JP2941093B2 - ラクトフェリン分解物を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤及びラクトフェリン分解物を用いる物品の処理方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ラクトフェリンの分解
物を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤、ラクトフ
ェリンの分解物を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害
性組成物及びラクトフェリンの分解物を用いる物品の処
理方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ラクトフェリンは、生体内では、涙、唾
液、末梢血、乳汁等に含まれている鉄結合性蛋白質であ
り、大腸菌、ブドウ球菌及び腸球菌に対して、０．５〜
３０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗菌作用を有することが知られ
ている〔ノネッケ及びスミス；ジャーナル・オブ・デイ
リー・サイエンス(Nonnecke, B.J. & Smith, K.L.:Jour
nal of Dairy Science) 、第６７巻、第６０６ページ、
１９８４年〕。

【０００３】一般にラクトフェリンの抗菌作用は、菌の
増殖に必要な鉄とラクトフェリンとが結合して、菌が鉄
を利用できなくなることによるものと考えられている。
しかし、ラクトフェリンの抗菌作用は、必ずしも充分に
強いとは言えない。従って、ラクトフェリンを使用する
場合、殊にラクトフェリンを他の物品に配合、含浸、付
着させ、又は物品をラクトフェリンで被覆して、抗菌作
用を発揮せしめる場合には、大量のラクトフェリンが必
要となるため、従来の技術ではラクトフェリンの利用に
は限界があった。

【０００４】この点を改良するため、従来からラクトフ
ェリンの抗菌性を増強する研究が種々行われており、ラ
クトフェリンの生理活性増強補助剤としてはリゾチー
ム、ＩｇＡ及びグリコペプチドが知られている。例え
ば、ラクトフェリンとリゾチームとの共存により相乗的
に抗菌作用を増強する方法（特開昭６２−２４９９３１
号公報）、ラクトフェリンと分泌型ＩｇＡとの共存によ
り相乗的に抗菌作用を増強する方法〔ステフェンスら；
イムノロジー(Stephens, S., et al;Immunology)、第４
１巻、第５９７ページ、１９８０年〕等が報告されてい
る。更に、スピックら〔エー・エフ・ウイリアムス及び
ジェー・ディー・バウム(A.F. Williams & J.D. Baum)
編、「ヒューマン・ミルクバンキング」(Human Milk Ba
nking)、ネスレ・ニュートリッション・ワークショップ
・シリーズ、第５巻(Nestle Nutrition Workshop Serie
s Volume 5) 、第１３３ページ、レーベン・プレス・ブ
ックス社(Reven Press Books Ltd.)、１９８４年〕は、
ラクトフェリンには細菌が粘膜表面に付着するのを防止
する作用があり、この作用はリゾチーム又はグリコペプ
チドの存在で強化されることを報告している。

【０００５】また、ラクトフェリンの加水分解物に抗菌
作用が存在することも知られている〔日本栄養・食糧学
会誌、第４２巻、第１号、第１３〜１９ページ、１９８
９年、メディカル・ミクロバイオロジー・アンド・イム
ノロジー(Medical Microbiology and Immunology) 、第
１７８巻、第６９〜７９ページ、１９８９年及びインフ
ェクション・アンド・イムニティー(Infection and Imm
unity)、第３５巻、第３号、第１１１０〜１１１８ペー
ジ、１９８２年〕。

【０００６】更に、ラクトフェリンは熱に不安定であ
り、６２．５℃で３０分間の加熱によりほぼ失活し、７
０℃で１５分間の加熱により完全に失活することが知ら
れている〔フォードら(Ford, J.E., et al) 、ジャーナ
ル・オブ・ペディアトリックス(Journal of Pediatric
s) 、第９０巻、第２９ページ、１９７７年〕。従っ
て、従来ラクトフェリン含有液を処理する場合であっ
て、その工程中に加熱処理を包含する場合には、ラクト
フェリンが失活する虞れがあり、充分な加熱処理を採用
できないのが実情であった。

【０００７】一方、ラクトフェリン、及びその加水分解
物のチロシナーゼ活性阻害効果については、知られてい
ない。

【０００８】チロシナーゼは、チロシン、その他１価の
フェノール類及び相当するオルソー２価フェノール類の
分子状酸素による酸化を触媒する酵素であり、キノコ、
ジャガイモ、リンゴ等多くの植物に広く存在し、また動
物組織にも広く存在する。植物においては、組織の損傷
部分の黒変現象に関与し、動物においては組織、特に皮
膚表皮細胞のメラニン色素の形成に関与していることが
知られている（化学大辞典編集委員会編、「化学大辞典
５」、第９７６ページ、共立出版、昭和３５年）。ア
ジソン病において皮膚又は粘膜でのメラニン沈着が、チ
ロシナーゼ活性を促進するメラノトロピンと拮抗する副
腎皮質ホルモンの分泌減少に起因することも知られてい
る（化学大辞典編集委員会編、「化学大辞典 １」、第
６５ページ、共立出版、昭和３５年）。更に、チロシナ
ーゼは、食品の鮮度低下にも関与しているともいわれて
いる。

【０００９】以上のように、食品、化粧品又は医薬品分
野においてチロシナーゼの望ましくない作用を防止する
ためのチロシナーゼ活性阻害剤の開発が強く望まれてい
た。特に、化粧品業界では、メラニン色素の生成を有効
に抑制し、美白効果を付与した化粧品又は皮膚外用剤の
研究が活発であり、チロシナーゼ活性阻害剤を配合した
製品が次々と開発されている。チロシナーゼ活性阻害剤
としては、例えば、システイン、ビタミンＣ（三島豊ら
著、「基礎皮膚科学」、第２５８ページ、朝倉書店、昭
和４８年）、コウジ酸（日経産業新聞、昭和６２年５月
２４日）、アルブチン（富田健一、第２１回ＦＪセミナ
ー予稿集、第２１ページ、フレグランス・ジャーナル
社、平成２年３月１４日）、トリコデルマ属に属する微
生物の産生物（特開平２−１４５１８９号公報）等が知
られている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ラクト
フェリンのチロシナーゼ活性阻害作用の維持及び耐熱性
の改良について鋭意研究を重ねた結果、哺乳類由来のラ
クトフェリン、それらを化学的に処理した哺乳類由来の
アポラクトフェリン、哺乳類由来の金属飽和ラクトフェ
リン、又はこれらの任意の混合物よりなる群より選択さ
れたラクトフェリンを加水分解して得られるラクトフェ
リン分解物が、天然のラクトフェリンよりも加熱及びｐ
Ｈの変化に対して安定であり、かつチロシナーゼ活性阻
害作用を有することを発見し、本発明を完成した。

【００１１】また、従来のチロシナーゼ活性阻害剤は、
製品中で不安定である場合、メラニン色素を合成するメ
ラノサイト細胞への作用が強すぎる場合、原料の入手が
困難で高価な場合等、いずれも欠点があり、安全で美白
効果にすぐれた化粧品又は皮膚外用剤として満足できる
ものではなかった。

【００１２】本発明者らは、ラクトフェリン、特にその
加水分解物が強いチロシナーゼ活性阻害効果を有するこ
とを発見し、本発明を完成した。

【００１３】本発明の目的は、ラクトフェリン分解物を
有効成分として含有するチロシナーゼ活性阻害剤を提供
することである。

【００１４】また、本発明の他の目的は、ラクトフェリ
ン分解物を有効成分として含有するチロシナーゼ活性阻
害組成物を提供することである。

【００１５】更に、本発明の他の目的は、ラクトフェリ
ン分解物を用いて物品を処理する方法を提供することで
ある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明の第１の発明は、哺乳類のラクトフェリン、哺乳類の
アポラクトフェリン、哺乳類の金属飽和ラクトフェリ
ン、及びこれらの任意の混合物からなる群より選択され
たラクトフェリンを加水分解して得られるラクトフェリ
ン分解物を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤であ
り、ラクトフェリン分解物が、少なくとも０．０５％
（重量。以下、分解率及びチロシナーゼ活性阻害率を除
き、特に断りのない限り、同じ）の濃度で含有されてい
ること、及びラクトフェリン分解物が、少なくとも６％
の加水分解率であることを望ましい態様としてもいる。
前記課題を解決する本発明の第２の発明は、哺乳類のラ
クトフェリン、哺乳類のアポラクトフェリン、哺乳類の
金属飽和ラクトフェリン、及びこれらの任意の混合物か
らなる群より選択されたラクトフェリンを加水分解して
得られるラクトフェリン分解物を有効成分とするチロシ
ナーゼ活性阻害性組成物であり、ラクトフェリン分解物
が、少なくとも０．０５％の濃度で含有されているこ
と、及びラクトフェリン分解物が、少なくとも６％の加
水分解率であることを望ましい態様としてもいる。前記
課題を解決する本発明の第３の発明は、哺乳類のラクト
フェリン、哺乳類のアポラクトフェリン、哺乳類の金属
飽和ラクトフェリン、及びこれらの任意の混合物からな
る群より選択されたラクトフェリンを加水分解して得ら
れるラクトフェリン分解物を用いてチロシナーゼ含有物
品を処理する方法である。次に本発明について詳述す
る。本発明において、出発物質として使用するラクトフ
ェリンは、市販のラクトフェリン、哺乳類（例えば、ヒ
ト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等）の初乳、移行乳、常
乳、末期乳等、又はこれらの乳の処理物である脱脂乳、
ホエー等（以下これらをまとめて乳等と記載する）から
常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー等）によ
り分離したラクトフェリン、それらを塩酸、クエン酸等
により脱鉄したアポラクトフェリン、アポラクトフェリ
ンを鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせた
金属飽和ラクトフェリン、又はこれらの混合物である
（以下、これらをまとめてＬＦと記載する。）

【００１７】本発明によるラクトフェリン加水分解物
（以下、ＬＦ加水分解物と記載することがある）は、上
記ＬＦを酸又は酵素で加水分解することによって得られ
る。

【００１８】酸による加水分解は、ＬＦを０．１〜２０
％、望ましくは５〜１５％の濃度で水又は精製水等に溶
解し、得られた溶液に塩酸、リン酸等の無機酸、又はク
エン酸等の有機酸を添加し、溶液のｐＨを１〜４、望ま
しくは２〜３に調整する。得られた溶液は、調整された
ｐＨに応じて、適当な温度で所定時間加熱して加水分解
する。例えば、ｐＨが１〜２に調整された場合には８０
〜１３０℃、望ましくは９０〜１２０℃で、ｐＨ２〜４
に調整された場合には１００〜１３０℃、望ましくは１
００〜１２０℃で、夫々１〜１２０分間、望ましくは５
〜６０分間加熱する。

【００１９】酵素により加水分解する場合には、ＬＦを
０．５〜２０％、望ましくは５〜１５％の濃度で水、精
製水等に溶解し、得られた溶液を使用される酵素の至適
ｐＨに調整して加水分解する。

【００２０】使用される酵素は特に制限はなく、市販の
酵素、例えば、モルシンＦ（商標、盛進製薬社製。至適
ｐＨ２．５〜３．０）、豚ペプシン（和光純薬社製。至
適ｐＨ２〜３）、スミチームＡＰ（商標、新日本化学社
製。至適ｐＨ３．０）、アマノＭ（商標、アマノ製薬社
製。至適ｐＨ３．０）、アマノＡ（商標、アマノ製薬社
製。至適ｐＨ７．０）、トリプシン（ノボ社製。至適ｐ
Ｈ８．０）等を単用又は任意に併用する。上記の酵素の
ほかに、例えば、市販のエキソペプチダーゼを含有する
醤油酵素（田辺製薬社製）を組み合わせて使用しても良
い。

【００２１】使用する酵素の量は、基質に対して０．１
〜５．０％の範囲、特に、０．５〜３．０％が望まし
い。

【００２２】ＬＦ溶液のｐＨを調整し、所望の酵素を所
望の量添加した後、得られた溶液の温度を１５〜５５
℃、望ましくは３０〜５０℃で、３０〜６００分間、望
ましくは６０〜３００分間保持してＬＦを加水分解す
る。

【００２３】次いで溶液をそのまま又は中和した後、酵
素を常法により加熱失活する。

【００２４】上記方法によって得られた反応液は、常法
により冷却し、必要に応じて中和、脱塩、脱色し、得ら
れた溶液をそのまま、若しくは濃縮して液状製品とし、
又は濃縮後乾燥して粉末製品とすることができる。

【００２５】上記の加水分解の条件は、厳密なものでは
なく、製造コスト、例えば、温度、時間、酸又は酵素の
種類及び量、反応装置（加圧の有無）等を考慮して適宜
条件を設定できる。

【００２６】以上の方法によって得られたＬＦ加水分解
物は、種々の分子量を有する分解物の混合物である。

【００２７】加水分解の分解率は、後記する試験例から
明らかなとおり４〜５０％、望ましくは６〜４０％、で
ある。

【００２８】以上の方法により得られたＬＦ加水分解物
は、熱及びｐＨの変化に対して極めて安定であり、チロ
シナーゼ活性阻害効果を有している。

【００２９】従って、本発明の第１発明であるチロシナ
ーゼ活性阻害剤は、ヒト及び動物に投与することを目的
とする医薬であり、ＬＦ加水分解物を、そのまま使用す
ることも可能であり、賦形剤、他の薬剤及び／又は活性
補助剤と混合して用いることも可能である。また、本発
明の第２の発明であるチロシナーゼ活性阻害性組成物
は、物品を処理するために使用される薬品であり、前記
第１の発明より粗製のものでも使用が可能である。

【００３０】また、本発明によるＬＦ加水分解物は、そ
のまま、又は賦形剤若しくは他の薬剤と混合してチロシ
ナーゼ活性阻害剤として用いることができる。

【００３１】本発明のチロシナーゼ活性阻害剤は、医薬
品としてのみならず、食品、飼料、化粧品、医薬部外品
又はそれらの素材（例えば、乳化剤、香料、その他一般
に食品、飼料、化粧品、医薬、医薬部外品の素材として
許容されている成分）等のようにヒト及び動物の体表面
に適用される製品、その他一般にチロシナーゼ活性を阻
害することが望まれるあらゆる製品等に配合することに
よりチロシナーゼ活性阻害性組成物として用いることが
可能であり、更に該阻害剤又は阻害性組成物でそれら製
品を処理することにより、チロシナーゼ活性阻害処理を
施された製品として用いることができる。

【００３２】本発明のＬＦ加水分解物を有効成分とする
チロシナーゼ活性阻害剤及びチロシナーゼ活性阻害性組
成物は、化粧品又は外用剤として、ヒト又は動物の体表
面に適用された場合には、メラニン色素沈着の防止に有
効である。

【００３３】本発明の第３の発明は、ＬＦ加水分解物を
用いてチロシナーゼ含有物品を処理する方法であり、Ｌ
Ｆ加水分解物が、チロシナーゼ活性阻害性を有するの
で、食品、飼料等のようにヒト又は動物が摂取する物品
を処理する（例えば、それらの物品に混合、含浸、付
着、被覆させる）ことによって、それらの物品の品質の
劣化防止（例えば、変敗の防止又は抑制、変色の防止、
鮮度維持等）に有効であり、更に、ヒト又は動物の体表
面に接する物品を処理する（例えば、それらの物品に混
合、含浸、付着、被覆させる）ことによって、かかる物
品をヒト又は動物の体表面に適用した場合には、メラニ
ン色素沈着の防止に有効である。

【００３４】次に、実施例を示して本発明を詳述する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【００３５】

【実施例】〔実施例１〕 乳等から分離したままの市販のＬＦ（ベルギーのオレオ
フィナ社製）５０ｇを精製水９５０ｇに溶解し、得られ
た溶液に１Ｍの塩酸を添加してｐＨを２に調整し、１２
０℃で１５分間加熱し、冷却して、ＬＦ加水分解物を５
％の濃度で含有する液状のチロシナーゼ活性阻害作用を
有する分解物約１０００ｇを得た。

【００３６】得られたＬＦ加水分解物の分解率を試験例
１と同一の方法により測定した結果、９％であった。

【００３７】〔実施例２〕 乳等から分離したままの市販のＬＦ（ベルギーのオレオ
フィナ社製）１５０ｇを精製水８５０ｇに溶解し、得ら
れた溶液に１Ｍのクエン酸を添加してｐＨを３に調整
し、１３０℃で６０分間加熱した。加熱後、溶液を冷却
し、１Ｍの水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７に調整
した後、濾過し、脱塩し、凍結乾燥して、粉末状のチロ
シナーゼ活性阻害作用を有するＬＦ加水分解物約４５ｇ
を得た。

【００３８】得られたＬＦ加水分解物の分解率を試験例
１と同一の方法により測定した結果、１２％であった。

【００３９】〔実施例３〕 乳等から分離したままの市販のＬＦ（ベルギーのオレオ
フィナ社製）２０ｇを精製水１８０ｇに溶解し、これに
硫酸第一鉄七水和物２００ｍｇを添加し、２５℃で１２
時間反応させたのち、限外濾過モジュールＳＥＰ−１０
１３（商標、旭化成社製）で未反応の鉄を除去し、凍結
乾燥し、鉄飽和ＬＦ約１９ｇを得た。得られた鉄飽和Ｌ
Ｆ１５ｇを精製水２８５ｇに溶解し、２Ｍの塩酸でｐＨ
を１．０に調整し、９０℃で１５分間加熱し、のち冷却
して、５％の濃度の液状のチロシナーゼ活性阻害作用を
有するＬＦ加水分解物約３００ｇを得た。

【００４０】得られたＬＦ加水分解物の分解率を試験例
１と同一の方法により測定した結果、７％であった。

【００４１】〔実施例４〕 カルボキシメチル基のイオン交換基を有するセパビーズ
ＦＰ−ＣＭ１３（商標、三菱化成社製）５００ｍｌを、
内径１０ｃｍのカラムに充填し、１０％食塩水２ｌを通
液し、のち水洗し、Ｎａ型のイオン交換体を調整した。
次いで、山羊から得たチーズホエー（ｐＨ６．５）６０
ｌを４℃の温度及び４ｌ／時の流速で上記カラムに通液
した。のちカラムを水洗し、該チーズホエーの非吸着成
分を除去し、１０％の食塩水５ｌを５ｌ／時の流速で通
液し、イオン交換体に吸着した該チーズホエーの成分を
脱離し、溶出液５ｌを得た。この溶出液を限外濾過モジ
ュールＳＥＰ−１０１３（商標、旭化成社製）を用いて
濃縮し、水を添加してダイアフィルトレーションを行っ
て食塩を除去し、１％の山羊ＬＦを含有する液約２００
ｍｌを得た。この液に１Ｍの塩酸を添加してｐＨを２．
０に調整し、１２０℃の温度で２０分間加熱し、のち冷
却して１％の液状のチロシナーゼ活性阻害作用を有する
ＬＦ加水分解物約２００ｇを得た。得られたＬＦ加水分
解物の分解率を試験例１と同一の方法により測定した結
果、１０％であった。

【００４２】〔実施例５〕 乳等から分離したままの市販のＬＦ（ベルギーのオレオ
フィナ社製）１ｋｇを精製水９ｋｇに溶解し、硫酸第一
鉄七水和物１０ｇを添加し、２５℃で１２時間反応さ
せ、のち限外濾過モジュールＳＥＰ−１０１３（商標、
旭化成社製）で未反応の鉄を除去し、０．５規定の塩酸
を添加してｐＨを３．５に調整し、市販のモルシンＦ
（商標、盛進製薬社製）１０ｇ（４２，０００単位／１
ｇ蛋白質）を添加して均一に混合し、３７℃に１８０分
間保持し、中和し、８５℃で１０分間加熱して酵素を失
活させ、のち冷却し、液状のチロシナーゼ活性阻害作用
を有するＬＦ加水分解物約１０ｋｇを得た。

【００４３】得られたＬＦ加水分解物の分解率を試験例
１と同一の方法により測定した結果、１３．５％であっ
た。

【００４４】〔実施例６〕 乳等から分離したままの市販のＬＦ（ベルギーのオレオ
フィナ社製）１ｋｇを精製水９ｋｇに溶解し、２Ｍのク
エン酸を添加してｐＨを２．５に調整し、市販の豚ペプ
シン（１：１０，０００。和光純薬工業社製）３０ｇを
添加して均一に混合し、３７℃に１８０分間保持し、８
５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、のち冷却し、
液状のチロシナーゼ活性阻害作用を有するＬＦ加水分解
物約１０ｋｇを得た。

【００４５】得られたＬＦ加水分解物の分解率を試験例
１と同一の方法により測定した結果、１１．３％であっ
た。

【００４６】〔実施例７〕 脱脂山羊乳５０ｌに、０．００３Ｍの塩化第２鉄を含む
０．１Ｍのクエン酸ナトリウム溶液５ｌを添加し、均一
に混合した。次いで、ＣＭ−セファデックスＣ−５０
（Ｈ⁺ 型。ファルマシア社製）約５ｌを加えて約１時間
攪拌した。攪拌後、樹脂を十分に洗浄して未吸着の山羊
乳成分を除去したのち、０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）に懸濁し、カラム（２０×５０ｃｍ）に
充填し、同一の緩衝液で樹脂を充分に洗浄した。次に
０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液中、０〜２Ｍ塩化ナトリ
ウムを含むグラジェントで溶出させて、ＬＦ画分約８０
０ｍｌを得た。このＬＦ画分を限外濾過膜ＰＭ−１０
（商標、アミコン社製）を用いて約１５０ｍｌに濃縮
し、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス−
酢酸緩衝液（ｐＨ８．２）で透析した。この透析液を同
一の緩衝液で平衡化した銅キレーティング・セファロー
ス６Ｂ（商標、ファルマシア社製）カラム（１０×３０
ｃｍ）に通液し、ＬＦを吸着させた。このカラムを同じ
緩衝液で洗浄し、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ
４．０の酢酸緩衝液を通液してＬＦを溶出し、のち純水
にたいして透析し、凍結乾燥して約２ｇの粉末状ＬＦを
得た。

【００４７】この粉末状ＬＦ２ｇを精製水１７ｇに溶解
し、１Ｍ乳酸を添加してｐＨを３．５に調整し、市販の
スミチームＡＰ（商標、新日本化学工業社製）６０ｍｇ
（５０，０００単位／１ｇ蛋白質）を添加して均一に混
合し、５０℃で１８０分間分解し、中和し、８５℃で１
０分間加熱して、酵素を失活させ、冷却し、凍結乾燥し
て粉末状のチロシナーゼ活性阻害作用を有するＬＦ加水
分解物約２ｇを得た。

【００４８】得られたＬＦ加水分解物の分解率を試験例
１と同一の方法により測定した結果、１３．８％であっ
た。

【００４９】次に試験例を示して本発明のＬＦ加水分解
物を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤の有用性を
例証する。

【００５０】〔試験例１〕 この試験は、ＬＦの酸による加水分解物のチロシナーゼ
活性阻害効果を調べるために行われた。

【００５１】（１）試料の調製 市販のＬＦ（オレオフィナ社製）を５％の濃度で精製水
に溶解し、１Ｍ塩酸を添加してｐＨを１，２，３及び４
に調整した４種類の溶液を調製した。各溶液をそれぞれ
６０℃から１３０℃までの温度で５分から６０分間加熱
して加水分解を行い、次いで１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
でｐＨを７に調整し、凍結乾燥して、分解率が４〜３０
％の各種ＬＦ加水分解物試料を調製した。

【００５２】（２）試験方法 １）分解率の測定 ＬＦ加水分解物の分解率（％）は、ホルモール滴定法に
より各試料中のホルモール態窒素量を測定し、各試料中
の含窒素量に対する百分率を次式から算出した。

【００５３】 分解率（％）＝１００×（Ａ／Ｂ） ここでＡはホルモール態窒素量、Ｂは全窒素量を示す。

【００５４】 ２）チロシナーゼ活性阻害効果の測定 公知の方法（特公昭５８−１７７６３号公報の実験例
３）を参考にして、以下のとおりに測定した。 ａ）各種溶液の調製 基質溶液の調製 試薬特級のＬ−チロシン（和光純薬工業社製）を０．１
Ｍリン酸緩衝液に０．０４５％（Ｗ／Ｖ）の濃度で溶解
した。

【００５５】 酵素溶液の調製 マッシュルーム由来のチロシナーゼ（シグマ社製。３，
０００単位／ｍｇ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０に０．１％（Ｗ／Ｖ））の濃度で溶解した。

【００５６】 銅イオン溶液の調製 試薬特級の硫酸銅（和光純薬工業社製）を精製水に１％
（Ｗ／Ｖ）の濃度で溶解した。

【００５７】 試料溶液の調製 前記（１）において調製した各試料を表１に示す各濃度
の２倍の濃度で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
溶解した。

【００５８】 ｂ）酵素反応 予め３７℃に加温した基質溶液０．９ｍｌ，試料液１．
０ｍｌ，銅イオン溶液０．０２ｍｌを試験管に採取し、
同温度に加温した酵素溶液０．０８ｍｌを添加し（全量
２．０ｍｌ）、３７℃で３分間反応させた。次いで３０
％酢酸溶液２ｍｌを添加して反応を停止させ、分光光度
計で波長６４０ｎｍでの吸光度を測定した（この吸光値
をＢとする）。対照として試料溶液の代わりに０．１Ｍ
リン酸緩衝液１．０ｍｌを添加したことを除いて上記と
同様に酵素反応させ、上記と同様に吸光度を測定した
（この吸光値をＡとする）。尚、試料溶液が白濁してい
る場合は、酵素溶液の代わりに０．１Ｍリン酸緩衝液
０．０８ｍｌを添加して同様に吸光度を測定し（この吸
光値をＣとする）、反応液の濁り部分に由来する吸光度
を除去した。測定された各吸光値からチロシナーゼ活性
阻害率（％）を次式により算出した。

【００５９】 阻害率（％）＝１００〔１−（Ｂ−Ｃ）／Ａ〕 （３）試験結果 この試験の結果は表１に示すとおりであった。分解率が
４％の試料１は０．３％の添加で約１０％のチロシナー
ゼ活性阻害効果を示した。阻害効果は添加量が増大する
に連れて向上し、１％の添加で約３０％、２％の添加で
約５０％の阻害率を示した。

【００６０】

【表１】 一方、分解率が６〜３０％の試料２〜８は、何れも０．
０５％の添加で既に約３０％のチロシナーゼ活性阻害効
果を示した。阻害効果は添加量が増大するに連れて向上
し、０．１％の添加で約６０％、０．３％の添加で約８
０％、０．５％の添加で１００％の阻害率を示した。

【００６１】尚、アポラクトフェリン、亜鉛、銅、鉄等
の金属をキレートさせた金属ラクトフェリンの酸による
加水分解物でも同様のチロシナーゼ活性阻害効果が得ら
れた。

【００６２】〔試験例２〕 この試験は、ＬＦの酵素による加水分解物のチロシナー
ゼ活性阻害効果を調べるために行われた。

【００６３】（１）試料の調製 市販のＬＦ（オレフィナ社製）を５％の濃度で精製水に
溶解し、１Ｍ塩酸又は１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを酵
素の至適ｐＨ付近に調整し、前記市販の豚ペプシン、ア
マノＡ、又はペプチダーゼを含有する市販の醤油酵素
（田辺製薬社製）を組み合わせ、ＬＦ溶液に対して０．
１〜６％添加し、３７℃に保持した。１０分〜２４時間
の異なった時間にわたり反応させた後、ｐＨを７に調整
し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、凍結乾
燥し、分解率が６〜５０％のＬＦ加水分解物を調製し
た。

【００６４】（２）試験方法 分解率及びチロシナーゼ活性阻害効果の測定は、試験例
１と同一の方法で行った。

【００６５】（３）試験結果 酵素によるＬＦ加水分解物のチロシナーゼ活性阻害効果
を表２に示した。

【００６６】

【表２】 分解率が６〜４０％の試料９〜１４は、いずれも０．０
５％の添加量で既に約３０％のチロシナーゼ活性阻害効
果を示した。阻害効果は添加量が増大するに連れて向上
し、０．１％の添加で約６０％、０．３％の添加で約８
０％、０．５％の添加で１００％の阻害率を示した。

【００６７】一方、分解率が４５〜５０％の試料１５、
１６は０．３％の添加で約１０％のチロシナーゼ活性阻
害効果を示した。阻害効果は添加量が増大するに連れて
向上し、１％の添加で約３０％、２％の添加で約５０％
の阻害率を示した。

【００６８】尚、アポラクトフェリン、及び亜鉛、銅、
鉄等の金属をキレートさせた金属ラクトフェリンの酵素
による加水分解物でも同様のチロシナーゼ活性阻害効果
が得られた。

【００６９】次に、本発明によるチロシナーゼ活性阻害
性組成物の実施例を示す。

【００７０】〔実施例８〕 市販のＬＦ（オレオフィナ社製）８０ｇを精製水１００
０ｍｌに溶解した後、１Ｍの塩酸を添加してｐＨを２に
調整した。次いで該溶液を１１５℃の温度で１０分間加
熱した後、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７に調
整し、凍結乾燥し、試験例１と同一の方法で測定した分
解率が１５％のＬＦ加水分解物７７ｇを得た。このＬＦ
加水分解物５０ｇ、グリシン（和光純薬工業社製）９０
０ｇ及びリゾチーム（和光純薬工業社製）５０ｇを均一
に混合し、食品の鮮度保持用のチロシナーゼ活性阻害性
組成物約１０００ｇを得た。

【００７１】得られた食品の鮮度保持用のチロシナーゼ
活性阻害性組成物を２０％の濃度で水に溶解し、チロシ
ナーゼ活性阻害率を試験例１と同一の方法で測定した結
果、１００％であった。

【００７２】〔実施例９〕 市販のＬＦ（オレオフィナ社製）２７０ｇを精製水６３
００ｍｌに溶解した後、１０％クエン酸水溶液を添加し
て、そのｐＨを２．５に調整し、室温において１時間反
応させた。この反応生成物を限外濾過し、その保持液を
凍結乾燥してアポラクトフェリン約２６０ｇを得た。こ
のアポラクトフェリン６０ｇを精製水１０００ｍｌに溶
解した後、２Ｍのリン酸溶液を添加してｐＨを３に調整
した。次いで該溶液を１２１℃の温度で２５分間加熱
し、１Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整し、凍結
乾燥し、試験例１と同一の方法により測定した分解率が
２３％のＬＦ加水分解物約５５ｇを得た。このＬＦ加水
分解物２０ｇ、プロピレングリコール（和光純薬工業社
製）４００ｇ、オレイルアルコール（和光純薬工業社
製）４ｇ、エタノール（和光純薬工業社製）２００ｇ及
び精製水３３７６ｇを均一に混合し、化粧品用チロシナ
ーゼ活性阻害性組成物約４０００ｇを得た。

【００７３】得られた化粧品用チロシナーゼ活性阻害性
組成物のチロシナーゼ活性阻害率を試験例１と同一の方
法で測定した結果、見掛けの阻害率は７５％であった
が、濃度換算を行った実際の阻害率は１００％であっ
た。

【００７４】〔実施例１０〕 市販のＬＦ（オレオフィナ社製）１００ｇを１０００ｍ
ｌの精製水に溶解し、１Ｍの塩酸を添加してｐＨを２に
調整した後３７℃に保持し、市販の豚ペプシン（和光純
薬工業社製）を５ｇ添加し６０分間反応させた。次い
で、８０℃で１０分間熱して酵素を失活させ、凍結乾燥
し、試験例１と同一の方法により測定した分解率が１２
％のＬＦ加水分解物約９５ｇを得た。このＬＦ加水分解
物を３０ｇ、プロピレングリコール（和光純薬工業社
製）２００ｇ、オレイルアルコール（和光純薬工業社
製）２ｇ、エタノール（和光純薬工業社製）１００ｇ及
び精製水１６６８ｇを均一に混合し、化粧品用チロシナ
ーゼ活性阻害性組成物約２０００ｇを得た。

【００７５】得られた化粧品用チロシナーゼ活性阻害性
組成物のチロシナーゼ活性阻害率を試験例１と同一の方
法で測定した結果、１００％であった。

【００７６】〔実施例１１〕 市販のＬＦ（オレオフィナ社製）１５０ｇを精製水１０
００ｍｌに溶解し、１Ｍの水酸化ナトリウムを添加して
ｐＨを６に調整した後、６０℃で１０分間加熱殺菌し
た。この溶液を５０℃に冷却保持し、市販のトリプシン
（ノボ社製）を１５ｇ及びペプチダーゼを含有する市販
の醤油酵素（田辺製薬社製）３０ｇを添加し、５時間反
応させた。次いで、８０℃で１０分間加熱して酵素を失
活させ、凍結乾燥し、試験例１と同一の方法で測定した
分解率が３８％のＬＦ加水分解物約１４５ｇを得た。こ
のＬＦ加水分解物２７ｇ、ヒアルロン酸ナトリウム（和
光純薬工業社製）１ｇ、グリセリン（和光純薬工業社
製）１０ｇ及び精製水９６２ｇを均一に混合し、化粧品
用チロシナーゼ活性阻害性組成物約１０００ｇを得た。

【００７７】得られた化粧品用チロシナーゼ活性阻害性
組成物のチロシナーゼ活性阻害率を試験例１と同一の方
法で測定した結果、１００％であった。

【００７８】〔実施例１２〕 市販のＬＦ（オレオフィナ社製）９０ｇを精製水２１０
０ｍｌに溶解し、これを２．６ｍＭ硫酸鉄水溶液７５５
ｍｌと室温において２４時間反応させた。この反応生成
物を限外濾過し、その保持液を凍結乾燥してラクトフェ
リン鉄約７８ｇを得た。このラクトフェリン鉄４０ｇ
を、精製水５００ｍｌに溶解し、１Ｍの塩酸を添加して
ｐＨを３に調整した後３０℃に保持し、市販のスミチー
ムＡＰ（新日本化学社製）を５ｇ添加し、３時間反応さ
せた。次いで、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活さ
せ、凍結乾燥し、試験例１と同一の方法により測定した
分解率が１８％のＬＦ加水分解物約３５ｇを得た。この
ＬＦ加水分解物を３０ｇ、グリシン（和光純薬工業社
製）４５０ｇ及びリゾチーム（和光純薬工業社製）２０
ｇを均一に混合し、食品の鮮度保持用のチロシナーゼ活
性阻害性組成物約５００ｇを得た。

【００７９】得られた食品の鮮度保持用のチロシナーゼ
活性阻害性組成物を２０％の濃度で水に溶解し、チロシ
ナーゼ活性阻害率を試験例１と同一の方法で測定した結
果、１００％であった。

【００８０】

【発明の効果】本発明によって奏せられる効果は、次の
とおりである。

【００８１】１）本発明のＬＦ加水分解物を有効成分と
するチロシナーゼ活性阻害剤、チロシナーゼ活性阻害性
組成物は、乳等に由来する天然物質の加水分解物である
から、化学的に合成した物質に比して安全である。

【００８２】２）本発明のＬＦ加水分解物を有効成分と
するチロシナーゼ活性阻害剤、チロシナーゼ活性阻害性
組成物は、液状又は粉末状のいずれの形態でも使用でき
るので、用途が広範である。

【００８３】３）本発明のＬＦ加水分解物を有効成分と
するチロシナーゼ活性阻害剤、チロシナーゼ活性阻害性
組成物は、各種製品に添加しても安定であり、加熱に対
しても安定であり、用途が広範である。

【００８４】４）本発明のＬＦ加水分解物を有効成分と
するチロシナーゼ活性阻害剤、チロシナーゼ活性阻害組
成物を、食品、飼料等に適用（例えば、食品、飼料等の
洗浄、食品、飼料等に添加、配合、含浸等）することに
より、それらの品質を維持（変色、変敗の防止等）する
ことができる。

【００８５】５）本発明のＬＦ加水分解物を有効成分と
するチロシナーゼ活性阻害剤、チロシナーゼ活性阻害性
組成物を、ヒトの皮膚に接触する物品（例えば、化粧用
脱脂綿、ウェット・ティッシュー等）に適用（混入、含
浸等）することにより、それらを用いた場合、美白効果
が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６１７ Ａ６１Ｋ 31/00 ６１７ ６４３ ６４３Ｄ 38/16 37/14 38/55 37/64 (72)発明者 川瀬 興三 埼玉県浦和市白鍬761−１ (72)発明者 田村 吉隆 神奈川県横浜市港北区富士塚１−４−５ (72)発明者 高瀬 光徳 埼玉県大宮市南中丸138−10 (72)発明者 山内 恒治 神奈川県鎌倉市玉縄４−２−２ ガーデ ンハイツ鎌倉玉縄405 (72)発明者 齋藤 仁志 神奈川県川崎市麻生区百合ケ丘２−７− ４ 森永百合ケ丘社宅301 (72)発明者 阿部 広明 神奈川県横須賀市浦郷町３−43 (56)参考文献 特開 昭62−249931（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 38/00 A61K 7/00 A61K 7/48 A61K 38/16 A61K 38/55 ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳類のラクトフェリン、哺乳類のアポ
   ラクトフェリン、哺乳類の金属飽和ラクトフェリン、及
   びこれらの任意の混合物からなる群より選択されたラク
   トフェリンを加水分解して得られるラクトフェリン分解
   物を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害剤。
2. 【請求項２】 哺乳類のラクトフェリン、哺乳類のアポ
   ラクトフェリン、哺乳類の金属飽和ラクトフェリン、及
   びこれらの任意の混合物からなる群より選択されたラク
   トフェリンを加水分解して得られるラクトフェリン分解
   物を有効成分とするチロシナーゼ活性阻害性組成物。
3. 【請求項３】 ラクトフェリン分解物が、少なくとも
   ０．０５％（重量）の濃度で含有されている請求項１に
   記載のチロシナーゼ活性阻害剤。
4. 【請求項４】 ラクトフェリン分解物が、少なくとも６
   ％（重量）の加水分解率である請求項１又は請求項２に
   記載のチロシナーゼ活性阻害剤。
5. 【請求項５】 哺乳類のラクトフェリン、哺乳類のアポ
   ラクトフェリン、哺乳類の金属飽和ラクトフェリン、及
   びこれらの任意の混合物からなる群より選択されたラク
   トフェリンを加水分解して得られるラクトフェリン分解
   物を用いてチロシナーゼ含有物品を処理する方法。