JPS62249931A - 抗菌性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗菌性組成物に関し、詳しくは、生体に影響を
及ばすことなく、細菌の増殖を抑制しうる抗菌性組成物
に関する。

本発明の抗菌性組成物は、その直接の投与によるヒトお
よび動物における細菌の感染症の予防および治療に使用
することができ、また食品および飼料への添加による食
品および飼料の劣化、変敗などの防止、ならびにヒトお
よび動物における細菌の感染症の予防および治療などの
有害細菌の増殖の抑制に使用することができる。

〔技術の背景及び先行技術〕

母乳栄警児と人工栄養児の罹患率を比較すると明らかに
人工栄養児の方が高いことが知られている。この理由の
一つとして、母乳中にはビフィズス菌増殖因子、ラクト
フェリン及びリゾチームなどの感染防御因子が存在し、
乳児の腸内で大腸菌、クロストリジウム菌などの有害菌
の増殖を抑制することによると考えられている。このた
め、ラクトフェリン゛及びリゾチームの抗菌性について
従来から多くの研究が行なわれてきた。

ラクトフェリンは鉄結合蛋白質であり、生体内では涙、
唾液、末梢血及び乳汁などに含まれている。牛乳のラク
トフェリンの含量は人乳の約１７１０であるが、大腸菌
、カンジダ菌及びクロストリジウム菌などに抗菌効果を
示すことが知られている。〔ウェルシュ・ジエイ・ケー
・アンド・ジェイ・ティー・メイ：ジャーナル・オブ・
ペディアトリクス（Ｗｅｌｓｈ　Ｊ、に、　＆　Ｊ、Ｔ
、　Ｍａｙ　：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒ
ｉｅｓ　）第９４巻第１号（１９７９年）〕 牛由来のラクトフェリンを脱鉄したアポラクトフェリン
の抗菌作用については、大腸菌、スタフィロコッカス菌
及びストレプトコヅカス菌に対し、合成培地を用りた実
験において０．５〜３０■／−の添加量で増殖を抑制す
ることが知られている〔ビー・ジエイ・ノンネツケ・ア
ンド・ケー・エル・スミス：ジャーナル・オブ・ダイア
リ−・サイエンス（Ｂ、Ｊ、　Ｎｏｎｎｅｃｋｅ　＆　
Ｋ、Ｌ、　Ｓｍ１ｔｈ　：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａ
ｉｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　）第６７巻第６０６頁（１９
８４年）〕。脱鉄ラクトフェリンの作用は鉄要求性の高
い菌種に対し、鉄をキレートすること゛　　によりその
増殖を抑制するものと考えられている。

しかし、単独使用では、抗菌効果を発現するのに多くの
添加量を必要とし、その効果には自ずと限界があった（
第１表）。

一方、リゾチームは卵白、組織液、体液及び乳汁などに
存在し、一般にダラム陽性菌を溶菌する酵素として知ら
れている。ダラム陰性桿菌である大腸菌に対する作用に
ついては過酸化水素、アスコルビン酸又は分泌型のＩｇ
Ａとの共存下で溶菌作用を示すことが知られている〔加
藤英夫ら嗣：母乳噛育、第３６９頁、（１（１８３年）
　（メディサイエンス社）〕が単独での効果には限界が
あった（第１表）。また、リゾチームとラクトフェリン
又はアポラクトフェリンの抗菌性に関する相乗効果につ
いては、これ迄知見がなかった。

このため、本発明者らは牛乳から分離したうりトフエリ
ン、ラクトフェリンから鉄を除去したア　　゛ボラクト
フェリンと卵白から分離したリゾチームの抗菌性に対す
る相乗効果について、鋭意研究を重ね、牛乳から分離し
たラクトフェリンの鉄を除去したアポラクトフェリン及
び卵白リーゾチームを併用することにより抗菌性が一段
と増加することを見出し、以下の詳細な知見に基づいて
本発苧を完成した。

〔発明の目的及び要約〕

本発明の目的は、食品、医薬品、飼料に添加して投与す
るか又は直接投与するかにより感染症の治療、人又は動
物腸内の有害菌増殖の抑制、感染に対する防御能の増進
等に利用し得る抗菌性組成物を提供することにある。

本発明の他の′目的は、食品又は飼料の細菌による劣化
を防止し得る抗菌性組成物を提供することにある。

本発明は、アポラクトフェリン及びリゾチームを有効成
分として含有することを特徴とする抗菌性組成物である
。

本発明の抗菌性組成物において、アポラクトフェリン及
びリゾチームは５対９５ないし９５対５の重量比におい
て含有されることができ、アポラクトフェリンは、牛の
初乳、移行乳、常乳又は末期孔から分離する・ことがで
き、リゾチームは、卵白から分離することができ、さら
にアポラクトフェリンは、その鉄飽和度が２０％（重量
）以下のものを使用することができる。

本発明の抗菌性組成物におけるアポラクトフェリンは、
鉄結合蛋白質のラクトフェリンから鉄を除去することに
より得られる蛋白質であって、鉄を結合して固定する特
性を有するために、細菌が必要とする鉄分を、細菌が吸
収、摂取する以前に、アポラクトフェリンが結合して固
定し、それに易って細菌は鉄欠乏に陥り、そのために細
菌の増殖が抑制されると考えることもできるが、アポラ
クトフェリンの細菌の増殖抑制効果がリゾチームとの共
存により増大する作用機作はわからない。

〔発明の詳細な説明〕

本発明の抗菌性組成物におけるアボラクトフエリンは、
ラクトフェリンから鉄を除去して得られる蛋白質であっ
て、そのいかなるものであっても、これを使用すること
ができるが、鉄飽和度が５０％以下（特に好ましくは２
０％以下）のものを使用するのが好ましい。

リゾチームは、いかなるものであっても、これを使用す
ることができるが、卵白リゾチームを使用するのが好ま
しい。

以下に示す実験例、実施例および参考例に使用したアポ
ラクトフェリンは、公知の方法により牛乳から分離した
市販のラクトフェリン（オレオフイナ社、オランダ）を
公知の方法〔ビー・エル・マラソンおよびジエイ・エフ
・ヘレマンズ：ユーロビアン・ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリ（Ｐ、Ｌ、　Ｍａｓｓｏｎ　＆　Ｊ、Ｆ、
　Ｉｌｅｒｅｍａｎｓ　：　ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第６巻第
５７９〜５８４　Ｎ　（１９６８年）〕に準じて調製し
た。即ち、市販のラクトフェリンの１％水溶液を２０倍
量の０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ：　２．２）に対して
４″ｃにおいて３６時間透析した後、２０倍量の脱イオ
ン水に対して４°Ｃにおいて２４時間透析（途中２回脱
イオン水を交換した）して、クエン酸を除去した透析内
液を凍結乾燥することによって得られたアポラクトフェ
リンである。このアポラクトフェリンの鉄飽和度は約１
５％であるが、原料のラクトフェリンの鉄飽和度が３０
％であったから、その約５０％の鉄が除かれていた。

またリゾチームは、市販の卵白リゾチーム〔太陽化学（
株）製〕を使用した。

これらのラクトフェリン、アポラクトフェリン及びリゾ
チームを使用し、有害菌の一例としての大腸菌０−　Ｉ
ｌｌ　　（ＡＴＣＣ３３７８０）およびクロストリジウ
ム・バーフリンジエンス（ＡＴＣＣ１３１２４）に対す
る抗菌性、及び食品、医薬品並びに飼料に対する添加の
効果を検討し、これらを以下の実験例、実施例及び参考
例に示し、本発明の詳細な説明する。

実験例１ 大腸菌０−１１１　　（ＡＴＣＣ３３７８０）及びクロ
ストリジウム・パーフリンジヱンス（ＡＴＣＣ＋３１２
４　）に対するラクトフェリン又はアポラクトフェリン
とリゾチームとの抗菌効果を試験した。

ラクトフェリン、アポラクトフェリン及びリゾチームを
単独又はラクトフェリン、アポラクトフェリンとリゾチ
ームとを配合したものを含む生理食塩水〔食塩：０．９
％（重量）〕に、大腸菌〇−１１１又はクロストリジウ
ム・バーフリンジヱンスを前培養した一定菌数を含む培
養液を添加し、３７°Ｃにおいて２時間保持した。

保持培養液中の大腸菌０−１１１の菌数は普通寒天培地
〔栄研化学（株）〕を使用し、３７°Ｃ２４時間培養後
測定した。また、クロストリジウム・バーフリンジヱン
スの菌数はＣＡＭ寒天培地〔栄研化学（株）〕を使用し
、嫌気性下の３７°Ｃにおいて４８時間培養後測定した
。

なお、これらの菌の前培養方法は次のとおりである。

大腸菌０−１１１：普通寒天培地の保存菌株を普通ブイ
ヨン培地〔栄研化学（株）〕に植継ぎ、３７℃において
１６時間前培養した。この前培養を２回行なった後、培
養液中の大腸菌を遠心分離（３０００ｒ、ｐ、ｍ　、　
１５分間）シ゛、上澄液を除き、菌体を生理食塩水で洗
浄し再び遠心分離する操作を２回行ない、一定量の菌数
を含む生理食塩水を調製し、これを試験に供した。

クロストリジウム・パーフリンジエンス：　ＣＡＭ半流
動培地〔栄研化学（株）〕の保存菌株をＣＡＭブイヨン
培地に植え継ぎ、３７°Ｃにおいて１６時間前培養した
。この前培養を２回行なった後、前培養液を大腸菌０−
１１１の項で述べたと同じ操作を行ない、一定量の菌数
を含む生理食塩水を調製し、これを試験に供した。

実験結果は第１表に示すとおりであった。

（以下余白） この結果から（１）ラクトフェリンよりも脱鉄したアポ
ラクトフェリンの方が抗菌力が強いこと、（２）リゾチ
ーム、ラクトフェリン及びアポラクトフェリン単独では
これらを組み合わせたものよりも抗菌効果が著しく劣る
こと、（３）リゾチームとの相乗効果においては、ラク
トフェリンよりも脱鉄したアポラクトフェリンとの組み
合わせの方がはるかに効果があることなどが明らかとな
ったＯ 実験例２ 実験例１に示した通り、アポラクトフェリンの方がラク
トフェリンよりも抗菌性が強いことが明らかであったの
で、鉄飽和度の抗菌性に及ぼす影響についてさらに詳細
に検討した。

鉄飽和度の異なるラクトフェリンは、前述の公知の方法
により、鉄飽和度１０％のアポラクトフェリンを調製し
たのち、硫酸第１鉄を用いて鉄飽和度を高めることによ
って調製し、クロストリジウム・パーフリンジエンスに
対する抗菌性を実験例１と同様の方法によって試験した
。

実験結果は第２表に示すとおりであった。

第２表　鉄飽和度の異なるラクトフェリンの抗菌性 注）　※：生存率は試験群の菌数を対照の菌数で除し、
百分率（％）で表わした。

この結果から、鉄の飽和度を２０％以下に調整したアポ
ラクトフェリンが高い抗菌力を有することが明らかとな
った。

実験例３ 実験例２において、鉄飽和度が２０％以下のアポラクト
フェリンの抗菌性が強いことを明らかにしたが、次にア
ポラクトフェリンとりゾチ〒ムの比率による抗菌効果を
検討するために、大腸菌０−１１．１１に対する抗菌性
をペプトン培地（自社製）を用いて試験した。

抗菌性試験用、培地は、アポラクトフェリンとり゛ゾチ
ームをｏ　：　ｔｏｏ〜１００　：　０の範囲で配合し
た組成物をペプトンに対し０．５及び１．０％添加した
ペプトンの１％水溶液６・５−に、実験例１で述べた大
腸菌の前培養液０．５−を加え、更に脱イオン水３．０
　ｄを加え、１０ｍｊｌに調整し、３７°Ｃにおいて１
８時間培養した。菌の増殖性は波長６００　ｍμにおけ
る濁度により測定した。

ξお、生存率はアポラクトフェリンとリゾチームをＯ：
　１００〜１００　：　０に変化させたときに得られた
波長６００ｍμにおける吸光値をコントロール（アポラ
クトフェリン及びリゾチーム無添加）の゛　吸光値で除
し、百分率として求めた。

実験結果は図１に示すとおりであった。図１において縦
軸は生？８ｉ：率を、横軸はアポラクトフェリンとリゾ
チームの比率を示す。又、・−・及び〇−〇はそれぞれ
ペプトンに対する組成物の添加量が０．５％及び１．０
％であることを示す。

この結果から、大腸菌０−＋１１に対するアポラクトフ
ェリン及びリゾチームの相乗効果に関して次のことが判
明した。

（１）アポラクトフェリンの単独の添加では、ペプトン
に対し０．５％の添加で約２５％、１％の添加で約４０
％の増殖抑制（抗菌性）しか示さなかった。

（２）リゾチームの単独の添加では、ペプトンに対し１
％の添加でも、約１０％程度の抗菌性しか示さなかった
。

（３）アポラクトフェリンとリゾチームの併用によって
抗菌効果が著しく増大した。

（４）アポラクトフェリンとリゾチームの併用による抗
菌効果はアポラクトフェリン及びリゾチームの比率が５
：９５〜９５：５、（望ましくはＩＯ：’９０〜９０　
：　１０）の範囲内において最も顕著であった。

実験例１〜３から明らかなように、アポラクトフェリン
とリゾチームの抗菌性における相乗効果には顕著なもの
があった。

次に実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ リゾチーム〔太陽化学（株）製〕１０ｇ及びラクトフェ
リン〔オレオフイナ社製〕から調製したアポラクトフェ
リン９０９をよく倍散したのち、トウモロコシ澱粉２・
４Ｋｇと十分に混合し、最終組成物中、アポラクトフェ
リンとリゾチームの比率が９０対ｌＯのアポラクトフェ
リン及びリゾチームを含有する流動性のよい粉末状の抗
菌性組成物的２．５に９得た。

なお、アポラクトフェリンの調製は次のように行なった
。

ラクトフェリン〔オレオフィナ社製）１０（ｌを２１の
脱イオン水に溶解し、透析チューブに入れたのち、４０
１の０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ２，２）に対し、４°
Ｃで３６時間透析し、クエン酸を除くため、２０倍量の
脱イオン水に対し、４℃において２４時間透析（途中、
２回脱イオン水を交換）し、透析内液を凍結乾燥し、ア
ポラクトフェリン約９７９を得た。

実施例２ 実施例１において、リゾチーム０．９に９及びアポラク
トフェリン０゜Ｉ　Ｋｇを用いることにより、最終組成
物中のアポラクトフェリンとリゾチームの比率が１０対
９０のアポラクトフェリン及びリゾチームを含有する流
動性のよい粉末状の抗菌性組成物的２．５に９得た。

実施例３ リゾチーム〔太陽化学（株）製）ＩＫ９及びアポラクト
フェリン〔オレオフィナ社製〕ＩＫ９を混合機を用いて
予備倍散したのち、賦形剤として結晶乳糖とヒドロキシ
ルプロピルスターチ６０％、結晶セルロース２０％、ケ
イ酸アルミニウム２０％の混合物を１＝１の割合で混合
した粉末９８に９と混合し、十分に倍散したのち、直接
粉末圧縮し、リゾチーム１％及びアポラクトフェリン１
％を含む１錠当たり２ｇの錠剤型の抗菌性組成物４９１
５６０個を得た。

実施例４ リゾチーム〔太陽化学（株）製）　１２゜５に９及びア
ポラクトフェリン（オレオフィナ社製）　　１２．５胸
を混合機を用いて予備倍散したのち、デキストリン７５
に９を添加して十分に混合し、最終組成物中のアポラク
ト・フェリンとリゾチームの比率が５０対５０のアポラ
クトフェリン及びリゾチームを含有する流動性のよい粉
末状の抗菌性組成物的１００に９得た。

次に上記の実施例で得た抗菌性組成物の使用例について
詳述する。

参考例１ 実施例１の組成物を司令２〜８ケ月の健康乳児５例に毎
日１０ｇ温水に溶解して１週間継続して与えたところ、
投与前後における構便中の大腸菌０−１１１及びクロス
トリジウム・バーフリンジエンスの菌数は第３表に示す
とおりであり、投与後において、有害菌の増殖が明らか
に抑制された。

参考例２ 実施例２で調製した組成物をかまばこの製造に使用した
。

かまぼこ製造時の配合割合は次のとおりである。

原料肉（白グチ、ハモを２：ｌに混合したもの）１００
部 実施例２の組成物　　　　　　　　　　　ｌＯ部食塩　
　　　　　　２．５部 砂￥ｉ　　　　　　　　　　　　６．０部グルタミン酸
ソーダ　　　　　　　　　１．０部氷水　　　　　　　
２０．０部 みりん　　　　　　　　　　　　　　３・０部かまばこ
の製造工程は以下のとおりである。

原料肉を宿涜機に投入し、次いで食塩を添加した。粘着
性及び光沢がでてきた後、砂糖、グルタミン酸ソーダ及
びみりんを添加し調味づけをした。

この間、糊状になった塩溶性蛋白質を冷却するための氷
水に実施例２め組成物を分散させて添加した。この虐潰
は１５°Ｃ以下で４５分間行なった。信潰終了後すり身
をかまぼこ型に成型し、焙焼法による加熱を行ない保存
性のよいかまぼこを調製した。

実施例２の組成物１０部の代りにとうもろこしでんぷん
１０部を用いて同様に調製した焼抜きかまぼこを対照と
してその保存性を５°Ｃ冷蔵保存下で比較した結果は、
第４表に示すとおりであった。

第４表　かまばこ中の菌数（かまぼこ１ｇ当り）参考例
３ 実施例３で得た錠剤を４０才から６０才の健康成人５例
に１回５錠、１日３回毎食後３０分毎に服用させたとこ
ろ、第５表に示すように腸内の有害菌の増殖は明らかに
抑制された。

（２０）　　　。

参考例４ 実施例４で得た組成物を下痢の症状を呈している幼若ブ
タに１日当たり１０ｇ投与し、下痢に対する治療効果を
検討したところ、第６表に示すとおり、対照（デキスト
リンのみ投与）が４頭に投与し治癒したのが全くいなか
ったのに対し、本発明の抗菌性組成物を投与することに
より６頭巾４頭に下痢の改善が認められた。

第６表　幼若ブタの下痢の治癒 〔発明の効果〕 本発明によって奏せられる効果は次のとおりである。

（，１）人又は動物の感染症の治療に有効である。

（２）人又は動物腸内の有害菌の増殖を防止し得る。

（３）人又は動物の感染防御能を増進し得る。

（４）食品又は飼料の細菌による劣化を防止し得る。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）アポラクトフェリン及びリゾチームを有効成分と
   して含有することを特徴とする抗菌性組成物。
2. （２）アポラクトフェリンとリゾチームが、重量比で５
   対９５ないし９５対５の比率で含有されることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の抗菌性組成物。
3. （３）アポラクトフェリンが、牛の初乳、移行乳、常乳
   又は末期乳から分離されたものであることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項又は第２項のいずれかに記載の抗
   菌性組成物。
4. （４）リゾチームが、卵白から分離されたものであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第３項のい
   ずれかに記載の抗菌性組成物。
5. （５）アポラクトフェリンが、鉄飽和度が２０％（重量
   ）以下のものであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項ないし第４項のいずれかに記載の抗菌性組成物。