is provided.
  • compositions comprising the combinations shown above can be used as a form of use by adding individual substances to the product separately (used as additives) so that the combination shown above is used, or from the combination shown above May be provided as a product comprising the composition.
  • Such products may contain any other materials, additives, etc. as long as they do not interfere with the effect of the combination.
  • Compositions comprising the combinations shown above include foods, cosmetics, mouth cleansing agents, topical skin preparations, ophthalmic products, surface coating agents (for example, food packaging containers or cans), polymer additives, deodorants (for example, , Deodorant mist), detergent, perfume and the like.
  • an ophthalmic product can be prepared by combining apolactoferrin and an antimicrobial substance with ingredients that can be commonly used in ophthalmic products.
  • the product may be in the form of a solution or may be in the form of powder by removing the solvent (for example, by lyophilization).
  • the apolactoferrin is contained in the product in a concentration of, for example, 0.01 to 20, preferably 0.1 to 10, more preferably 0.5 to 5 (unit: w / v%).
  • the terminal glycation product binder may be contained or added so as to have a concentration (unit: w / v%) of, for example, 0.05 to 20, preferably 0.1 to 10, more preferably 0.5 to 3.
  • the antioxidant may be contained or added so as to have a concentration (unit: w / v%) of, for example, 0.01 to 10, preferably 0.05 to 5, more preferably 0.1 to 2.
  • the antibacterial substance can be contained or added so as to have a concentration (unit: w / v%) of, for example, 0.01 to 10, preferably 0.05 to 5, more preferably 0.1 to 2.
  • lactoferrin 10 kg of 50 mg / mL lactoferrin (manufactured by Fontera; iron binding degree is about 20%) was used.
  • lactoferrin was treated with 0.1M citric acid.
  • the lactoferrin solution was put into a supply tank of the apparatus, circulated for 10 minutes, and then circulated in the reverse direction for 5 seconds to concentrate the solution.
  • the pressure and circulating fluid flow rate at the inlet and outlet of the UF membrane were set to 0.12 Mpa, 0.08 Mpa, and 15 L / min, respectively. This operation was repeated until the non-permeated concentrate was halved (this was defined as one round).
  • the citric acid solution was put into the tank instead of the lactoferrin solution, and the same operation as above was performed for two rounds. Subsequently, 8 M ⁇ ⁇ cm or more of pure water was put into the tank, and the above operation was performed for 5 rounds to remove the acid remaining in the non-permeated concentrate.
  • the temperature of the circulating liquid was in the range of 10 to 28 ° C. throughout the production process, and the pH was 2 to 3.
  • the powder obtained by each acid treatment was apolactoferrin and the purity of apolactoferrin was measured using BIOXYTECH (registered trademark) Lacto f EIA TM (OXIS International Inc., Oregon, USA) after dissolving the powder in pure water. Determined by performing antibody quantification.
  • the iron binding degree of the powder obtained by each acid treatment is dissolved in pure water so as to have a concentration of 1 w / v%, and then the amount of iron bound to apolactoferrin is measured at an absorbance of 470 nm. Determined by measuring.
  • Table 1 shows the degree of iron binding of the obtained apolactoferrin.
  • the iron bond degree was 2.95%.
  • the total cation concentration of apolactoferrin having an iron binding degree of 2.95% was measured.
  • 0.1N hydrochloric acid to the lyophilized powder of apolactoferrin, preparing a 0.1 w / v% apolactoferrin solution and measuring for Na, K, Ca, Mg, and Cu by atomic absorption spectrophotometry, these When the concentration of each cation was determined and the total was converted to the total cation concentration, the total cation concentration was 3.9 mmol / L.
  • the lyophilized whey hydrolyzate was dissolved in pure water so as to be 10 mg / mL, and this was designated as A solution.
  • a transverse membrane permeable cell having phases on both sides sandwiching an artificial skin membrane (Toray Industries, Inc.) was produced. Liquid A was put in one phase of the membrane permeation cell, and pure water was put in the other phase, and the whole cell was brought to a constant temperature by circulating water at 25 ° C. Both phases were stirred for 10 minutes at a speed of 120 rpm. After stirring for 10 minutes, the solution was taken out from the phase containing pure water, and this was designated as solution B.
  • solution A solution before starting stirring
  • solution B in which lyophilized whey hydrolyzate was dissolved in pure water were subjected to the conditions described below according to the method used in the transdermal absorption evaluation test.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • freeze-dried whey hydrolyzate (hereinafter simply referred to as “freeze-dried whey hydrolyzate”) that was freeze-dried after the enzyme treatment as described above was used.
  • the obtained solution was made into a sterile solution by passing through a filter having a pore size of 0.22 ⁇ m in a clean bench.
  • the lid of the 50 mL falcon tube was sealed with parafilm and incubated at 37 ° C. for 1 week to react DL-glucose and HSA.
  • the solution was applied to a PD-10 column (GE Healthcare Bioscience) to remove unreacted DL-glucose, and the result was confirmed by HPLC to obtain a glucose-derived terminal glycation product (glucose-derived AGE) fraction. It was.
  • DL-glyceraldehyde and 39 mg of diethylenetriamine-pentaacetic acid as a chelating agent were weighed and placed in a 50 mL falcon tube.
  • 20 mL of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) was added to the falcon tube, and DL-glyceraldehyde and diethylenetriamine-pentaacetic acid were dissolved with a vortex mixer.
  • 500 mg of human serum albumin (HSA) (manufactured by Sigma) was added to the falcon tube and dissolved with a vortex mixer.
  • the obtained solution was made into a sterile solution by passing through a filter having a pore size of 0.22 ⁇ m in a clean bench.
  • the lid of the 50 mL falcon tube was sealed with parafilm and incubated at 37 ° C. for 1 week to react DL-glyceraldehyde with HSA.
  • the solution was applied to a PD-10 column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) to remove unreacted DL-glyceraldehyde, the result was confirmed by HPLC, and glyceraldehyde-derived glycation product (glyceraldehyde-derived AGE) ) A fraction was obtained.
  • glucose-derived AGE or glyceraldehyde-derived AGE in the fraction obtained as described above was confirmed by an ELISA method using a monoclonal antibody.
  • the anti-glucose-derived AGE monoclonal antibody or the anti-glyceraldehyde-derived AGE monoclonal antibody was consigned to Toyobo Co., Ltd. and produced from mice using glucose-derived AGE or glyceraldehyde-derived AGE as an antigen.
  • anti-monoclonal antibodies are biotinylated with the biotinylation reagent EZ-Link (registered trademark) Sulfo-NHS-Biotinylation Kit (PIERCE, product code 21420), and the biotinylated anti-monoclonal antibody is labeled with streptavidin peroxidase (Nacalai Tesque, product). Code 02517-61) was coupled.
  • any of the terminal glycation products prepared above and peroxidase-labeled streptavidin were bound to wells on which HSA antibodies (RayBiotech, Inc.) were immobilized. Biotinylated anti-monoclonal antibodies were added and chemiluminescence was detected to confirm the production of these terminal glycation products, glucose-derived AGE and glyceraldehyde-derived AGE.
  • Example 1 Bacteria used for the antibacterial test were prepared as follows. Escherichia coli (NBRC 3972) purchased from the National Institute of Biotechnology, Biotechnology Headquarters (NBRC), was stored in a liquid by subculture in 5 mL of SCD bouillon (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) . 50 ⁇ L of the stored E. coli solution was inoculated into 5 mL of SCD bouillon (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and cultured at 30 ° C. for 16 hours in a shaking water bath. The cultured bacterial solution was diluted with sterilized water to prepare 10-fold serial dilutions up to 10 7 -fold.
  • a test series for examining antibacterial properties was prepared as follows. In a 96-well flat-bottom microplate (BDalFalcon), an 8 w / v% aqueous solution of apolactoferrin (prepared in Preparation Example 1) (sterilized with a filter having a pore size of 0.22 ⁇ m) was diluted several times with sterile water, and 50 ⁇ L each. A dilution series was prepared. The concentration of apolactoferrin in the wells was 0-2 w / v%.
  • freeze-dried whey hydrolyzate (terminal glycation product binder) prepared in Preparation Example 2 is added to the addition series of glucose-derived AGE or glyceraldehyde-derived AGE so that the final concentration is 2.5 w / v%.
  • a terminal glycation product binder addition series was also obtained.
  • the microplate test system and the petri dish test system were cultured at 35 ° C. for 24 hours. After culturing, the test microplate was measured for turbidity (absorbance) at a wavelength of 630 nm with a microplate reader (Multiscan JX Thermo Labsystems), and the increase or decrease in the number of bacteria after the culture was examined.
  • FIG. 2 shows the results of investigating the antibacterial properties of the combined use of apolactoferrin and a terminal glycation end product binder when a terminal glycation product is added (Figure 1: When glucose-derived AGE is added; Figure 2: Derived from glyceraldehyde) When AGE is added).
  • FIG. 1 is a graph showing the absorbance in an E. coli culture solution by apolactoferrin alone (no addition of glucose-derived AGE), apolactoferrin when glucose-derived AGE is added, and apolactoferrin and a terminal glycation product binder when glucose-derived AGE is added.
  • FIG. 2 shows an E.
  • FIG. 1 is glucose-derived AGE
  • FIG. 2 is glyceraldehyde-derived AGE
  • the white squares represent the results when each AGE and the terminal glycation product binder were added to the apolactoferrin solution.
  • Example 2 The bacterial cells were prepared in the same manner as in Example 1. Next, a 96-well flat-bottom microplate (BD Falcon) was diluted 8 times with an aqueous solution of 8 w / v% apolactoferrin (prepared in Preparation Example 1) using sterile water with a pore size of 0.22 ⁇ m. A 50 ⁇ L dilution series was prepared. The concentration of apolactoferrin in the wells was 0-2 w / v%.
  • each apolactoferrin concentration system 50 ⁇ L each of various reagents (shown in Table 1 below) having been sterilized with a pore size of 0.22 ⁇ m and multiple dilutions of 8 w / v% with sterile water was added. was prepared.
  • the combination reagents used are as follows: citric acid (Nacalai Tesque), lyophilized whey hydrolyzate (prepared in Preparation Example 2), nisin (SIGMA), ascorbic acid (Nacalai Tesque), poly -L-lysine (SERVA Electrophoresis GmbH), glycine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), methylparaben (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), cetylpyridinium chloride (CPC) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Apolactoferrin and a combination reagent were combined at concentrations of 0, 0.03, 0.06, 0.13, 0.25, 0.5, 1 and 2 (unit: w / v%) to prepare a test system. Subsequently, these test systems were inoculated and cultured in the same manner as in Example 1, and the increase or decrease in the number of bacteria after the culture was examined.
  • Antimicrobial properties were enhanced by combining any of the reagents used with apolactoferrin.
  • Example 3 A dimethyl sulfoxide solution of 20 w / v% DL- ⁇ -tocopherol (CALBIOCHEM) was prepared. 5 ⁇ L of this was added to 500 ⁇ L of an aqueous solution of 2 w / v% apolactoferrin (prepared in Preparation Example 1), and then prepared with ultrapure water so that the ⁇ -tocopherol concentration was 0.1 w / v%. Similarly, ⁇ -tocopherol concentrations were adjusted to 0.05, 0.025, and 0.01 (unit: w / v%) to obtain test samples.
  • test sample was subjected to FRAS4 (active oxygen / free radical automatic analyzer; Wismer Co., Ltd.) according to the manufacturer's protocol, and the antioxidant power was measured.
  • FRAS4 active oxygen / free radical automatic analyzer
  • FIG. 3 shows the antioxidant power of the combination of apolactoferrin and various concentrations of ⁇ -tocopherol.
  • the horizontal axis represents the ⁇ -tocopherol concentration (%) (w / v) in the culture solution.
  • the vertical axis shows the antioxidant power ( ⁇ mol / L).
  • white circles show the results when ⁇ -tocopherol is used alone, and black circles show the results when ⁇ -tocopherol is added to the apolactoferrin solution. It became clear that it has an additive effect in the antioxidant effect.
  • FIG. 4 shows the antioxidant power of combinations of apolactoferrin and various concentrations of ascorbic acid.
  • the horizontal axis indicates the concentration (%) (w / v) of ascorbic acid in the culture solution.
  • the vertical axis shows the antioxidant power ( ⁇ mol / L).
  • the white circle represents the result when ascorbic acid alone, and the black circle represents the result when ascorbic acid was added to the apolactoferrin solution. It became clear that it has an additive effect in the antioxidant effect.
  • foods, cosmetics, mouth cleansing agents, external preparations for skin, ophthalmic products, surface coating agents (for example, for food packaging containers or cans), polymer additives, deodorizing agents (for example, deodorizing mist) A composition that can be suitably used for detergents, perfumes and the like is obtained.

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Abstract

 本発明によれば、アポラクトフェリンと、終末糖化産物結合剤、抗酸化物質および抗菌物質からなる群から選択される少なくとも1種とからなる組成物が提供される。終末糖化産物結合剤は、ホエイをエンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、およびエンドペプチダーゼで加水分解することにより得られる乳成分加水分解物であり得る。本発明によれば、食品、化粧品、口内清浄剤、皮膚外用剤、眼科用製品、表面被覆剤、ポリマー添加剤、消臭剤、洗剤、香水などに好適に利用可能な組成物が得られる。

Description

アポラクトフェリン含有組成物
 本発明は、アポラクトフェリンを含有する組成物に関する。
 ラクトフェリンは、生体中で鉄運搬作用を担うトランスフェリンファミリーの鉄結合糖タンパク質であり、1960年に単離された。ラクトフェリンの機能については、殺菌または静菌作用、免疫機能の調節作用、有用な腸内細菌の保護および育成、フリーラジカル(含活性酸素)の抑制などに関する多くの研究が実施されており、特に、殺菌または静菌作用は効果が明確であることから研究が進んでいる。その殺菌または静菌の機序は、ラクトフェリンが細菌やウイルスの細胞膜にとりついて、細胞膜を壊すことによって直接的に菌を殺す、またはラクトフェリンが細菌の成長や維持に必要な鉄を奪い取り、細菌を鉄欠乏の状態にして、細菌の生存を抑制するという作用によると考えられる。
 ラクトフェリンは、約690個の鎖状アミノ酸からなり、その三次元構造には2つの鉄結合ポケットがあり、当該ポケットに鉄が1個ずつ結合する。このポケットに鉄が100%結合したものを「ホロラクトフェリン」、そして鉄が結合していないものを「アポラクトフェリン」という。通常のウシ由来ラクトフェリンは、ポケットの15~20%に鉄が入り込んでいるので、その粉末や溶液はピンク色をしており、鉄の結合度が高くなればなるほど赤みが増す。他方、鉄を取り除いたアポラクトフェリンは白色をしており、外観で容易に見分けがつく。アポラクトフェリンは、通常のラクトフェリンよりも求鉄性が高くなっており、抗菌または静菌効果が格段に高い。
 ラクトフェリンは、フリーの鉄を結合・固定するために、抗酸化物質としても分類される。この求鉄作用が大きなアポラクトフェリンは、ラクトフェリンよりも抗酸化物質としての能力が高い。
 アポラクトフェリンは上述したような有用な性質を有するので、種々の分野において利用されている。例えば、眼科用組成物、化粧品などのように、アポラクトフェリンを利用した種々の組成物が知られている(特許文献1~4)。
 ところで、各種還元糖とタンパク質(アミノ酸)との間に生じるメイラード反応は、食品の加工または貯蔵によって進行し、加工食品に色または香りを付与し、更には、食品成分を安定化させることで、抗酸化作用または抗変異原性を高めることが知られている。一方で、この反応が、生体内で生じた場合、特に、高血糖状態が持続する糖尿病患者には、反応生成物である終末糖化産物(AGEs)が生体作用物質として挙動し、一部のAGEsでは毒性を示すことも知られている。
 AGEsは、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症などの糖尿病血管合併症の発症および進展に深く関わっていることが分かってきた。そのため、AGEsは、糖尿病診断において既に広く利用されている。ヘモグロビンA1C(HbA1C)は、メイラード反応前期のアマドリ転移物であり、食事の影響を受けないことから糖尿病診断の重要な指標となっている。メイラード反応前期で、アマドリ転移物が酸素(O)を一電子還元して、活性酸素であるスーパーオキシドアニオンを発生させる。この反応は、常態でも進行するが、生体内のように、銅または亜鉛のような遷移金属が豊富に存在する環境ではその触媒作用により、活性酸素の発生は100倍以上に増加する。さらに、発生したスーパーオキシドアニオンは、過酸化水素(H)およびヒドロキシラジカル(・OH)を派生させる。加えて、これらの活性酸素が身体の中の一酸化窒素(NO)と反応して、酸化力の大きなペルオキシナイトライト(ONOO)を産生し、これらのフリーラジカルが臓器として繊細な眼、腎臓、血管内皮などを傷害する。また、メイラード反応後期で、生成した(不可逆的な)AGEsが、AGEs受容体(Receptor of AGEs; RAGEと略される)を介して血管内皮細胞または血管平滑筋細胞、あるいはマクロファージの細胞内に信号を伝え、種々の障害を引き起こすことが明らかになっている。しかし、RAGEを遺伝的に発現しないようにしたり、RAGEの抗体を大量に投与したりしても、AGEsによる細胞障害性を完全には防ぐことができないことも分かっている。したがって、AGEsがRAGEを介することなく直接細胞に障害をもたらす機序も存在することが示唆されている。これらの血中のAGEsは、糖尿病だけでなく、加齢によりAGEsの代謝および排泄が減弱した老化によっても増加する。
 身近な加工食品の中にも多種のAGEsが少なからぬ量存在している。パン、ビスケット、味噌、醤油、日本酒、ビール、ココア、ワインなどの食品の茶褐色画分の多くが、AGEsに起因する。AGEsの産生量は、加工時の温度、pH、溶解酸素濃度などによって規定される。これら、加工食品中のAGEsの多くが消化管内で消化および分解され、身体の中へ吸収される。摂取したAGEsのうち6~7%が生体内に留まると試算されている。腎臓病患者では、AGEsの排泄が進まないために、生体内に留まる割合が高くなることが報告されている。このことから、食物性(つまり外来性)AGEsが、身体の中で、生体作用物質AGEsとして機能する可能性があることが示唆されている。
 ラクトフェリンがAGEsと高い結合性を有することは早くから知られていたが、その詳細な研究成果が発表されるようになったのは1990年代からである。ラクトフェリンは、AGEsに結合する2つのドメインを有し、それらは17個から18個のアミノ酸のループであることが分かっている。このループの端にはそれぞれシステインが付いていることから、システインループと呼ばれることもある。このループは、著しい親水性を呈することが分かっており、他のAGEsに比較的結合しやすいペプチドであるライソザイムやディフェンシンなどの結合部位も同様に高い親水性を示すことから、AGEsとタンパク質あるいはペプチドとの結合には親水性環境が有利であることが示唆されている。
 AGEsの結合性について、アポラクトフェリンと通常のラクトフェリンとの間には大きな差はなく、僅かに、アポラクトフェリンの結合性が通常のラクトフェリンを上回る程度である(アポラクトフェリンとの解離定数:2.0×10-7M;通常のラクトフェリンとの解離定数:2.4×10-7M)。この結合性の僅かな高まりは、ラクトフェリンのアポ化による三次元構造の変化に起因すると考えられる。
特開2007-137817号公報 特開2007-277153号公報 特開2008-63303号公報 国際特許出願公開第2008/032847号公報 特開2006-188446号公報
 本発明は、アポラクトフェリンを含有する有用な組成物を提供することを目的とする。
 本発明は、アポラクトフェリンと、終末糖化産物結合剤、抗酸化物質および抗菌物質からなる群から選択される少なくとも1種とからなる組成物を提供する。
 1つの実施態様では、上記終末糖化産物結合剤は、ホエイをエンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、およびエンドペプチダーゼで加水分解することにより得られる乳成分加水分解物である。
 本発明によれば、アポラクトフェリンを、終末糖化産物結合剤、抗酸化物質または抗菌物質と組み合わせることにより、有用な効果を発揮する組成物が提供される。
アポラクトフェリン単独(グルコース由来AGE非添加)、グルコース由来AGE添加時のアポラクトフェリン、およびグルコース由来AGE添加時のアポラクトフェリンおよび終末糖化産物結合剤による大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。 アポラクトフェリン単独(グリセルアルデヒド由来AGE非添加)、グリセルアルデヒド由来AGE添加時のアポラクトフェリン、およびグリセルアルデヒド由来AGE添加時のアポラクトフェリンおよび終末糖化産物結合剤による大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。 アポラクトフェリンと種々の濃度のα-トコフェロールとの組み合わせの抗酸化力を示すグラフである。 アポラクトフェリンと種々の濃度のアスコルビン酸との組み合わせの抗酸化力を示すグラフである。
 (アポラクトフェリン)
 アポラクトフェリンとは、ラクフェリン分子中に結合されている鉄が遊離した糖蛋白分子である。本発明で使用するアポラクトフェリンは特に限定されないが、以下の特性を有することが好ましい。
 アポラクトフェリンは、その分子中の鉄結合度が5%以下、好ましくは4%以下、さらに好ましくは3%以下であることが好ましい。ここで、鉄結合度とは、アポラクトフェリンのモル数に対する鉄のモル数の割合をいう。鉄結合度は、分光分析によりアポラクトフェリンの吸光度を測定すること、あるいは原子吸光分析や誘導結合プラズマ(ICP)分光分析によりアポラクトフェリン中の鉄量を直接測定することによって決定され得る。本発明においては、鉄結合度は、アポラクトフェリン粉末を純水に溶解して1w/v%溶液とし、これを470nmの吸光度で測定して求めたものをいう。
 アポラクトフェリンは、1w/v%の濃度でアポラクトフェリンを含む水溶液を調製した場合に、該水溶液中の総陽イオン濃度が5mmol/L以下であることが好ましい。総陽イオン濃度の決定は、アポラクトフェリン粉末を0.1N塩酸に溶解して0.1w/v%溶液を調製し、原子吸光光度法によって各陽イオン量を測定することにより各陽イオンの濃度を求め、これらを合算する。総陽イオン濃度は、アポラクトフェリン粉末に不純物として含有される塩(イオン)に相当し得る。上記の0.1N塩酸によって、ラクトフェリンに結合しているイオンではなく、その粉末に混入している塩のみが溶け出され得るためである。総陽イオン濃度は、好ましくは、3mmol/L以下であり、より好ましくは、1mmol/L以下である。
 アポラクトフェリンは、通常、ラクトフェリンを含有する水溶液のpHを、酸性側に調節して、ラクトフェリン分子が有する2価の鉄イオンを解離させることにより、製造され得る。
 アポラクトフェリンの原料となるラクトフェリンは、乳汁(例えば、牛乳)などの哺乳動物の分泌液または脱脂乳、ホエイ(乳清)などの乳汁加工物からの分離精製(例えば、カチオン交換樹脂に吸着させた後、高濃度塩類溶液で脱離させる方法、電気泳動による分離法、アフィニティークロマトグラフィーによる分離法など)を利用することによって得られたものであってもよい。さらに遺伝子組換えした種々の細胞(微生物、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞などを含む)、植物、動物などにより産生されたものであってもよい。ラクトフェリンは、医薬品、試薬などとして市販されているものであってもよい。ラクトフェリンは、好ましくは、天然物に由来し、より好ましくは、乳清由来のものである。牛乳または脱脂乳から乳製品(例えば、チーズ、カゼインなど)を製造する際に発生する副産物として得られるホエイは、ラクトフェリンの供給源として好適に用いられ得る。
 アポラクトフェリンは、好適には、例えば、ラクトフェリン含有液を限外濾過する際に該液に酸を添加し、ラクトフェリンに結合している鉄イオンを解離させることによって製造され得る。ここで用いられ得る酸としては、例えば、クエン酸、塩酸、リン酸、リンゴ酸、または(0.4M以上の)酢酸が挙げられるが、クエン酸が好ましい。あるいは、アポラクトフェリンは、例えば、カチオン交換膜とアニオン交換膜とが張り合わさった構造を有する複合イオン交換膜であるバイポーラ膜とカチオン交換膜とが交互に配列されて、これらの膜により仕切られた酸室と塩基室とを有する電気透析装置を使用することによっても、好適に製造され得る(例えば、特許文献5)。この場合、酸としては、電気透析装置での製造工程の間に産生される塩酸が用いられる。
 アポラクトフェリンの製造において、調節される酸性側のpHは、好ましくは0.5~3であり、より好ましくは1.5~2.5である。pHが中性に近い場合(例えば、5.5)では、得られるアポラクトフェリンの抗菌性が弱くなることがある。ラクトフェリンを含有する水溶液のpH調整剤としては、上記酸だけでなく、フタル酸、グリシンなども用いられ得る。これらのpH調整剤は、ラクトフェリンを含有する水溶液に、そのpHを上記の値に調節するに適切な量で添加される。
 ラクトフェリンを含有する水溶液のpHを酸性側へ調節する際の温度は、蛋白の変性を考慮すると高温でないほうが好ましい。通常5℃~60℃、より好ましくは15℃~35℃であり、さらにより好ましくは室温である。
 本発明におけるアポラクトフェリンの具体的な製造については、以下の調製例1に詳述するが、アポラクトフェリンの製造方法はこれらに限定されない。また、アポラクトフェリンとして市販されているものを上記の鉄結合度および総陽イオン濃度を有するように改質してもよい。
 アポラクトフェリンの製造の際に、通常、アポラクトフェリンは水溶液の形態で得られ得る。水溶液の形態を用いても、あるいは溶媒を除去して粉末化した形態を用いてもよい。
 (終末糖化産物結合剤)
 終末糖化産物結合剤としては、乳成分加水分解物が好適に用いられ得る。乳成分加水分解物は、ホエイをエンドプロテアーゼ、エキソペプチダーゼ、およびエンドペプチダーゼで処理することにより調製され得る。このため、「ホエイ加水分解物」ともいう。ホエイは、乳タンパク質の主成分であるカゼインが生乳(例えば牛乳)から取り除かれている乳由来成分である。牛乳または脱脂乳から乳製品(例えば、チーズ、カゼインなど)を製造する際に発生する副産物として得られるホエイは、乳成分加水分解物を調製するために好適に用いられ得る。
 AGEs(特にグリセルアルデヒド由来AGE)に結合可能であり、そして好ましくは皮膚膜を透過可能である、乳成分加水分解物を調製できれば、ホエイを処理する酵素の種類および作用様式は問わない。乳成分加水分解物を調製するための出発材料としては、乳汁(例えば、牛乳)などの哺乳動物の分泌液または脱脂乳もまた用いられ得るが、この場合、酵素で処理する前にカゼインを除去することが好ましい。ホエイ中の乳由来タンパク質に対するタンパク質分解酵素の処理条件(温度および時間を含む)は、タンパク質の変性および酵素の作用温度を考慮して適宜決定され得る。
 エンドプロテアーゼとしては、ウシ胃粘膜由来ペプシン;E.C.3.4.23.1が好ましく、エキソペプチダーゼとしては、Aeromonas Proteolytica由来アミノペプチダーゼ;E.C.3.4.11.10が好ましく、エンドペプチダーゼとしては、ウシ膵臓由来キモトリプシンII型;E.C.3.4.21.1が好ましい。エンドプロテアーゼ、エキソペプチダーゼ、およびエンドペプチダーゼの酵素の処理温度は、好ましくは20~60℃、より好ましくは40~60℃であり、なおより好ましくは約50℃である。エンドプロテアーゼ、エキソペプチダーゼ、およびエンドペプチダーゼは、同時に作用させても、あるいは別々に作用させてもよい。同時に作用させる場合、処理時間は、好ましくは0.5~5時間、より好ましくは1~3.5時間である。作用させる組合せの比率は、Unit/1kgタンパク質で、好ましくは、1~1000:1~10:1~100であり、より好ましくは、100~1000:1~2:5~20であり、なおより好ましくは、約1000:1:10である。
 乳成分加水分解物を調製するには、以下の調製例2と実質的に同様にして、ホエイにタンパク質分解酵素を作用させることが好ましい。
 乳成分加水分解物は、製品または組成物に含有させる場合、水溶液の形態であっても、あるいは溶媒を除去して粉末化した形態(例えば、凍結乾燥による)であってもよい。
 乳成分加水分解物は、AGEs、特にグリセルアルデヒド由来AGEに対する結合性を有する。例えば、乳成分加水分解物は、食品として摂取した場合、食物性のAGEsを吸着して腸管からの吸収を阻害し、これにより食物性AGEsから体内で転換されるグリセルアルデヒド由来AGE量を減ずる。また、体内に導入した場合は、抗グリセルアルデヒド由来AGE剤として、あるいはグリセルアルデヒド由来AGEが関与する疾患、例えば、糖尿病およびその合併症、またはアルツハイマー病の予防または治療剤として有用である。糖尿病罹患患者において、または老化に伴って、血中AGEs濃度が上昇することが知られており、血中のAGEs(特に、グルコース由来AGE)の上昇によって、血中の血管障害マーカーである単球走化活性化因子(MCP-1)も増加し得るが、乳成分加水分解物は、そのような血中のAGEs濃度の上昇に起因し得るMCP-1の増加を抑制し得る。
 乳成分加水分解物は、好ましくは、皮膚を透過することができる。このような乳成分加水分解物は、市販の人工皮膚膜(例えば、東レ株式会社から入手可能)を透過し得る。人工皮膚膜は、分子量約2000をカットオフ可能な膜であり得る。このような乳成分加水分解物は、皮下のAGEsの蓄積を抑制する素材としても利用可能であり、化粧料などとして用いられる。
 (抗酸化物質)
 抗酸化物質とは、フリーラジカル捕捉能を有する任意の物質をいう。抗酸化作用が優れるもの、または生体への安全性の高いものが好ましい。以下に詳述する分野の製品に適した、あるいはそれらへの適用が認可されている抗酸化物質が好ましい。抗酸化物質としては、例えば、アスコルビン酸、α-トコフェロール、ポリフェノール類(カテキン、クルクミン、アントシアニン、カカオマスポリフェノール、イソフラボン、ルチンなど)、カロテノイド(リコピン、α-カロテン、カプサイシンなど)、硫化アリル、サポニン、セサミンなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、抗酸化物質は当業者に容易に入手可能であり、市販または自家調製などの手段によって入手され得る。
 (抗菌物質)
 抗菌物質とは、菌体への殺菌作用、滅菌作用、または静菌作用を有する任意の物質をいう。抗菌作用が優れるもの、または生体への安全性の高いものが好ましい。以下に詳述する分野の製品に適した、あるいはそれらへの適用が認可されている抗菌物質が好ましい。本明細書中でいう「抗菌物質」とは、アポラクトフェリンを除く。抗菌物質としては、例えば、クエン酸、ナイシン、アスコルビン酸、ポリ-L-リジン、グリシン、メチルパラベン、塩化セチルピリジニウム(CPC)、安息香酸、ソルビン酸、銀、ビタミンK2(メナキノン)、ピコリン酸、イミダゾール、1,2-ヘキサンジオール、1,2-ペンタンジオール、1,2-オクタンジオール、1,3-ブチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。上で説明した終末糖化産物結合剤(特に、乳成分加水分解物)は、抗菌物質としても用いられ得る。また、抗菌物質は当業者に容易に入手可能であり、市販または自家調製などの手段によって入手され得る。
 (組み合わせからなる組成物)
 アポラクトフェリンは、終末糖化産物結合剤、抗酸化物質および抗菌物質のうちの少なくとも1種との組み合わせで有用な作用または効果を発揮し得る。アポラクトフェリンは、終末糖化産物結合剤との組み合わせで抗菌性を増強し得、またAGEs過多の状態であっても抗菌性を発揮し得る。抗酸化物質との組み合わせで抗酸化力を増強し得る。抗菌物質との組み合わせで抗菌性を増強し得る。したがって、上記に示した組み合わせからなる組成物が提供される。
 上記に示した組み合わせからなる組成物は、使用形態として、上記に示した組み合わせとなるように個々の物質を別々に製品に添加(添加剤として用いる)しても、あるいは上記に示した組み合わせからなる組成物を含む製品として提供されてもよい。このような製品には、組み合わせの効果を妨げない限りで他の任意の材料、添加剤などを含み得る。上記に示した組み合わせからなる組成物は、食品、化粧品、口内清浄剤、皮膚外用剤、眼科用製品、表面被覆剤(例えば、食品包装容器または缶用)、ポリマー添加剤、消臭剤(例えば、消臭ミスト)、洗剤、香水などの分野に好適に用いられ得る。例えば、アポラクトフェリンおよび抗菌物質を、眼科用製品に通常用いられ得る成分と合わせて眼科用製品を調製することができる。
 製品は、溶液の形態であっても、あるいは溶媒を除去して粉末化した形態(例えば、凍結乾燥による)であってもよい。
 製品が溶液の形態である場合、該製品中に、アポラクトフェリンは、例えば0.01~20、好ましくは0.1~10、より好ましくは0.5~5の濃度(単位はw/v%)となるように含有または添加され得る。終末糖化産物結合剤は、例えば0.05~20、好ましくは0.1~10、より好ましくは0.5~3の濃度(単位はw/v%)となるように含有または添加され得る。抗酸化物質は、例えば0.01~10、好ましくは0.05~5、より好ましくは0.1~2の濃度(単位はw/v%)となるように含有または添加され得る。抗菌物質は、例えば0.01~10、好ましくは0.05~5、より好ましくは0.1~2の濃度(単位はw/v%)となるように含有または添加され得る。
 以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
 (調製例1:アポラクトフェリンの製造)
 マイクローザUFラボテスト機(LX-22001;旭化成ケミカルズ株式会社)に、同社製のUFモジュールであるLOV(中空糸モジュール:膜内径0.8mm、有効膜面積41m、膜素材:ポリアクリロニトリル、公称分画分子量:50,000)を組み込んだ限外濾過装置を用いて、以下のようにアポラクトフェリンを製造した。
 50mg/mLのラクトフェリン(フォンテラ製;鉄結合度は約20%)溶液を10kg用いた。アポラクトフェリンの製造工程において、ラクトフェリンを0.1Mクエン酸で処理した。まず、上記ラクトフェリン溶液を装置の供給タンクに投入し、10分間循環させた後、5秒間逆方向に循環させて、溶液を濃縮した。このとき、UF膜の入口および出口の圧力、循環液流量を、それぞれ0.12Mpa、0.08Mpa、15L/分と設定した。この操作を非透過の濃縮液が半減するまで繰り返した(これを1ラウンドとする)。次いで、ラクトフェリン溶液の代わりにクエン酸溶液をタンクに投入し、上と同様の操作を2ラウンド行った。次いで、8MΩ・cm以上の純水をタンクに投入し、上記の操作を5ラウンド行い、非透過の濃縮液中に残存する酸を除去した。なお、循環液の温度は、製造工程を通して10~28℃の範囲内であり、pHは2~3であった。
 上記製造工程により、40kgの濃縮液を得た。次いで、濃縮液を凍結乾燥し、9.5gの白色粉末を得た。
 各酸処理により得られた粉末がアポラクトフェリンであることおよびアポラクトフェリンの純度を、粉末を純水に溶解後、BIOXYTECH(登録商標)Lacto f EIATM(OXIS International Inc. 米国・オレゴン)を用いて抗体定量を行うことにより決定した。
 さらに、各酸処理により得られた粉末の鉄結合度を、粉末を純水に1w/v%の濃度になるように溶解し、次いで、アポラクトフェリンに結合している鉄量を470nmの吸光度で測定することにより決定した。得られたアポラクトフェリンの鉄結合度をそれぞれ表1に示す。ここで、鉄結合度は、鉄結合度(%)=(1w/v%溶液中の鉄モル数/1w/v%溶液中のアポラクトフェリンモル数)×100によって算出した。鉄結合度は2.95%であった。
 なお、この鉄結合度2.95%のアポラクトフェリンの総陽イオン濃度を測定した。アポラクトフェリンの凍結乾燥粉末に0.1N塩酸を加え、0.1w/v%アポラクトフェリン溶液を調製し、原子吸光光度法によってNa、K、Ca、Mg、およびCuについて測定することにより、これらの各陽イオンの濃度を求め、合計したものを総陽イオン濃度と換算したところ、総陽イオン濃度は3.9mmol/Lであった。
 (調製例2:終末糖化産物結合剤の製造)
 ウシの生乳からカゼインナトリウムを製造した後の残りのホエイをタツア・ジャパン株式会社から入手した。このホエイにエンドプロテアーゼ(ウシ胃粘膜由来ペプシン;E.C.3.4.23.1;シグマ社)1000Unit/1kgタンパク質、エキソペプチダーゼ(Aeromonas Proteolytica由来アミノペプチダーゼ;E.C.3.4.11.10;シグマ社)1Unit/1kgタンパク質、およびエンドペプチダーゼ(ウシ膵臓由来キモトリプシンII型;E.C.3.4.21.1;シグマ社)10Unit/1kgタンパク質を添加し、50℃にて3.5時間処理した。このような酵素処理により得られた加水分解物を凍結乾燥し、ホエイ加水分解物を得た。
 凍結乾燥したホエイ加水分解物を10mg/mLとなるように純水に溶解し、これをA液とした。人工皮膚膜(東レ株式会社)を中心に挟んだ両側の相を有する横置型膜透過セルを作製した。この膜透過セルの片側の相にA液を入れ、そしてもう一方の相には純水を入れて、セル全体を25℃の水を循環させることによって定温とした。両相を120rpmの速度で10分間攪拌した。10分の攪拌後、純水を入れた相から溶液を取り出し、これをB液とした。
 凍結乾燥したホエイ加水分解物を純水に溶解したA液(攪拌開始前の溶液)およびB液の内容物を、経皮吸収評価法試験で用いられる方法に準じて、以下に記載する条件下で高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定した:
 カラム   ODS(資生堂製) 4.6×150mm
 溶離液   A:0.02%(v/v)TFA(溶媒HO)
       B:0.016%(v/v)TFA(溶媒ACN)
  A:B=95:5(v/v)で使用
 流速    0.75ml/分
 温度    40℃
 検出器UV 220nm。
 その結果、人工皮膚膜を透過してA液からB液に移動した物質が存在した。
 上記のA液およびB液について、分子間相互作用定量水晶天秤(QCM)装置「AFFINIXQ」(型番:QCM2000;株式会社イニシアム)を用いて、グリセルアルデヒド由来AGE(以下の参考例にて調製)との相互作用(解離定数)を調べた。
 分子間相互作用定量水晶天秤(QCM)装置「AFFINIXQ」(型番:QCM2000;株式会社イニシアム)の専用センサーチップに、100μg/mLのグリセルアルデヒド由来AGE 1μLを滴下し、十分に風乾し、次いで超純水でチップを洗浄した。グリセルアルデヒド由来AGEを固定したチップを上記装置に装着し、8mLの超純水を入れた試験容器に挿入した。上記A液またはB液の凍結乾燥物を超純水で1mg/mLとした被験物質溶液を8μL取り、試験容器に添加した。装置のディスプレイ上でチップ上のグリセルアルデヒド由来AGEと被験物質との結合が安定になったことを確認し、上記被験物質溶液8μLをさらに添加する。この操作を2~4回繰り返し、グリセルアルデヒド由来AGEと被験物質との相互作用を示す平衡曲線(吸着曲線)を作成した。装置に内蔵した専用測定解析ソフトウェアで結果を解析し、解離定数を算出した。
 A液およびB液のそれぞれについて、ソフトウェアによる解析から、A液では解離定数K=1.60×10-4Mであり、そしてB液では解離定数K=5.87×10-4Mであった。したがって、攪拌前の溶液であるA液に溶解している物質も人工皮膚膜透過により得られたB液に溶解している物質の両方ともグリセルアルデヒド由来AGEに対する結合性を有していた。このことにより、ホエイ加水分解物(および人工皮膚膜を透過した物質)が、グリセルアルデヒド由来AGEに対する結合性を有することが確認できた。
 したがって、以下の実施例では、上記のように酵素処理した後に凍結乾燥したホエイ加水分解物(以下、単に「凍結乾燥ホエイ加水分解物」という)を用いた。
 (参考例:終末糖化産物の製造)
 まず、360mgのDL-グルコースおよびキレート剤として39mgのジエチレントリアミン-五酢酸をそれぞれ秤量し、50mLのファルコンチューブに入れた。次いでファルコンチューブに0.2Mリン酸緩衝液(pH7.4)を20mL添加して、ボルテックスミキサーにてDL-グルコースおよびジエチレントリアミン-五酢酸を溶解した。さらにファルコンチューブにヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma社製)を500mg添加し、ボルテックスミキサーにて溶解した。次いで、得られた溶液をクリーンベンチ内でポアサイズ0.22μmのフィルターを通すことによって無菌溶液とした。パラフィルムにて50mLファルコンチューブの蓋を密封し、37℃で1週間インキュベートし、DL-グルコースとHSAとを反応させた。インキュベーション後、溶液をPD-10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にかけて未反応のDL-グルコースを除き、その結果をHPLCで確認し、グルコース由来終末糖化産物(グルコース由来AGE)画分を得た。
 他方、180mgのDL-グリセルアルデヒドおよびキレート剤として39mgのジエチレントリアミン-五酢酸をそれぞれ秤量し、50mLのファルコンチューブに入れた。次いでファルコンチューブに0.2Mリン酸緩衝液(pH7.4)を20mL添加して、ボルテックスミキサーにてDL-グリセルアルデヒドおよびジエチレントリアミン-五酢酸を溶解した。さらにファルコンチューブにヒト血清アルブミン(HSA)(Sigma社製)を500mg添加し、ボルテックスミキサーにて溶解した。次いで、得られた溶液をクリーンベンチ内でポアサイズ0.22μmのフィルターを通すことによって無菌溶液とした。パラフィルムにて50mLファルコンチューブの蓋を密封し、37℃で1週間インキュベートし、DL-グリセルアルデヒドとHSAとを反応させた。インキュベーション後、溶液をPD-10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にかけて未反応のDL-グリセルアルデヒドを除き、その結果をHPLCで確認し、グリセルアルデヒド由来糖化産物(グリセルアルデヒド由来AGE)画分を得た。
 上記のようにして得た画分中のグルコース由来AGEまたはグリセルアルデヒド由来AGEの生成を、モノクローナル抗体を用いたELISA法で確認した。抗グルコース由来AGEモノクローナル抗体または抗グリセルアルデヒド由来AGEモノクローナル抗体は、東洋紡株式会社に委託して、グルコース由来AGEまたはグリセルアルデヒド由来AGEを抗原としてマウスから作製した。これらの抗モノクローナル抗体をビオチン化試薬EZ-Link(登録商標)Sulfo-NHS-Biotinylation Kit(PIERCE、商品コード21420)でビオチン化し、さらにこのビオチン化抗モノクローナル抗体にストレプトアビジン ペルオキシダーゼ標識(ナカライテスク、商品コード02517-61)を結合した。ELISA POD基質A.B.T.Sキット(ナカライテスク、商品コード14351-80)を用いて、HSA抗体(RayBiotech, Inc)を固相化したウェルに、上記にて調製したいずれかの終末糖化産物およびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを結合したビオチン化抗モノクローナル抗体を添加して、化学発光を検出することによりこれらの終末糖化産物、グルコース由来AGEおよびグリセルアルデヒド由来AGEの生成を確認した。
 (実施例1)
 抗菌性試験に用いる菌体を以下のように調製した。独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門(NBRC)から購入した大腸菌(NBRC 3972)をSCDブイヨン(日水製薬株式会社)5mL中に継代培養法にて液体中に保存した。この保存していた大腸菌液50μLをSCDブイヨン(日水製薬株式会社)5mL中に接種し、振盪水浴中で30℃にて16時間培養した。培養後の菌液を滅菌水で希釈し、10倍までの10倍段階希釈液を調製した。
 抗菌性を調べる試験系列を以下のように調製した。96ウェル平底マイクロプレート(BD Falcon)に、8w/v%のアポラクトフェリン(調製例1にて調製)の水溶液(ポアサイズ0.22μmのフィルターで除菌)を滅菌水で倍数希釈し、各50μLの希釈系列を調製した。ウェル中のアポラクトフェリン濃度は、0~2w/v%であった。それぞれにポアサイズ0.22μmのフィルターで除菌した10w/v%の終末糖化産物(参考例にて調製したグルコース由来AGEまたはグリセルアルデヒド由来AGE)を50μL添加してこれらの最終濃度が2.5w/v%となるようするか、または滅菌水50μLを添加し、グルコース由来AGEまたはグリセルアルデヒド由来AGEの添加系列および終末糖化産物添加なしの系列を得た。さらに、グルコース由来AGEまたはグリセルアルデヒド由来AGEの添加系列に、調製例2にて調製した凍結乾燥ホエイ加水分解物(終末糖化産物結合剤)を最終濃度が2.5w/v%となるように添加して、終末糖化産物結合剤添加系列も得た。
 これらの系列に4倍濃度のSCDブイヨン(日水製薬株式会社)50μLおよび上記で調製した10倍希釈の菌液50μLを加えた。コントロールとして、菌を接種しない系も調製した。
 上記マイクロプレート試験系および上記シャーレ試験系を35℃にて24時間培養した。培養後、試験マイクロプレートは、マイクロプレートリーダー(マルチスキャンJX Thermo Labsystems)にて、630nmの波長で濁度(吸光度)を測定し、培養後の菌の増減を調べた。
 終末糖化産物が添加された場合のアポラクトフェリンおよび終末糖化産物結合剤の併用による抗菌性を調べた結果を図に示す(図1:グルコース由来AGEが添加された場合;図2:グリセルアルデヒド由来AGEが添加された場合)。図1は、アポラクトフェリン単独(グルコース由来AGE非添加)、グルコース由来AGE添加時のアポラクトフェリン、およびグルコース由来AGE添加時のアポラクトフェリンおよび終末糖化産物結合剤による大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。図2は、アポラクトフェリン単独(グリセルアルデヒド由来AGE非添加)、グリセルアルデヒド由来AGE添加時のアポラクトフェリン、およびグリセルアルデヒド由来AGE添加時のアポラクトフェリンおよび終末糖化産物結合剤による大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。図1および図2とも、横軸は培養液中のアポラクトフェリン濃度(%)(w/v)を示す。縦軸は吸光度を示し、吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。図中、白丸がアポラクトフェリン溶液に何も添加していない場合の結果、黒丸がアポラクトフェリン溶液に各AGE(図1はグルコース由来AGE、図2はグリセルアルデヒド由来AGE)を添加した場合の結果、そして白四角がアポラクトフェリン溶液に各AGEおよび終末糖化産物結合剤を添加した場合の結果を表す。
 これらの図から明らかなように、アポラクトフェリン溶液にいずれのAGEを添加した場合も抗菌作用が阻害された。しかし、アポラクトフェリン溶液に各AGEおよび終末糖化産物結合剤を添加した場合、アポラクトフェリン単独の抗菌作用には及ばないとしても、AGEによる抗菌作用の阻害が終末糖化産物結合剤により抑制された。なお、グルコース由来AGEの被検体への投与によって、投与濃度依存的に該被検体の血中グリセルアルデヒド由来AGE濃度が増加することが判明している。本実施例の結果からは、グルコース由来AGEおよびグリセルアルデヒド由来AGEのようなAGEsが体内蓄積された場合、アポラクトフェリンの効果が阻害され得るが、終末糖化産物結合剤との併用によりそのような場合であってもアポラクトフェリンの効果が発揮され得ることが示され得る。
 (実施例2)
 菌体の調製は、実施例1と同様に行った。次いで、96ウェル平底マイクロプレート(BD Falcon)に、8w/v%のアポラクトフェリン(調製例1にて調製)の水溶液(ポアサイズ0.22μmのフィルターで除菌)を滅菌水で倍数希釈し、各50μLの希釈系列を調製した。ウェル中のアポラクトフェリン濃度は、0~2w/v%であった。それぞれのアポラクトフェリン濃度の系に、ポアサイズ0.22μmのフィルターで除菌8w/v%の種々の試薬(以下の表1に示す)を滅菌水で倍数希釈したものを50μLずつ添加し、試験系を調製した。用いた組み合わせ試薬は以下の通りである:クエン酸(ナカライテスク株式会社)、凍結乾燥ホエイ加水分解物(調製例2にて調製)、ナイシン(SIGMA)、アスコルビン酸(ナカライテスク株式会社)、ポリ-L-リジン(SERVA Electrophoresis GmbH)、グリシン(和光純薬工業株式会社)、メチルパラベン(和光純薬工業株式会社)、塩化セチルピリジニウム(CPC)(和光純薬工業株式会社)。アポラクトフェリンおよび組み合わせ試薬をそれぞれ0、0.03、0.06、0.13、0.25、0.5、1、2(単位はw/v%)の濃度で組み合わせて試験系とした。次いで、これらの試験系に対して、実施例1と同様に菌体接種および培養し、培養後の菌の増減を調べた。最小発育阻止濃度(MIC)を決定し、fractional inhibitory concentration index (FIC index)を下記の計算式に従い算出した:
 FIC index
=併用時のApo溶液MIC/単独時のApo溶液MIC+併用時の併用試薬MIC/単独時の併用試薬MIC
 得られたFIC indexより、≦0.5を相乗効果、0.5<~<2を相加効果、=2を無関係、>2を拮抗関係として評価を行った。表1に結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 用いたいずれの試薬も、アポラクトフェリンと組み合わせることにより、抗菌性が増強された。
 (実施例3)
 20w/v%のDL-α-トコフェロール(CALBIOCHEM)のジメチルスルホキシド溶液を調製した。この5μLを2w/v%のアポラクトフェリン(調製例1にて調製)の水溶液500μLに添加し、次いで超純水にてα-トコフェロール濃度が0.1w/v%となるよう調製した。同様にして、α-トコフェロール濃度が0.05、0.025、および0.01(単位はw/v%)となるよう調製し、試験試料を得た。
 他方、2w/v%のアポラクトフェリン(調製例1にて調製)の水溶液と倍数希釈したL-アスコルビン酸(ナカライテスク;特級)を1:1で混合し、最終的に、アスコルビン酸濃度が、0.1、0.05、0.025、および0.01(単位はw/v%)となるように調製し、試験試料を得た。
 製造者のプロトコルに従って試験試料をFRAS4(活性酸素・フリーラジカル自動分析装置;株式会社ウイスマー)に供し、抗酸化力を測定した。
 図3は、アポラクトフェリンと種々の濃度のα-トコフェロールとの組み合わせの抗酸化力を示す。横軸は培養液中のα-トコフェロール濃度(%)(w/v)を示す。縦軸は抗酸化力(μmol/L)を示す。図中、白丸がα-トコフェロール単独の場合の結果、そして黒丸がアポラクトフェリン溶液にα-トコフェロールを添加した場合の結果を表す。抗酸化効果において、相加効果を有することが明らかとなった。
 図4は、アポラクトフェリンと種々の濃度のアスコルビン酸との組み合わせの抗酸化力を示す。横軸は培養液中のアスコルビン酸濃度(%)(w/v)を示す。縦軸は抗酸化力(μmol/L)を示す。図中、白丸がアスコルビン酸単独の場合の結果、そして黒丸がアポラクトフェリン溶液にアスコルビン酸を添加した場合の結果を表す。抗酸化効果において、相加効果を有することが明らかとなった。
 本発明によれば、食品、化粧品、口内清浄剤、皮膚外用剤、眼科用製品、表面被覆剤(例えば、食品包装容器または缶用)、ポリマー添加剤、消臭剤(例えば、消臭ミスト)、洗剤、香水などに好適に利用可能な組成物が得られる。

Claims (2)

  1.  アポラクトフェリンと、終末糖化産物結合剤、抗酸化物質および抗菌物質からなる群から選択される少なくとも1種とからなる組成物。
  2.  前記終末糖化産物結合剤が、ホエイをエンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、およびエンドペプチダーゼで加水分解することにより得られる乳成分加水分解物である、請求項1に記載の組成物。
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