KR100853717B1 - 리소좀을 포함하는 친환경 항균제 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리소좀을 포함하는 친환경 항균제 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 계란 내의 흰자(난백) 속에 60％ 이상으로 다량 함유되어 있으면서 세포내에서 항균력을 지닌 세포 소기관인 리소좀(lysosomes)을 이용하여 보다 안전하고 인체에 무해한 항균제에 관한 것이다.

본 발명의 리소좀은 세포 소기관으로서 생물체에 부작용 및 독성이 없으므로 이를 이용하여 종래의 리소좀 기능인 유해 세균 살균 효과를 이용하여 농축산물에 쉽게 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 항균력을 향상 시킬 수 있는 최적 조건의 pH와 온도를 조절하여 최적 환경조건을 제공하면 응용범위가 넓은 항균제로써의 개발이 가능 할 것이다.

Description

리소좀을 포함하는 친환경 항균제 및 그 제조방법{Pro-Environmental Antimicrobial Agent comprising Lysosome and Preparation Method Thereof}

본 발명은 리소좀(Lysosome)을 포함하는 친환경 항균제 및 그 제조방법에 관한 것이다. 현재 많은 항균제가 나와 있지만 화학약품을 사용하거나 친환경적 항균제라도 항균력의 범위가 제한적이다.

본 발명은 계란 흰자 속에 60％ 이상 함유되어 있는 세포 소기관인 리소좀을 이용하여 종래의 리소좀 기능인 유해 세균 살균(killing) 효과를 이용하여 농축산물에 쉽게 적용할 수 있으며, 생물체에 부작용 및 독성 효과가 없는 친환경 항균제를 개발하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 합성 농약의 오남용, 인축에 직접적 피해, 농산물에의 잔류 농약, 환경 오염으로 인한 생태계의 파괴와 저항성 병행충의 증가로 인하여 국제적으로 화학적인 합성 농약 및 항생제 사용을 줄이려는 경향에 부합되는 친환경 항균제 개발을 가능하도록 하는 기술이다.

우리나라의 경우에도 향후 10년 이내에 화학농약 및 항생제의 사용량을 70％ 이하로 줄이는 것으로 정책을 수립하였으며, 또한 생물농약으로 현재 미생물 농약을 사용하고 있으며 2006년 3월 당시 20종(살균제 11종, 살충제 9종)이 출시되었으 나, 소재 자체가 살아 있는 미생물이라는 특성 때문에 사용을 꺼리는 소비자들이 많다.

현재 농업경쟁력 및 농가 소득 보장등 농업인들의 기술적 애로를 해결하기 위한 정부의 노력이 지속되고 있는 가운데, 저렴한 항균제 개발이 시급한 상황이며, 합성 농약 및 항생제를 대체하여 국내에서 제조/유통되고 있는 천연물 유래 제품들의 경우, 유해 미생물 및 곰팡이류에 대한 효율은 뛰어나지만 최근 문제가 되고 있는 환경내의 바이러스등에 대한 처리는 불가능하다는 것이 단점으로 제시되고 있다.

최근까지 개발된 항균제들의 경우, 농업 및 식품등으로 응용 분야가 제한되어 있었으나, 유해물질 제거 후 곰팡이 오염 문제가 시급한 페이트업, 여러 가지 바이러스로 인해 발생하는 인축 등의 질병 등에 대한 응용이 시급한 실정이다. 그러나 생물유래 물질인 리소좀을 이용한 친환경 항균제의 개발은 상기 언급된 모든 문제들을 해결할 수 있는 새로운 개념의 항균제 개발을 가능하게 한다.

본 발명은 합성 농약의 오남용, 인축에 직접적 피해, 농산물에의 잔류 농약, 환경 오염으로 인한 생태계의 파괴와 저항성 병행충의 증가로 인하여 국제적으로 화학적인 합성 농약 및 항생제 사용을 줄이려는 경향에 부합되는 생물체에 부작용 및 독성이 없는 친환경 항균제에 관한 것이다.

리소좀은 가수 분해 효소를 많이 함유하고 소화 작용을 하는 세포의 작은 기 관으로서 0.25∼0.5㎛로 미토콘드리아보다 작으며 세균 등의 이물(異物)이나 노후한 자신의 세포를 소화하는 역할(自己消化)을 한다. 식세포 작용을 하는 세포질 중에 많이 볼 수 있고 세포내 성분의 대사에 관계하는 것 외에 특히 식세포작용으로 외계 이물질의 세포내 소화에 중요한 역할을 한다.

리소좀은 세포 마쇄액(磨碎液)의 원심분획법에 의하여 미토콘드리아와 미크로좀의 중간으로 분획이 되며 미토콘드리아와 달라서 한 겹의 막구조로 싸여 있으며, 이 내부는 약산성에 최적 pH를 가지는 가수분해효소의 존재가 밝혀져 있다. 예를 들면 산성 탈인산가수분해효소, 리보핵산가수분해효소, 가텝신, β-글루클로리타아제, 아릴술퍼타아제 등이 그 대표적인 효소이다. 리소좀막의 안정성은 세포의 생명과 관계가 있다. 비타민 A의 다량 투여나 방사선조사에 의해 막이 파괴되기 쉽게 되면, 내부에 있는 효소가 세포질 중에 방출되어 장애를 일으킨다. 한편 리소좀막을 안정하게 하는 것에는 코르티코이드와 같은 스테로이드나 토코페롤이 있다.

리소좀에 관한 종래기술을 보면 한국특허출원번호 1998-0700750(트랜스제닉동물의 젖속에 생성되는 리소좀성단백질)은 젖에 인산화된 리소좀 단백질을 생성하는 유전자 전이된 비인류 포유동물과 그 생산방법에 관한 것으로 젖으로부터 인산화된 리소좀 단백질을 분비하는 건강한 유전자전이 포유류를 제공하고, 젖으로부터 얻은 리소좀 단백질을 정제하여 효소교환 요법에서 사용되는 약학적 조성물에 그 단백질을 결합하는 방법이다.

한국특허출원 2001-7011737(사포닌 및 기타 마커를 사용하는 리소좀 축적 질환의 진단방법)은 환자의 시료중 사포님, LAMPs 및 α-글루코시다제의 수준의 검출 을 기초로 하는 리소좀 축적 질환의 진단방법 및 모니터 방법에 관한 것이다.

한국특허출원 2006-7003451(리소좀성 축적병에서 결핍된 리소좀 효소전구체의 지속된 분비를 위한 유전자 변형체세포)은 체세포를 이용하여 리소좀 축적병을 치료하는 방법 및 치료효소를 전달하는 방법에 관한 것이다. 또한 한국특허출원 2007-8585(리소좀성 효소 결핍을 위한 조성물 및 이의 용도)은 β-글루칸을 포함하는 추출된 효모세포벽, 페이로드 포착분자가 리소좀성 효소 결핍의 기능을 보충하는 조성물에 관한 것이다.

그 밖에 천연항균제에 관한 한국특허공개 2003-0012821(천연항균제)는 황금추출물에서 분리정제한 디티에프를 주성분으로 하는 천연항균제에 관한 것이고, 한국특허공개 2004-0065376(계지 추출물을 함유하는 천연 항균제)는 계지로부터 추출한 정유성분의 항균제에 관한 것이고, 한국특허공개 2006-0003508(망태버섯 추출물을 포함하는 천연 항균제의 제조방법 및 그로부터 수득되는 천연항균제)는 버섯추출물을 포함하는 천연항균제에 관한 것이다.

그러나 이들 종래기술은 본 발명과 기술적구성이 다르다.

본 발명은 인체 및 농축산물에 피해를 주지 않으면서 효과적으로 유해 세균 및 바이러스를 제거하기 위하여 계란 흰자로부터 분리한 세포 소기관인 리소좀을 phosphate buffer에 현탁하여 완성된 리소좀 항균제로서 새로운 개념의 항균제를 개발하는 데 있다. 리소좀은 세포 내부에서 추출한 것이므로 세포 밖에서는 활성을 지니지 않거나 활성 정도가 떨어질 수도 있으므로 세포 내부의 환경을 고려해 리소좀이 가장 활성을 잘 나타낼 수 있는 조건을 찾는 데 있다. 즉, 최적 환경 조건을 찾기 위해 농도, pH, 온도에 관해 실험한 결과 리소좀의 농도는 20％일 때, pH는 6일 때, 온도는 50℃를 제외한 온도에서 활성이 잘 나타는 것을 알 수 있다.

본 발명은 달걀에서 흰자를 분리하여 난백의 점성을 제거하고 단백질의 손상을 방지하기 위하여 얼음 용기에 흰자를 넣고 호모게나이져로 9500/min, 1∼ 2분 정도 균질시키는 단계와, 리소좀이 함유된 세포를 원심분리기로 800×g, 4℃에서 10분간 1차 원심분리하여 침전물(pellet)을 제거하고 상등액(supernatant)을 얻는다. 리소좀이 포함된 상등액을 원심분리기로 20,000×g, 4℃에서 30분간 2차 원심분리하여 상등액을 제거하고 리소좀이 포함된 침전물을 얻는 단계와, 인산염완충액에 리소좀을 8 : 2의 비율로 혼합하여 항균제를 얻는 단계로 구성된다. 상기에서 리소좀은 리소좀 이외에 미토콘드리아나 퍼옥시좀 등이 섞여 있는 상태로서 흰자 1ml을 원심분리 했을 경우 100∼200ul 정도 얻어진다.

국내외 환경의 변화로 인하여 화학적 합성 농약 및 항생제를 대처할 기술 개발이 미진한 상태로 생체기능성 신소재인 리소좀을 이용한 항균제 개발의 절대적으 로 필요하며, 안정성으로 인하여 세포내부에 존재하는 작은 소기관인 리소좀을 이용하는 것으로 생물체자체를 사용하지 않으면 단지 기능만을 활용하는 친환경적 신생물 소재로 사업화 추진시 수요가 급증할 것으로 판단된다. 경제성면에서 리소좀을 가장 많이 함유하고 있는 것으로 알려져 있는 계란의 경우 시중에서 매우 저렴하게 구입할 수 있어 시제품 개발에 큰 어려움이 없으며 저렴한 가격으로 판매되어 질 수 있으며 효용성면에서 리소좀은 세포내로 외부 유해물질이 침입하였을 때 세포를 보호하는 기관으로 미생물, 곰팡이, 유해 활성산소족 뿐만 아니라 바이러스에 대한 처리 효율도 검증된 상태이고, 응용성면에서 리소좀은 친환경 농약물질, 의약품, 식품, 화장품, 동물 약품 및 사료 첨가제등으로의 응용범위가 매우 다양하다.

본 발명의 항균제는 부작용 및 독성이 없으므로 이를 이용하여 농축산물의 유해 세균의 살균에 효과적으로 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 항균력을 향상 시킬 수 있는 최적 조건의 pH와 온도를 조절하여 광범위하게 사용할 수 있을 것이다.

본 발명은 항균제에 있어서, 세포 소기관인 리소좀을 포함하는 친환경 항균제를 나타낸다.

본 발명의 항균제에서 리소좀은 항균력을 위하여 pH 5.0∼7.0의 인산염완충액 70∼80％ : 리소좀 20∼30％로 혼합될 수 있다.

본 발명의 항균제에서 리소좀은 항균력을 위하여 pH 6.0의 인산염완충액 70∼80％ : 리소좀 20∼30％로 혼합될 수 있다.

본 발명의 항균제에서 리소좀은 가금류의 알에서 분리한 것을 사용할 수 있다.

상기에서 가금류의 알은 달걀, 메추리알, 타조알, 오리알 중에서 선택된 어느 하나를 나타낸다.

본 발명은 리소좀을 포함하는 천연 항균제의 제조방법을 포함한다.

본 발명의 리소좀을 포함하는 천연 항균제의 제조방법은 천연 항균제의 제조에 있어서, 가금류의 알에서 분리한 리소좀을 인산염완충액에 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명의 리소좀을 포함하는 천연 항균제의 다른 제조방법은

가금류의 알에서 노른자를 제거하고 흰자를 얻어 호모게나이저로 균질화시키고 점성을 제거하는 단계와,

균질된 흰자를 원심분리 튜브에 넣고 1차 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 얻은 후, 상기 상등액을 원심분리기로 2차 원심분리하여 리소좀의 침전물을 얻는 단계와,

상기 2차 원심분리하여 얻은 리소좀 침전물로부터 리소좀을 얻고, 이 리소좀을 인산염완충액에 혼합하여 항균제를 얻는 단계를 포함한다.

상기 가금류의 알에서 노른자를 제거하고 흰자를 얻어 호모게나이저로 5000/min 이상의 속도로 1∼5분, 바람직하게는 5000/min∼10000/min의 속도로 1∼5분, 보다 바람직하게는 9000/min∼9500/min 속도로 1∼2분 동안 균질화시키고 점성 을 제거할 수 있다.

상기 균질화된 가금류의 흰자를 원심분리 튜브에 넣고 100∼1000×g, 1∼10℃에서 5∼15분간 1차 원심분리, 바람직하게는 800×g, 4℃에서 10분간 1차 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 얻은 후, 얻은 상등액을 원심분리기로 5000∼30,000×g, 2∼15℃에서 20∼40분간 2차 원심분리, 바람직하게는 20,000×g, 4℃에서 30분간 2차 원심분리하여 리소좀의 침전물을 얻을 수 있다.

상기 2차 원심분리하여 리소좀의 침전물로부터 리소좀을 얻고, 이 리소좀을 인산염완충액에 혼합하여 항균제를 얻을 수 있다. 이때 리소좀은 항균력을 위하여 pH 5.0∼7.0의 인산염완충액 70∼80％ : 리소좀 20∼30％로 혼합하거나 또는 pH 6.0의 인산염완충액 70∼80％ : 리소좀 20∼30％로 혼합할 수 있다.

상기에서 가금류의 알에서 분리한 흰자의 균질화 중에 단백질의 손상을 방지하기 위하여 흰자가 첨가된 용기에 얼음을 넣고 균질화할 수 있다.

상기에서 가금류의 알은 달걀, 메추리알, 타조알, 오리알 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 아래의 실시예에 의하여 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명의 일예를 나타낸 것으로서 이들에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

달걀(70g)에서 노른자를 분리하고 50g되는 흰자를 호모게나이저로 9500/min 속도로 단백질 손상방지를 위하여 비커에 얼음(ice)을 넣은 상태로 1∼2분정도 균질화 시키면 흰자의 점성이 없어진다. 점성이 없어진 흰자를 원심분리 튜브에 넣고 800×g, 4℃에서 10분간 1차 원심분리하여 침전물은 제거하고 상등액 42.5g를 얻는다. 이 때 침전물과 상등액의 비는 1 : 10 정도이다. 이 여과물을 재차 원심분리기로 20,000×g, 4℃에서 30분간 원심분리하여 리소좀이 포함된 침전물 4.5g을 인산염완충액에 첨가하여 인산염완충액과 리소좀이 8 : 2의 비율로 혼합된 항균제를 얻었다(도 1 참조).

<실시예 2>

계란 흰자로부터 분리된 리소좀을 인산염완충용액에 농도별로 0.1％, 0.5％, 1.0％, 5.0％, 10％, 20％, 30％, 40％로 다양하게 조절하여 대장균(Escherichia coli TOP10(invitrogen)의 OD₆₀₀ 값이 0.6∼0.7정도 되었을 때 10^-6으로 희석하여 살균 효율을 비교한 결과를 다음의 표 1 및 도 2에 나타내었다. 그 결과 20％의 리소좀을 활용한 경우가 가장 높은 살균 효과를 나타내었다.

표 1. 리소좀 농도별 살균효과(단위:％)

농도(％)	0.1	0.5	1.0	5.0	10	20	30	40
살균율(％)	22	23	30	47	66	93	82	77

계란 흰자로부터 분리한 리소좀을 인산염완충액의 pH에 따른 대장균 살균효과를 비교하여 도 3에 나타냈다. 그 결과 리소좀에 pH 6.0에서 92％의 살균효과와, pH 7.0에서 82％의 살균효과와, pH 5.0에서 68의 살균효과를 나타냈다. 또한 pH 6.0으로 제작된 phosphate buffer에 20％의 리소좀을 현탁하여 만들어진 친환경 항균제의 보관 온도를 달리하여 처리 효율을 도 4와 같이 확인했던 바, 50℃로 보관할 경우를 제외하고는 크게 변화가 없어, 제작된 항균제를 상온이나 냉장 보관하여도 높은 처리 효율이 나타났다. 도 5는 개발된 친환경 항균제가 상온에서 최장 42일간 보관하였을 때 살균 효과의 유지 정도를 확인하였던 바, 경과 일자에 따른 변화는 크게 없는 것으로 나타났다. 도 6은 개발된 친환경 항균제의 여러 가지 균주 중에서 스트렙토마이세스, 시겔라, 크산토모나스, 이콜라이, 코리네박테리움에 대한 살균 효율을 비교한 것이다. 스트렙토마이세스가 50％ 수준이고, 나머지는 80％ 이상의 살균 효과를 나타냈다.

도 1은 계란 흰자으로부터 리소좀을 분리한후 세균을 처리하기 위한 항균제 제작을 설명하는 것이다.

도 2는 계란 흰자로부터 분리된 리소좀을 여러 가지 농도별로 phsphate buffer에 희석하여 항균성 효율을 분석한 것이다.

도 3은 계란 흰자로부터 분리된 리소좀을 phosphate buffer의 pH를 달리하여 대장균 처리 효율을 비교한 것이다.

도 4는 계란 흰자로부터 분리된 리소좀을 phosphate buffer에 희석한 후 보관 온도를 여러 가지로 선정하여 대장균 처리 효율을 비교한 것이다.

도 5는 친환경 항균제가 장기간 보관시 처리 효율의 유지 정도를 확인한 것이다.

도 6은 친환경 항균제의 여러 가지 균주들에 대한 처리 효율을 비교한 것이다.

Claims (6)

1. 세포 소기관인 리소좀을 포함하는 친환경 항균제에 있어서,

   pH 5.0∼7.0의 인산염완충액 70∼80％ : 리소좀 20∼30％로 혼합하는 것을 특징으로 하는 친환경 항균제
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 리소좀은 가금류의 알에서 분리한 것 임을 특징으로 하는 친환경 항균제
4. 가금류의 알에서 노른자를 제거하고 흰자를 얻어 호모게나이저로 균질화시키고 점성을 제거하는 단계와,

   균질된 흰자를 원심분리 튜브에 넣고 1차 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 얻은 후, 상기 상등액을 원심분리기로 2차 원심분리하여 리소좀의 침전물을 얻는 단계와,

   상기 2차 원심분리하여 얻은 리소좀 침전물로부터 리소좀을 얻고, 이 리소좀20~30% : pH 5.0~7.0의 인산염완충액 70~80%로 혼합하여 항균제를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리소좀을 이용한 친환경 항균제의 제조방법
5. 제 4항에 있어서, 흰자의 균질화 중에 단백질의 손상을 방지하기 위하여 용기에 얼음을 넣고 균질화하는 것을 특징으로 하는 리소좀을 이용한 친환경 항균제의 제조방법
6. 제 4항에 있어서, 가금류의 알은 달걀, 메추리알, 타조알, 오리알 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 리소좀을 이용한 친환경 항균제의 제조방법

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