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Diese Erfindung betrifft einen Zusatzstoff
für ein
Tiernahrungsmittel und insbesondere einen Zusatzstoff, der die Rate
an Gewichtszunahme eines Tiers, das mit diesem enthaltenen Nahrungsmittel
gefüttert
wird, verbessert. Sie betrifft weiterhin einen Zusatzstoff, der
bei der Behandlung und/oder Vorbeugung von Kokzidiose und/oder einer
bakteriellen Infektion einschließlich solchen, die zu einer
nekrotischen Enteritis führen
können,
nützlich
ist.
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Das Halten von verschiedenen Tierarten
ist zur Herstellung von Nahrungsmitteln zum menschlichen Verbrauch
in der ganzen Welt wichtig. Während
die Tiere gehalten werden, können
sie mit einer Vielzahl von Infektionen verursachenden Bakterien
und Parasiten, wie Eimeria, Campylobacter, Clostridium, Salmonella
E. coli und Listerien in Kontakt kommen.
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Kokzidiose ist eine häufige Ursache
für Erkrankungen
bei Intensivbeständen
auf Farmen, insbesondere bei Geflügel. Kokzidiose wird durch
Protozoen verursacht, einem einzelligen Parasiten, dem subphylum Apicomplexa.
Viele dieser Arten, die diese Erkrankung bei Haustieren verursachen
können,
gehören
zur Gattung Eimeria. Die Parasiten vermehren sich im Epithel des
Darms. Bei Hühnern
wurden sieben Arten von Eimeria identifiziert, fünf von diesen werden als pathogen
angesehen. Diese sind E. acervulina, E. maxima, E. necratrix, E.
tenella und E. brunetti.
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Kokzidien sind ubiquitäre Organismen
und sind im allgemeinen endemisch wo immer Hühner aufgezogen werden. Das
Ausbrechen dieser Erkrankung kann von schweren bis sehr milden Infektionen
variieren. Wie bei vielen parasitären Protozoen ist der Lebenszyklus
von Eimeria relativ komplex.
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Geschlechtliche und nicht geschlechtliche
Vermehrung geschehen innerhalb des Darms der Hühner. Währens dieses Vermehrungsverfahrens
und der Entwicklung des Parasits wird das Wirtsgewebe zerstört, dies
führt zu
verschiedenen klinischen Mannifestationen, die beim Ausbrechen von
Kokzidiose beobachtet werden können.
Die hergestellten und ausgeschiedenen Oozysten entwickeln sich außerhalb
des Wirts weiter, dort können
sie einer weiteren Entwicklung unterliegen und andere Hühner infizieren.
Oozysten können
tatsächlich
außerhalb
des Wirts für
einen langen Zeitraum überleben,
dies erlaubt ihnen, andere Vögel,
selbst nach Entfernen des anfänglich
infizierten Wirts, zu infizieren. Sie können sich selbst zwischen Herden über andere
Wege ausbreiten, einschließlich
dem Menschen, Haustieren, Insekten, Nagern, Staub und anderen Vögeln.
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Sporulierende Oozysten enthalten
vier Sporozysten, diese enthalten jeweils zwei Sporozoiten. Diese Sporozoiten
werden durch mechanische und enzymatische Einwirkung im Verdauungstrakt
der Hühner
freigesetzt. Dies erlaubt ihnen, die Epitelzellen im Darm oder Blinddarm
in Abhängigkeit
von der involvierten Eimeriaart zu besiedeln. Obwohl es Unterschiede
in der Pathogenität
zwischen den Arten und Stämmen
von Eimeria gibt, sind die Symptome, die von einem infizierten Tier
aufgezeigt werden, mehr oder weniger eines der folgenden: Bluttropfen,
hohe Sterblichkeit, allgemeine Lethargie, Abmagerung, ein deutlicher
Abfall im Nahrungsverbrauch, Diarrhoe und ein Abfall bei der Eierproduktion.
Es wurde geschätzt,
dass Kokzidiose für
ungefähr 6
bis 10% der ungewollten Sterblichkeit unter Geflügelbeständen verantwortlich ist. Weiterhin
führt die
subklinische Erkrankung zu einer Erhöhung der Nahrungsumwandlungsverhältnisse
(feed conversion ratios (FCR)) und einer reduzieren Leistung. Entsprechend
sind die wirschaftlichen Konsequenzen dieser Erkrankungen bemerkenswert
und in höchstem
Maße ungewollt.
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Verschiedene Verfahren wurden untersucht,
um Kokzidiose zu bekämpfen.
Versuche wurden gemacht, die Erkrankung durch Management-Strategien,
aufbauend auf hohen Hygienestandards zusammen mit der Verwendung
von chemischen Desinfektionsmitteln in der Umgebung des Geflügels zu
kontrollieren. Aber selbst unter bedenklichen hygienischen Bedingungen
stellte es sich als unmöglich
heraus, Kokzidiose auszurotten, obwohl sich zeigte, dass solche
Mittel den anfänglichen
Infektionsdruck im Geflügelhaus
verringern. Sowohl lebende als auch attenuierte Vakzine wurden als
Regulationsverfahren untersucht, sie sind allerdings relativ teuer
und neigen dazu, die Wachstumsrate der Tiere aufgrund ihrer Wirkung
zu unterdrücken.
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Zur Zeit wird Kokzidiose bei Geflügel routinemäßig durch
Verwendung von relativ kostenträchtigen vorbeugenden
Antikonzidose-Arzneimittelprogrammen reguliert. Solche Programme
versuchen, die kokzidalen Infektionen zu begrenzen und somit die
Effekte eines subklinischen Ausbruchs dieser Erkrankung zu begrenzen.
Dies wird üblicherweise
durch kontinuierliches Einschließen von antikokzidalen Mitteln
in die Nahrung von einem frühen
Lebenszeitpunkt des Bestands bis kurz vor der Schlachtung der Hähnchen oder
durch kontrolliertes Weglassen bei Legehühnern erreicht. Zuerst wurden
nach Entwicklung diese Mittel individuell verwendet. Dies führte bei
Parasitenstämmen
häufig
zur Entwicklung einer Arzneimittelresistenz. Zur Zeit wird versucht,
die Kokzidiose durch kontinuierliches Zufügen von neuen Arzneimitteln
zu kontrollieren oder durch Verwendung von Arzneimittelprogrammen,
die eine rotierende Verwendung von antikokzidalen Mitteln von verschiedenen
biochemischen Strukturen, entweder während der Wachstumsphase (Shuttleprogramme)
oder in häufigen
Intervallen (Rotationsprogramme). Abgesehen von der routinemäßigen Verwendung
von antikokzidalen Mitteln in Nahrungsmitteln für Geflügel wird eine subklinische
Kokzidiose in der Mehrzahl der Geflügelfarmen gefunden.
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Innere Salze von quaternären Aminocarbonsäuren funktionieren
als Osmoprotektoren. Solche Salze erhöhen die osmotische Stärke der
Zellen ohne nachteilig die Enzymaktivität zu beeinflussen und sie schützen Enzyme
vor einer ionischen oder Temperaturinaktivierung (Nash et al., Aust.
J. Plant Physiol. 9: 47–57
(1982); Yancey et al. Science 224: 1064–1069 (1982); Rudolph et al.,
Archives Biochem. Biophys. 245: 134–143 (1986); McCue & Hanson, Trends
in Biotechnology 8: 358–362
(1990); Papageorgiou et al., Curr. Res. In Photosynthesis 1: 957–960 (1990)).
Während
einige Organismen (und Gewebe) innere Salze, wie Betain, in hohen Mengen
unter osmotischem Stress durch osmotisch induzierte Synthese anreichern
können,
fehlt den meisten Tieren diese Fähigkeit,
sie sind abhängig
von der Aufnahme von exogenen inneren Salzen. Zum Beispiel zeigten
isolierte Mitochondrien von Lachsleber eine erhöhte Betain-Aufnahme aber keine
-Synthese, wenn sie osmotischem Stress ausgesetzt wurden (G. Bjorkoy,
Synthesis and Accumulation of glycine betaine in Salmon (Salmo salar)
and Mussels, MSc thesis, Notwegian College of Fisheries, Universität von Tromso,
Seite 94).
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Die Verwendung von Betain zur Behandlung
von Kokzidiose ist offenbart in der
US
5,834,473 . Die kombinierte Verwendung von Betain und einem
Coccidiostat zum gleichen Zweck wird in der WO 94/24886 gelehrt.
EP-A-0 681 787 schlägt
die Verwendung von Enzymen, wie einer Protease und/oder einer Carbohydrase
zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Kokzidiose vor.
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GB-A-2 327 345 lehrt, dass bakterielle
Infektionen im Ileum von Beständen
behandelt werden können durch
Einfügen
in Tiernahrungsmittel von Enzymen, die den Verdau des Nahrungsmittels
fördern.
Solche Enzyme bauen Polysaccharide, die in Getreidekomponenten des
Nahrungsmittels vorhanden sind, in Oligosaccharide ab, die als Nahrungsquelle
für den
Wirt nützliche
Mikroorganismen, die in den Eingeweiden vorhanden sind, vorteilhaft
sind. Durch diese Vermehrung können
pathogene Bakterien aufgrund des kompetitiven Ausschlussverfahrens
nicht emporkommen. Diese Strategie ist im allgemeinen wirksamer,
wenn die Nahrungsqualität
gering ist (Classen et al., Proc. 2. Eur. Symp. on Feed Enzymes,
1995, 65; Pack and Bedford, Poultry International, 1998, 43).
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JP-A-01 238538 und JP-A-01 132533
lehren die kombinierte Verwendung von Betain und verschiedenen Enzymen
zur Verbesserung der Verdauungsfunktion bei Tieren. Keines dieser
Dokumente schlägt
allerdings die Verwendung von solchen Kombinationen zur Behandlung
oder Vorbeugung von Kokzidiose oder Bakterieninfektionen oder zur
Unterstützung
der Aufrechterhaltung der Wachstumsrate bei Tieren, die einer kokzidialen
Provokation ausgesetzt sind, vor.
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Eine der problematischsten Erkrankungen
in Beständen
ist die nekrotische Enteritis aufgrund von Clostridium perfringens.
Clostridium-Infektionen geht üblicherweise
eine Kokzidiose voraus. Kokzidiose umfasst eine Immunantwort des
Tieres, so dass das Tier weniger in der Lage ist zu antworten, wenn
es anschließend
einer Bakterieninfektion ausgesetzt ist.
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Allerdings können auch andere Faktoren,
wie Stress, eine Überbesetzung
oder Verschmutzung ebenfalls dazu beitragen. Nekrotische Enteritis
wird üblicherweise
durch Versetzen der Tiernahrung mit wasserlöslichem Zinkbacitracin, Virginamycin
oder Penicillin behandelt.
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In der folgenden Beschreibung und
den Ansprüchen
wird Bezug genommen auf Einheiten der Proteaseaktivität, Einheiten
der Xylanaseaktivität
und Einheiten der α-Amylaseaktivität. Diese
Aktivitäten
in einer Enzymvormischung oder Flüssigenzymmischung werden wie
folgt bestimmt.
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Bestimmungsverfahren
Proteaseaktivität
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Eine Einheit Proteaseaktivität ist die
Menge an Enzym, die aus dem Substrat 1 μg einer phenolischen Verbindung (ausgedrückt als
Tyrosinäquivalente)
in einer Minute unter den beschriebenen Bedingungen freisetzt.
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Reagenz
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1. 0,6% (G/V) Caseinsubstrat
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Abwiegen von 0,6 g trockenem Hammarsten
Casein (Merck 2242) in ein 200 ml Becherglas. Befeuchten mit einer
kleinen Menge (ca. 5 ml) destilliertem Wasser. Wenn das Casein kräftig befeuchtet
wurde, werden 20 ml 0,2 M Dinatrium-Hydrogenphosphatlösung hinzugegeben. Erwärmen der
Mischung auf +60°C
unter Rühren,
bis das Casein sich löst
und eine Opallösung
erhalten wird. Zufügen
von 60 ml destilliertem Wasser und, wenn notwendig, von 1 bis 2
Tropfen Octylalkohol (Antischaummittel; ähnliche Produkte können verwendet
werden). Nach Abkühlen
auf Raumtemperatur Einstellen des pHs auf 7,5 mit 0,5 M Natriumhydroxid
und 1 M Milchsäure. Überführen der
Lösung
in einen Messkolben und Auffüllen
auf 100 ml mit destilliertem Wasser.
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Die Substratlösung ist für eine Woche verwendbar, wenn
sie in einem kalten Raum gelagert wird.
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2. 0,2 M Na2HPO4-Lösung
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Lösen
von 17,80 g Dinatrium-Hydrogenphosphatdihydrat in destilliertem
Wasser und Auffüllen
auf 500 ml mit destilliertem Wasser.
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3. 0,02 M NaCl-Lösung
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Lösen
von 1,168 g Natriumchlorid in destilliertem Wasser und Auffüllen auf
1.000 ml mit destilliertem Wasser.
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4. Präzipitationsreagenz (TCA)
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Lösen
von 18,80 g Trichloressigsäure
(CCl3COOH), 18,10 g wasserfreiem Natriumacetat (CH3COONa) und 18,80 g Essigsäure (CH3COOH) in destilliertem Wasser und Auffüllen auf
1.000 ml mit destilliertem Wasser.
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5. Phenolreagenz
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Mischen von einem Teil Folin-Ciocalteau-Phenolreagenz
mit einem Teil destilliertem Wasser kurz vor dem Assay.
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6. 0,55 M Na2CO3-Lösung
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Lösung
von 58,295 g Dinatriumcarbonat in destilliertem Wasser und Auffüllen auf
1.000 ml mit destilliertem Wasser.
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1. Enzymprobe
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Äquilibrieren
von 1 ml Enzymlösung
(in 0,02 M NaCl-Lösung)
bei +40°C
(für ca.
5 Minuten). Zufügen von
5 ml äquilibriertem
Caseinsubstrat, Rühren
und Inkubieren bei +40°C
für genau
30 Minuten. Zugeben von 5 ml Präzipitationsreagenz
und Rühren.
Inkubieren bei +40°C
für genau
30 Minuten und sofortiges Abfiltrieren mit Filterpapier (Whatman
1 oder Macherey Nagel 640 we).
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Pipettieren von 2 ml Filtrat, 5 ml
0,55 M Na2CO3-Lösung und
1 ml Phenolreagenz. Rühren und
Inkubieren bei +40°C
für 30
Minuten. Abkühlen
auf Raumtemperatur und Messen der Absorption bei 660 nm gegenüber destilliertem
Wasser.
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2. Enzymnullwert
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Äquilibrieren
von 1 ml Enzymlösung
(in 0,02 M NaCl-Lösung)
bei +40°C
(für ca.
5 Minuten). Zugeben von 5 ml Präzipitationsreagenz,
Rühren
und Inkubieren bei +40°C
für genau
30 Minuten. Zugabe von 5 ml Caseinsubstrat, Rühren und Inkubieren bei +40°C für genau
30 Minuten. Sofortiges Filtrieren mit Filterpapier (Whatman 1 oder
Macherey Nagel 640 we).
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Behandeln des Filtrats wie bei der
Enzymprobe.
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Die Differenz der Absorption zwischen
der Enzymprobe und dem Enzymnullwert sollte bei 0,2 bis 0,5 sein.
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3. Standardkurve
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Herstellen einer Tyrosin-Stocklösung durch
Einwiegen von 10 mg L-Tyrosin in einen Messkolben, Lösen in 0,02
M NaCl-Lösung und
Auffüllen
auf 100 ml mit 0,02 M NaCl-Lösung.
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Herstellung von Verdünnungen
der Tyrosin-Stocklösung
in 0,02 M NaCl-Lösung
wie folgt:
Pipettieren von 2 ml der
jeweiligen Tyrosinlösung,
5 ml 0,55 M Na
2CO
3-Lösung und
1 ml Phenolreagenz. Rühren
und Inkubieren bei +40°C
für 30
Minuten. Abkühlen
auf Raumtemperatur und Messen der Absorption bei 660 nm gegen destilliertes
Wasser.
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Auftragen der Tyrosinkonzentration
als Funktion der Absorption.
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Berechnung
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Die Proteaseaktivität der Probe
wird gemäß der folgenden
Gleichung berechnet:
worin:
A(X) = Absorption
der Enzymprobe
A(O) = Absorption des Enzymnullwerte
k
= die Steigung der Standardkurve
F = Reaktionverdünnungsfaktor
(=11)
Df = Verdünnungsfaktor
(ml/g)
t = Reaktionszeit (30 Minuten).
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Assayverfahren
für die
Xylanase-Aktivität
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Eine Einheit Xylanase-Aktivität ist die
Menge an Enzym, die 1 μM
reduzierenden Zucker (ausgedrückt als
Xyloseäquivalente)
von dem Substrat in einer Minute unter den beschriebenen Bedingungen
freisetzt.
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Reagenzien
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1. 1% (G/V) Xylansubstrat
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Zugeben von 10 ml 0,5 M Natriumhydroxid
zu 1,0 g Xylan (Fluka 95590). Mischen für 30 Minuten mit einem Magnetrührer. Zugeben
von 40 ml 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 5,3. Einstellen des pHs
auf 5,3 mit 1 M Essigsäure.
Auffüllen
auf 100 ml mit 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 5,3. Das Substrat
sollte bei Verwendung die ganze Zeit gemischt werden.
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2. 1 M Essigsäure
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Pipettieren von 5,7 ml Eisessig in
einen Messkolben und Auffüllen
auf 100 ml mit destilliertem Wasser.
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3. 0,05 M Natriumacetatpuffer,
pH 5,3
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- A. Lösen
von 4,1 g Natriumacetat in destilliertem Wasser und Auffüllen auf
1.000 ml mit destilliertem Wasser.
- B. Lösen
von 3,0 g Eisessig in destilliertem Wasser und Auffüllen auf
1.000 ml mit destilliertem Wasser.
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Einstellen des pHs der Lösung A auf
pH 5,3 mit Lösung
B.
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4. Dinitrosalicylsäure(DNS)reagenz
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Suspendieren von 20,0 g 3,5-Dinitrosalicylsäure in ca.
800 ml destilliertem Wasser. Graduelles Zugeben von 300 ml Natriumhydroxidlösung (32,0
g NaOH in 300 ml destilliertem Wasser) unter kontrolliertem Rühren. Erwärmen der
Suspension in einem Wasserbad (die Temperatur darf nicht +48°C übersteigen)
unter Rühren,
bis die Lösung
klar wird. Graduelles Zugeben von 600 g Kaliumnatriumtartrat. Erwärmen der
Lösung
(die Temperatur darf nicht +48°C übersteigen)
wenn notwendig, bis die Lösung
klar ist.
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Auffüllen auf 2.000 ml mit destilliertem
Wasser und Filtrieren durch einen grob gesinterten Glasfilter.
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Aufbewahren in einer dunklen Flasche
bei Raumtemperatur. Das Reagenz ist für maximal 6 Monate stabil.
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Verfahren
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1. Enzymprobe
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1 ml Enzymlösung (in 0,05 M Natriumacetatpuffer,
pH 5,3) wird bei +50°C äquilibriert.
1 ml Xylansubstrat werden zugegeben, gerührt und bei +50°C für genau
30 Minuten inkubiert. 3 ml DNS-reagenz werden zugegeben, gerührt und
die Reaktionsmischung wird für
genau 5 Minuten gekocht. Abkühlen der
Reaktionsmischung in einem kalten Wasserbad auf Raumtemperatur und
Messen der Absorption bei 540 nm gegen destilliertes Wasser.
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2. Enzymnullwert
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Inkubieren von 1 ml Xylansubstrat
bei +50°C
für 30
Minuten. Zugabe von 3 ml DNS-Lösung
und Rühren.
Zugabe von 1 ml Enzymverdünnung
(in 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 5,3) und Rühren. Kochen der Mischung für exakt
5 Minuten. Abkühlen
der Reaktionsmischung in einem kalten Wasserbad auf Raumtemperatur
und Messen der Absorption bei 540 nm gegen destilliertes Wasser.
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Die Differenz der Absorption zwischen
der Enzymprobe und dem Enzymnullwert sollte bei 0,3 bis 0,5 liegen.
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3. Standardkurve
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Herstellen von Standardlösungen aus
wasserfreier Xylose in 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 5,3. Die Xylosekonzentration
der Standards sollte bei 0,05 bis 0,5 mg/ml liegen. Pipettieren
von 1 ml Standardlösung, 1
ml Xylansubstrat und 3 ml DNS-Reagenz in ein Teströhrchen.
Rühren
und für
genau 5 Minuten Kochen. Abkühlen
in einem kalten Wasserbad auf Raumtemperatur und Messen der Absorption
bei 540 nm gegen den Standardnullwert. In dem Standardnullwert wird
die Xyloselösung
durch 1 ml 0,05 M Natriumacetatpuffer, pH 5,3, ersetzt. Ansonsten
wird der Standardnullwert genauso wie der Xylosestandard behandelt.
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Auftragen der Xylosekonzentration
als Funktion der Absorption. Eine neue Standardkurve wird für jedes
neue DNS-Reagenz hergestellt.
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Berechnung
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Die Xylanase-Aktivität der Probe
wird gemäß der folgenden
Gleichung berechnet:
worin:
A(X) = Absorption
der Enzymprobe
A(O) = Absorption des Enzymnullwerts
k
= Steigung der Standardkurve
Co = Schnittpunkt der Xylosestandardkurve?
1000
= Faktor, mM → μM
Df
= Verdünnungsfaktor
(ml/g)
Mw
xyl = Molekulargewicht Xylose
(150,13 mg/mM)
t = Reaktionszeit (30 Minuten).
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Assayverfahren
für α-Amylase-Aktivität
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Eine Einheit α-Amylase-Aktivität katalysiert
ein μl der
Hydrolyse von glycosidischen Verbindungen in einer Minute unter
den beschriebenen Bedingungen.
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Reagenz
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1. Substrat
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Als Substrat wird eine Phadebas Amylase-Testtablette
zur in vitro diagnostischen Verwendung (Pharmacia Diagnostics) benutzt.
Die Tabletten werden in destilliertem Wasser aus wasserunlöslichem
blauem Stärkepolymer,
Rinderserumalbumin und Puffer hergestellt.
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2. Reagenzlösung
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Verdünnen von 9,0 g Natriumchlorid,
2,0 g Rinderserumalbumin und 2,2 g Calciumchlorid in destilliertem
Wasser in einem Messkolben und Auffüllen auf 100 ml mit destilliertem
Wasser.
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3. 0,5 M NaOH-Lösung
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Lösen
von 20,0 g Natriumhydroxid in destilliertem Wasser in einem Messkolben
und Auffüllen
mit destilliertem Wasser auf 1.000 ml.
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4. Filterpapier
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Macherey Nagel 640 mit oder ähnliches.
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Verfahren
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1. Enzymprobe
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Pipettieren von 200 μl geeigneter
Enzymverdünnung
in Reagenzlösung
und 4,0 ml Reagenzlösung
in ein Teströhrchen. Äquilibrieren
bei +37°C
für 5 Minuten.
Zugabe der Substrattablette mit der Pinzette und gutes Mischen für 10 Sekunden.
Inkubieren bei +37°C
für genau
15 Minuten. Die Reaktionszeit startet mit der Zugabe der Tablette.
Zugabe von 1,0 ml der 0,5 M NaOH-Lösung und gutes Rühren. Filtrieren
oder Zentrifugieren bei 3.500 Upm für 10 Minuten und Messen der
Absorption gegenüber
Reagenznullwert bei 620 nm.
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Die Absorption der Enzymprobe sollte
0,3 bis 0,5 sein.
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2. Reagenznullwert
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Äquilibrieren
von 4,2 ml Reagenzlösung
bei +37°C
5 Minuten. Zugabe der Substrattablette mit Pinzetten und gutes Rühren für 10 Sekunden.
Inkubieren bei +37°C
für genau
15 Minuten. Zufügen
von 1,0 ml 0,5 M NaOH-Lösung,
gutes Rühren
und Filtrieren oder Zentrifugieren bei 3.500 Upm für 10 Minuten.
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Berechnung
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Die Absorption der Probe ist proportional
zu der α-Amylase-Aktivität. Die α-Amylase-Aktivität der Enzymlösung wird
ausgelesen aus der Tabelle, die dem Tablettenkit beigefügt ist.
Für jedes
Tablettenbatch wird eine kalibrierte Tabelle geliefert.
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Die α-Amylase-Aktivität der Probe
wird berechnet wie folgt:
wobei:
Act
= α-Amylase-Aktivitätswert (ausgedrückt in U/l)
der Enzymverdünnung,
wie sie aus der Phadebas Amylase Testtabelle gelesen wird.
Df
= Verdünnungsfaktor
(ml/g)
1000 = Faktor, um 1 in ml umzuwandeln.
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Ein erstes Ziel der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung einer Kombination von Verbindungen zum
Einfügen
zu Tiernahrungsmittel, um die Rate der Gewichtszunahme bei gesunden
Tieren zu verbessern. Ein zweites Ziel der vorliegenden Erfindung
ist die Verwendung einer solchen Kombination zur Herstellung eines
Mittels zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Kokzidiose oder von
Bakterieninfektionen, wie nekrotische Enteritis, bereitzustellen.
Es ist ein drittes Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Kombination
von Zusatzstoffen für
ein Tiernahrungsmittel bereitzustellen, um die Wirkung einer Eimeria-Provokation,
die die Gewichtzunahmerate bei einem Tier erniedrigt, entgegenzuwirken.
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Entsprechend betrifft ein erster
Aspekt der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung der Verwendung einer
Protease und eines inneren Salzes einer quaternären Aminocarbonsäure zur
Herstellung eines Mittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung von
Kokzidiose.
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Gemäß einem zweiten Aspekt stellt
die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Protease und eines
inneren Salzes einer quaternären
Aminocarbonsäure
zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung einer Eimeria-Infektion
beim Tier bereit.
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Gemäß einem dritten Aspekt stellt
die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Protease und eines
inneren Salzes einer quaternären
Aminocarbonsäure
zur Herstellung eines Nahrungszusatzmittels zur Förderung
der Gewichtszunahme bei einem Tier, das mit Eimeria infiziert ist,
bereit.
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Gemäß einem vierten Aspekt betrifft
die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Protease und eines
inneren Salzes einer quaternären
Aminocarbonsäure
zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer bakteriellen Infektion,
hervorgerufen durch Salmonellen, Camphylobacter, E. coli oder Listerien.
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Gemäß einem fünften Aspekt stellt die vorliegende
Erfindung die Verwendung einer Protease und eines inneren Salzes
einer quaternären
Aminocarbonsäure
zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung oder Prophylaxe von
nekrotischer Enteritis, die unter anderem durch Clostridium perfringens-Infektion
hervorgerufen wird, bereit.
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Gemäß einem sechsten Aspekt stellt
die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Zusatzstoffes für eine Tiernahrung
bereit, umfassend eine Protease, eine Xylanase und ein inneres Salz
einer quaternären Aminocarbonsäure bereit.
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In jedem der obigen ersten bis fünften Aspekte
ist es besonders bevorzugt, dass das Mittel oder Zusatzstoff weiterhin
Xylanase umfasst.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 zeigt
eine graphische Darstellung der Wirkungen eines Zufügens von
Betain, Protease bzw. einer Kombination von Betain und Protease
zur Nahrung bei gesunden Hähnchen.
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2 zeigt
eine graphische Darstellung der Wirkungen des Zufügens von
Betain, Protease bzw. einer Kombination von Betain und Protease
zu der Nahrung von Hähnchen,
die mit Eimeria maxima provoziert wurden.
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3 ist
ein Gelchromatogramm, das das Vorhandensein von C. perfringens Toxingen
im Ileum von Hähnchen,
die mit in verschiedener Form versetzter Nahrung gefüttert wurden
und die mit verschiedenen Pathogenen provoziert wurden, zeigt.
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In der folgenden Beschreibung wird
Bezug genommen auf verschiedene Verfahren, die den allgemeinen Stand
der Technik für
den Fachmann der Veterinär-Immunologie
und Immunpathologie, für
Vakzine, der Tierpharmazie und Tierhaltung darstellen. Publikationen
und andere Materialien, die solche Verfahren darstellen, schließen ein:
Allgemeine
Prinzipien der Veterinärwissenschaft
ist z. B. aufgeführt
in The Merck Veterinary Manual, 6. Auflage,
herausgegeben von Fraser et al., 1986; the Food and Drug Administration's FDA 1994 Feed Additive
Compendium, U.S. Food and Drug Administration, 1994; Trends in Veterinary
Research and Development, Teil 6, Anti-coccidials, herausgegeben
von Lloyd-Evans, L. P. M., PJB Publications Ltd., 1991; Diseases
of Poultry, herausgegeben von B. W. Calnek, Iowa State University
Press, Ames, Towa, 1991.
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Allgemeine Prinzipien der Tierhaltung
sind dargestellt in z. B. H. Partick et al., Poultry: Feeds & Nutrition, 2.
Auflage, AVI Publishing Co. Inc., Westport, Conn. (1980).
-
Allgemeine Prinzipien der pharmazeutischen
Wissenschaften sind z. B. dargestellt in Remington's Pharmaceutical
Sciences (18. Auflage, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing, Easton,
Pa. 1990).
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Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende
Erfindung die Verwendung einer Protease und eines inneren Salzes
einer quaternären
Aminocarbonsäure
zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung
von Kokzidiose, bakterieller Infektion oder nekrotischer Enteritis,
die unter anderem durch Clostridium perfringens-Infektion hervorgerufen
sein kann, bereit. Die Vorteile der Verwendung von Nahrung, die
eine Kombination von Betain und einer Protease enthalten ist bei
Zuchttieren die, dass die Menge an antimikrobiellen Arzneimitteln,
die bisher routinemäßig zu der
Nahrung zugefügt
wurde, reduziert werden kann oder in einigen Fällen sogar ganz weggelassen
werden kann. In Ländern,
wo solche Arzneimittel verboten sind, stellt dies einen neuen Ansatz
zur Kontrolle von bakteriellen Erkrankungen dar.
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Wenn die Antibiotika aus der Tiernahrung
weggelassen werden, gibt es einige weitere mögliche Vorteile. Es war bisher
notwendig, Antibiotika aus der Tiernahrung für eine bestimmte Zeit vor der
Schlachtung herauszulassen. Dies stellte sicher, dass das Fleisch
relativ frei von solchen Arzneimitteln war und somit für den humanen
Verbrauch zur Verfügung
stand. Wenn Antibiotika insgesamt für Tiernahrung weggelassen werden
können,
wie es mit der vorliegenden Erfindung erzielt werden kann, können Tiere
in irgendeinem Alter geschlachtet werden, im Gegensatz zu vorher,
wo eine bestimmte Zeit ohne Antibiotika notwendig war. Dies erlaubt
dem Farmer eine verbesserte Flexibilität und vermeidet das Risiko,
dass die Tiere kurz vor der Schlachtung infiziert werden. Weiterhin
kann garantiert werden, dass das Fleisch und die Eier frei von Antibiotika
sind. Solches Fleisch und Eier haben auf dem Markt einen Vorteil
im Vergleich zu Produkten, die nicht mit einer solchen Garantie
ausgestattet werden können.
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Die vorliegende Erfindung hat auch
in Bezug auf die menschliche Gesundheit Vorteile. Dessen Verwendung
reduziert den Selektionsdruck für
antibiotikaresistente Bakterienstämme, indem es ermöglicht,
dass Antibiotika aus der Tiernahrung weggelassen werden kann. Entsprechend
sind mehr Antibiotika zugängliche Stämme im Darm
des Tiers vorhanden, dies stellt einen wahrscheinlicheren tödlichen
Effekt sicher, wenn die Antibiotika unter äquivalenten Bedingungen beim
Menschen verwendet werden.
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Der Nahrungszusatzstoff gemäß der vorliegenden
Erfindung kann verschiedenartig hergestellt werden. Zum Beispiel
kann er hergestellt werden durch einfaches Vermischen der verschiedenen
entsprechenden Verbindungen, um den Zusatzstoff zu produzieren.
Dieser kann dann entweder direkt mit der Nahrung vermischt werden
oder kann konventioneller auf ein Trägermaterial auf Getreidebasis,
wie gemahlener Weizen, Mais oder Sojamehl imprägniert werden. Solch ein imprägnierter
Träger
stellt ebenfalls einen Nahrungszusatzstoff gemäß dem vierten Aspekt der vorliegenden
Erfindung dar.
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Der Nahrungszusatzstoff kann direkt
mit der Tiernahrung vermischt werden oder kann alternativ mit ein
oder mehreren anderen Nahrungszusatzstoffen, wie Vitamin-Nahrungszusatzstoff,
einem Mineral-Nahrungszusatzstoff oder einem Aminosäure-Nahrungszusatzstoff
vermischt werden. Der erhaltene Nahrungszusatzstoff, umfassend einige
verschiedene Komponentenarten, kann dann in einer entsprechenden
Menge mit der Nahrung vermischt werden. Es ist ebenfalls möglich, den
Nahrungszusatzstoff in die Ernährung
der Tiere durch zufügen
zu einer zweiten (und verschiedenen) Nahrung oder ins Trinkwasser,
zu dem das Tier ebenfalls Zugang hat, einzubringen. Entsprechend
ist es nicht essentiell, dass der erfindungsgemäß bereitgestellte Zusatzstoff
in die Hauptnahrung auf Getreidebasis des Tieres eingebaut wird, obwohl
ein solcher Einbau einen besonders bevorzugten Aspekt der vorliegenden
Erfindung darstellt.
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Der erfindungsgemäß bereitgestellte Nahrungsmittelzusatzstoff
kann als Vormix zusammen mit anderen Enzymen, die ebenfalls wünschenswert
hinzugegeben werden können,
formuliert sein. Der Vormix kann zu den Ausgangsmaterialien vor
der Nahrungsmittelherstellung zugefügt werden, während der
Herstellung oder als letztem Schritt, nachdem das Nahrungsmittel
ansonsten verwendungsbereit ist. Es ist ebenfalls möglich, die
Kombination des inneren Salzes und der Protease direkt zu dem Nahrungsmaterial,
das als Pellets oder als Gemisch vorgeformt ist, hinzuzugeben.
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Wenn der erfindungsgemäße Zusatzstoff
zu einem Tiernahrungsmittel zugegeben ist, sollte das Nahrungsmittel
mindestens 25 Gew.-% Getreide und bevorzugt mindestens 35 Gew.-%
Getreide enthalten. Das Getreide kann eines oder mehrere aus Weizen,
Mais, Reis, Hafer, Gerste, Tritical, Roggen und Sorghum. Es ist
insbesondere bevorzugt, dass das Getreide Mais oder Weizen ist.
Wenn das Getreide Mais ist, dann umfasst der Zusatzstoff oder das
Mittel bevorzugt weiterhin eine α-Amylase.
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Obwohl die Getreidekomponente bei
einer Nahrung auf Getreidebasis eine Proteinquelle darstellt, ist es
normalerweise notwendig, weitere Quellen für ergänzendes Protein bei der Ernährung bereitzustellen,
wie solches, das von Fischmehl, Fleischmehl oder Gemüse stammt.
Diese Quellen für
weiteres Protein können
bis zu 50 Gew.-% der Tiernahrung ausmachen. Quellen für pflanzliches
Protein schließen
mindestens eines ein von Vollfettsojabohne, Rapssamen, Canola, Sojabohnenmehl,
Rapssamenmehl und Canolamehl.
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Ein inneres Salz einer quaternären Aminocarbonsäure hat
die allgemeine Formel R1R2R3N+-L-COO–, wobei
die Substituenten R1, R2 und
R3 unabhängig
voneinander irgendeinen organischen Rest, bevorzugt Alkylgruppen,
bevorzugter Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt,
und am meisten bevorzugt sind sie alle Methyl; die Verbindungsgruppe
-L- stellt eine organische Verbindungsgruppe, wie Alkoxyalkyl oder
Alkylen dar, bevorzugt C1-C6-Alkylen
und am meisten bevorzugt Methylen. Beispiele des inneren Salzes
einer quaternären
Aminocarbonsäure
schließen
ein Betain (Me3N+CH2COO–), Me3N+-CHMeCOO–,
Et3N+CH2COO–, Me2EtN+CH2COO–,
Me3N+CH2CH2COO–, Me3N+CH2OCH2COO– und
Me3N+C(CHMe2)HCOO–. Das innere Salz ist
bevorzugt Betain, dieses ist kommerziell erhältlich von Finnfeeds unter
dem Handelsnamen Betafin®.
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Das innere Salz ist bevorzugt in
der Nahrung in einer Rate von 0,01 bis 20 g/kg Nahrung enthalten, bevorzugter
0,1 bis 10 g/kg und am meisten bevorzugt 0,5 bis 2 g/kg.
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Die Protease kann in irgendeiner
Proteaseform verwendet werden, die die Verwendung eines Subtilisins,
das von Bazillus subtilis stammt, mit einer Aktivität von nicht
weniger als 40.000 U/g ist allerdings bevorzugt. Solche Subtilisine
sind z. B, beschrieben in
US
4,760,025 A . Die Protease ist in der Nahrung in einer Menge
enthalten, dass die Nahrung eine Proteaseaktivität hat, die 100 U bis 100.000
U/kg Nahrung entspricht, bevorzugt 500 U bis 10.000 U/kg Nahrung.
Geeignete Proteasen schließen
ein, sind aber nicht auf sie begrenzt, die folgenden kommerziell
erhältlichen
Proteasen: Novo NEUTRASS (TM), (kommerziell erhältlich von Novo Nordisk); PURAFECT
(TM) (kommerziell erhältlich
von Genencor International, Inc); SAVINASE (TM) (kommerziell erhältlich von
Novo Nordisk); MAXACAL (TM) (kommerziell erhältlich von Gist-Brocades);
DURAZYM (TM) (kommerziell erhältlich
von Novo Nordisk) und MAXAPEM (TM) (kommerziell erhältlich von
Gist Brocades).
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Mittel oder der Zusatzstoff weiterhin eine
Xylanase. Xylanasen können
von Pilzquellen, wie Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Neocallimastix oder
Thermomyces stammen. Es ist bevorzugt, dass die Xylanase eine niedrig
pI-Xylanase und/oder eine hoch pI-Xylanase, erhältlich von Trichoderma longibrachiatum,
ist, wie im Beispiel 22 der WO 92/06209 beschrieben. Alternativ
kann die Xylanase erhalten werden aus einem Bakterium, wie Bazillus,
Streptomyces, Microtetraspora, Clostridium oder Ruminococcus. Es
ist ebenfalls möglich,
dass die Xylanase erhalten werden kann von einem Wirt, der einer
genetischen Veränderung
unterworfen wurde, wie das Einfügen
eines entsprechenden Gens in einen bakteriellen oder Pilzwirtsstamm.
Die bevorzugte Aktivität
der Xylanase sollte bei ca. 3.000 U/g liegen. Die Xylanase von Trichoderma
longibrachiatum mit einer minimalen Aktivität von 3.000 U/g ist kommerziell
erhältlich
von Finnfeeds International unter dem Handelsnamen AVIZYME®. Die Xylanase
ist zu der Nahrung in einer solchen Menge zugegeben, dass die Nahrung
eine Xylanase-Aktivität
aufweist, die 100 U bis 100.000 U/kg Nahrung entspricht, bevorzugt
eine Aktivität
von 200 U bis 1.000 U/kg Nahrung.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung kann ebenfalls α-Amylase
in dem Mittel oder Zusatzstoff vorhanden sein, insbesondere dann,
wenn das Mittel oder der Zusatzstoff zu einer Mais enthaltenden
Nahrung zugegeben wird. Obwohl es im Umfang der Erfindung ist, irgendeine
Form an α-Amylase zu
verwenden ist es bevorzugt, α-Amylase
von Bazilus subtilis mit einer minimalen Aktivität von 4.000 U/g zu verwenden. α-Amylase
von Bazillus subtilis mit einer minimalen Aktivität von 4.000
U/g ist kommerziell erhältlich
von Finnfeeds International unter dem Handelsnamen AVIZYME®. Die in
die Nahrung zugefügte α-Amylase
ist in der Nahrung in einer solchen Menge vorhanden, dass sie eine α-Amylase-Aktivität entsprechend
10 bis 100.000 U/kg Nahrung aufzeigt, bevorzugt eine Aktivität von 100
U bis 4.000 U/kg Nahrung.
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Das innere Salz, die Protease und
gegebenenfalls die Xylanase und/oder α-Amylase können vor Verwendung miteinander vermischt
werden, sie können
aber auch separat zu der Nahrung zugegeben werden. Eine Kombination
von Protease, Xylanase und α-Amylase
ist kommerziell erhältlich
unter dem Handelsnamen AVIZYME® 1510
von Finnfeeds International. Eine weitere Kombination dieser Enzyme
ist kommerziell erhältlich
als Trockenvormischung unter dem Handelsnamen AVIZYME® 1500. Es
wird angemerkt, dass es im allgemeinen nicht empfehlenswert ist,
eine Protease mit anderen Proteinen über einen längeren Zeitraum zu lagern,
da diese dazu neigt, die anderen Proteine abzubauen.
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Der erfindungsgemäße Nahrungszusatzstoff kann
für einen
weiten Bereich an Tieren verwendet werden, die Verwendung der Erfindung
ist aber insbesondere bevorzugt bei Haustieren und Tieren in Viehbeständen. Tiere,
die insbesondere von der Erfindung profitieren, schließen ein:
Geflügel
(wie Hühner,
Truthähne,
Enten und Gänse),
Wiederkäuer
(wie Kühe,
Pferde und Schafe), Schweine (Ferkel), Nagetiere (wie Kaninchen) und
Fische. Die Erfindung ist insbesondere vorteilhaft in Bezug auf
Hähnchen.
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Erfindungsgemäß können wirksame Mengen an erfindungsgemäßen Zusatzstoff
verabreicht werden um die negativen Wirkungen von irgendeinem Kokzidiose
induzierenden Pathogen und insbesondere irgendeiner Eimeria Art
einschließlich
z. B. den Eimeriaarten necatrix, galloparvonis, meleagrimitis, innocua,
meleagridis, subrotunda, dispersa, truncata, acervulina, brunetti,
maxima, mitis, praecos und tenella zu lindern. Insbesondere fördert der
Zusatzstoff die Gewichtzunahme beim Eimeria infizierten Tier.
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Erfindungsgemäß können wirksame Mengen des erfindungsgemäßen Zusatzstoffes
verabreicht werden, um die nachteiligen Wirkungen bei Geflügel aufgrund
der Infektion durch Eimeria Arten, insbesondere den Eimeria Arten
E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E.
praecos und E. tenella zu lindern.
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Erfindungsgemäß können wirksame Mengen des erfindungsgemäßen Zusatzstoffes
verabreicht werden um die negative Wirkung, die bei Rindern induziert
wird, wenn sie mit einem Mitglied der Eimeriaa Aten infiziert werden,
insbesondere den Eimeria zernii, bovis (smithii), ellipsoidlis,
zu lindern.
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Erfindungsgemäß können wirksame Mengen des erfindungsgemäßen Zusatzstoffes
verabreicht werden, um die negativen Wirkungen, die in Schafen induziert
werden, wenn sie mit einem Mitglied der Eimeria Arten infiziert
werden, insbesondere den Eimeriaarten arloingi A (ovina), weybridgensis
(arlongis B), crandallis, ahsata, ovinoidalis, gilruthi, zu lindern.
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Erfindungsgemäß können wirksame Mengen des erfindungsgemäßen Zusatzstoffes
verabreicht werden, um die negativen Wirkungen induziert in Ziegen,
die mit einem Mitglied der Eimeria Arten infiziert sind, einschließlich z.
B. Immunisierung mit den Eimeria Arten arloingi, faurei, caproina,
ninakohlyakimovae, christenseni, zu lindern.
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Erfindungsgemäß können wirksame Mengen des erfindungsgemäßen Zusatzstoffes
verabreicht werden, um negative Effekte, die in Schweinen, die mit
einem Mitglied der Eimeria Arten infiziert sind, einschließlich z.
B. der Induzierung mit den Eimeria Arten debliecki, scabra, penninuta,
zu lindern einschließlich
den negativen Effekten, die durch ein Mitglied der Isospora Arten,
z. B. Isospora suis, induziert werden.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
können
wirksame Mengen des erfindungsgemäßen Zusatzstoffes verabreicht
werden, um die negativen Effekte einer Infektion mit Bakterien,
wie Clostridium, Salmonella, Campylobacter, E. coli, Listeria und
insbesondere Clostridium perfringens, Salmonella enteritidis und
Campylobacter jejuni bei Geflügel
zu lindern. Da Clostridium perfringens eine der Hauptursachen für nektrotische
Enteritis ist, kann der Nahrungszusatzstoff entsprechend zur Herstellung
eines Mittels zur Behandlung und/oder Vorbeugung von nekrotischer
Enteritis verwendet werden.
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Weitere pharmazeutische Verfahren
können
angewendet werden, um die Wirkungsdauer zu regulieren. Die regulierte
Zufuhr kann erzielt werden durch Auswahl entsprechender Makromoleküle wie Polyester, Polyaminosäuren, Polypyrrolidon,
Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder
Protaminsulfat und Kombinationen dieser gemäß allgemein bekannter Verfahren,
um die Freisetzung zu regulieren. Die Wirkungsdauer des inneres
Salzes und der Protease kann reguliert werden durch Einfügen dieser
Mittel in Partikel von polymeren Materialien, wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogelen,
Poly(milchsäure)
oder Ethylenvinylacetat-Copolymer.
Alternativ können
das innere Salz in Mikrokapseln formuliert sein. Verschiedene Materialien
und Methoden zur Herstellung und Verwendung von Mikrokapseln sind
offenbart in Remington's
Pharmaceutical Sciences, (16. Auflage, A. Oslow, ed., Mack, Easton,
PA. 1980).
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Zusätzlich zu der Ausführungsform
der Erfindung wobei das innere Salz und die Protease, die den Tieren
verabreicht werden sollen, in Form einer Tiernahrung vorliegt, umfasst
die vorliegende Erfindung weiterhin die Verwendung von anderen Zusammensetzungen,
enthaltend das innere Salz und die Protease, die co-verabreicht
werden können
in irgendeiner gewünschten
Zusammensetzung, einschließlich
irgendwelchen Vakzinen, Nahrungsergänzungsmitteln oder Medikamenten.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Das folgende Beispiel zeigt die Wirkungen
wenn ein erfindungsgemäßer Nahrungszusatzstoff
in die Nahrung bei gesunden Tieren enthalten ist, genauso wie die
Herstellung eines Mittels zur Behandlung einer Eimeria-Infektion.
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(a) Allgemeines Verfahren
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96 weibliche Masthähnchen (Ross
208) wurden in vier getrennte Gruppen á 24 Tiere geteilt. Die Futterbehandlung
wurde am Tag 0 gestartet und das Geflügel wurden einer Eimeria maxima
Provokation am Tag 14 unterzogen. Diese Provokation wurde durchgeführt durch
Impfen von E. acervulina und E. maxima Oozysten in den Kropf der
Hühner
in ein 2 ml Volumen Leitungswasser.
Die Dosis pro Vogel war 100.000 Oozysten E. acervulina und 50.000
Oozysten E. maxima. Diese zwei Eimeria Arten sind räumlich voneinander
im Darm getrennt: E. acervulina infiziert den Zwölffingerdarm und den vorderen
Dünndarm,
während
E. Maxima den Mittel-Dünndarmbereich
bevorzugt: vom distalen Dünndarm
bis zum mittleren Ileum. Das Geflügel wurden in den Käfigen in
den Tagen 0 bis 14 gehalten und in offenen Laufställen mit
einem Streu aus Holzspänen
zwischen den Tagen 14 bis 21.
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Die den Vögeln bereitgestellte Nahrung
war auf Korn-Soja-Basis
ohne Coccidiostate. Die Nahrung war in kleine bröckelige Pellets kaltgepresst
und hatte einen Durchmesser von ca. 5 mm.
Startnahrung wurde von den Tagen 0 bis 14 verwendet und Endnahrung
an den Tagen 14 bis 21. Die Zusatzstoffe wurden auf die Nahrungpellets
wenn möglich
mit Hilfe einer wässrigen
Lösung
aus Betain (mit einer Dosis von 1 g/kg
Nahrung) und einer wässrigen
Lösung
von AVIZYME® 1510,
das ca. 300 U/g Xylanase, 4.000 U/g Protease und 400 U/g α-Amylase
umfasst, erhältlich
von Finnfeeds Internation, mit einer Dosis von 1 g/kg
Nahrung aufgesprüht.
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Die verwendeten Nahrungszusammensetzungen
waren wie folgt:
Kornsojanahrung
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Die Nährstoffzusammensetzung dieser
Nahrung war wie folgt:
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(b) Ergebnisse
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Das Gewicht der Tiere wurde kurz
vor der Eimeria maxima Provokation nach 14 Tagen gemessen. Tabelle
1 zeigt, dass die Verwendung einer Kombination von Betain und Protease
zu einer erhöhten
Gewichtszunahme im Vergleich zu der individuellen Zugabe dieser
Verbindungen zur Nahrung führte.
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Die Ergebnisse der Tabelle 1 sind
graphisch in der 1 dargestellt.
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Das Gewicht der Vögel wurde wieder am Tag 21
aufgezeichnet, d. h. nach einem Zeitraum von 7 Tagen nach Eimeria
Provokation. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Eine
verbesserte Gewichtszunahme für
die Gruppe D wurde im Vergleich zu den Gruppen B und C, bei denen
die Nahrung entweder mit Betain oder Protease versetzt wurde, beobachtet.
Wieder führte
eine Kombination dieser beiden Komponenten zu einer Verbesserung,
die größer ist,
als die Summe der Wirkung der einzelnen Komponenten.
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Die Ergebnisse der Tabelle 2 sind
graphisch in der 2 dargestellt.
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Beispiel 2
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Die Aktivität einer Kombination aus Betain
und Protease wie in Beispiel 1 verwendet, auf Clostridium perfringens
Infektion wurde in diesem Beispiel untersucht. Die verwendete Nahrung
war die Endnahrung wie in Beispiel 1 beschrieben.
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(a) Allgemeines Verfahren
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12 Hühner, die jeweils 21 Tage alt
waren, wurden in 3 getrennte Gruppen, E, F und G ά 4 Tiere
geteilt. Die Gruppe E wurde einer Provokation mit Eimeria maxima
ausgesetzt, die Gruppe F einer Provokation mit Clostridium perfringens
und die Gruppe G einer gleichzeitigen Doppelprovokation mit Eimeria
und Clostridium perfringens. Das C. perfringens α-Toxin Gen wurde aus der gesamtmikrobiellen
DNA wie folgt nachgewiesen: die gesamte mikrobielle DNA des Zökums wurde
einer PCR mit Primern, die entsprechend der bekannten Nukleotidsequenz
des C. perfringens α-Toxin
Gens entwickelt wurden, unterworfen. Die Sequenz der α-Toxinprimer
und die Bedingungen zur Durchführung
der PCR-Reaktion sind beschrieben von Songer und de Meer in Am.
J. Vet. Res 1997 Juli; 58(7), Seiten 702-705.
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(b) Ergebnisse
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Die intensive Bande in Spur 3 des
in 3 gezeigten Gels
zeigt das Vorhandensein des α-Toxin
Gens von endogenem C. perfringens in dem Tier an. Die Abwesenheit
einer solchen Bande in den Spuren 2 und 4 zeigt,
dass die Eimeria-Provokation
eine essentielle Vorbedingung zum Auftreten einer C. perfringens-Infektion war.
Ohne an die Theorie gebunden zu sein wird angenommen, dass die Eimeria-Provokation
das normale Niveau an Protease im Darm reduziert, dies verringert
dann die Nährstoffaufnahme
in den oberen Bereichen des Darms und führt zu erhöhtem Proteinniveau (und somit
verbesserten Wachstumsbedingungen für C. perfringens) im Ileum.
Ein weiterer Aspekt, der signifikant sein kann, ist die Wirkung
der Eimeria-Provokation auf das Immunsystem des Wirtstieres. Es
ist wahrscheinlich, dass die Immunantwort auf eine C. perfringens-Provokation
geschwächt
ist, wenn das Immunsystem bereits mit einer Eimeria-Provokation
beschäftigt
ist.
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Ein Vergleich der Spuren 6 und 7 in 3 zeigt, dass die Bande,
die das C. perfringens α-Toxin
Gen anzeigt, nur bei der Behandlung mit Protease alleine (Spur 6),
aber nicht bei der kombinierten Verwendung von Betain und Protease
(Spur 7) beobachtet werden kann. Es ist weiterhin allgemeines
Wissen, dass Betain selbst nicht gegenüber einer C. perfringens-Provokation wirksam
ist. Somit kann geschlossen werden, dass die Kombination von Betain
und Protease gegen eine Infektion mit C. perfringens wirksam ist,
während
die Verwendung von entweder Protease oder Betain alleine nicht zu
dem Ergebnis führt,
dass die Clostridium-Infektion wirksam behandelt werden kann.