TW581663B

TW581663B - Feed compositions comprising protease and betaine for use in treatment or prophylaxis of coccidiosis, bacterial infections and necrotic enteritis in poultry

Info

Publication number: TW581663B
Application number: TW088123131A
Authority: TW
Inventors: Juha Heikki Antero Apajalahti; Michael Richard Bedford
Original assignee: Finnfeeds Int Ltd
Priority date: 1999-12-09
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2004-04-01
Also published as: EP1237569A1; KR20020070313A; CA2393464A1; BRPI0016280B1; AU2363901A; US20060134091A1; AU776287B2; JP4786103B2; GB9929152D0; MXPA02005577A; US20030059498A1; CA2393464C; PL356152A1; GB2358135A; JP2003516133A; KR100730604B1; US7014863B2; DE60004879D1; JP2011041576A; ATE247977T1

Description

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五、發明說明（1 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明係關於動物飼料的添加物，且特別是改善以合併該添加物之飼料來餵食之動物的增重比率的這類添加物。此外，更有關於用來治療及/或預防球蟲症及/或細菌感染的這類添加物，包括結果導致壞死性腸炎的那些。局了產生可供全世界之人類消耗的食物，飼養許多不同種類的動物是很重要的。而在飼養動物時，牠們可能與各種引起感染的細菌和寄生蟲接觸。像是艾美球蟲屬 (Eimena)、弧形菌屬（Campyl〇bacter)梭菌屬⑹㈣以以⑷ 、大腸桿菌（E_ coli)和李氏菌屬（Listeria)。在密集飼養的農場家畜中，球蟲症是最常見的病因，特別是在家禽。球蟲症由原蟲引起，一種單細胞的寄生蟲，屬於頂複動物亞門（Apicomplexa)。許多在家畜中引起疾病的物種，屬於艾美球蟲屬。該寄生蟲在腸道上皮中繁殖。在雞中’已經確忍出七種艾美球蟲，認爲其中五種是有病原性的。這些是堆型艾美球蟲（E acervulina)、百型艾美球蟲（E· maxima)、壞死艾美球蟲（e. necratrix)、禽盲腸型球蟲（E. tenella)和褐色艾美球蟲（E. brunetti)。球蟲是無所不在的生物，且通常是在雞群出現之處所特有的。疾病的爆發可能是多變的，從嚴重到非常溫和的感染。可能是許多寄生性的原蟲，艾美球蟲的生活史相對上是較複雜的。在雞的腸道中出現有性和無性繁殖。k該寄生蟲的繁殖和發育的過程中，宿主的組織被破壞，導致在球蟲症爆發時觀察到的各種臨床表現。產生卵囊並進_步發育，排泄至宿主體外，此時它們可經歷進一步的發育並 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1663

五、發明說明（2 感染他的難隻。卵囊畫余 &印曩事實上可在宿主體外存活一段長時、九的―匕們犯夠感木其他的鳥類，甚至是在移出最初最感 =後。它們亦可在鳥群之間，藉著其他因子，包括人m &蟲1齒類、灰塵和其他鳥類來傳播。芽胞化的印囊含有四個芽胞幼蟲，分別含有兩個孢子蟲，，.工由m道中的機械和酵素作用，釋放出這些抱子蟲。這使得它們能夠依據所涉及之艾美球蟲的種類，侵入小腸或盲腸中的上皮細胞。雖然在艾美球蟲的種類和品系之間有致病力的差異，但由文到感染之動物顯示出的症狀，可能是下列其中一或多種：血便、向死亡率、通常是致命的、痩弱、伺料消耗明顯地降低、下痢和產蛋率降低。已經估計球蟲症在雞群中’可能疋大約6 - 1 〇〇/〇不想要之死亡率的原因。此外，症狀不明顯的疾病，增加飼料轉換率（FCRs )並降低效率。因此’孩疾病在經濟上的影響是相當大的，並且是最不希望的。已經抓4各種方法來對抗球蟲症。企圖經由以高的衛生標準’並在家禽的環境中使用化學消毒劑爲基礎之管理策略來控制該疾病。然而，即使是在嚴謹的衛生條件下，亦發現不可能根絕球蟲症，雖然發現這類的測量，較低於在禽舍中的最初感染壓力。已經研究了活毒和減毒疫苗，來做爲控制的方法，但是相對上較昂貴，且由於其作用的結 N / 果，而有使動物生長速率衰退的傾向。目前，家禽的球蟲症例行地藉藉著使用相對上較筇貴的 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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581663 五、發明說明（3 ) 預防性抗球蟲藥計劃來控制。這類計劃企圖限制球蟲的感染，因此限制了症狀不明顯之疾病爆發的影響。通常藉^ 從鳥群生命的早期到接近屠宰之肉雞爲止，在飼料中持續含有抗球蟲製劑’或藉著產蛋雞之經過控制的停藥 (withdrawal)來完成該計劃。在最初發展時，個別地使用這類製劑。經常使寄生蟲的品系發展出抗藥性。目前企圖藉著持續導入新的藥物，或藉著在戒除期間（往返計劃）或以頻繁的間隔（义替計劃）使用涉及輪流使用不同生物化學結構之抗球蟲製劑的藥物計劃來控制球蟲症。無論是否在豕禽飼料中例行地使用抗球蟲製劑，仍在大部份的家禽農場中發現症狀不明顯的球蟲症。四級胺幾酸的内鹽具有滲透保護劑之功能。這類鹽類增加細胞的滲透強度，而不會不利地影響酵素活性，並保護酵素免於離子或溫度的失活作用（Nash等人，Aust. J. Plant

Physiol· 9.47-57 (1982)，Yancey 等人，Science 224:1064-1069 (1982) ; Rudolph等人，Archives Biochem. Biophys· 245:134-143 (1986) ; McCue & Hanson ^ Trends in Biotechnology 8:358-362 (1990) ; papageorgi〇u 等人，curr· Res· in photosynthesis 1:95 7-960 (1990))。而有些生物（和組織）可堆積内鹽，像是在滲透緊迫的條件下，經由以滲透方式謗導的合成作用，以高含量堆積甜菜鹼，而大部份的動物缺乏該能力，依賴外源性内鹽的攝取。例如，分離的鈇魚之肝粒線體，當暴露在滲透緊迫之下時，顯示出增加甜菜驗的攝取，但 /又有合成作用（Bjorkoy ’ G·，Synthesis and Accumulation of -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---I----訂---------

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（4 ) g ycine betaine in Salmon (Salmo salar) and Mussels, MSc thesis ’ Norwegian College of、Fisheries，University of Tromso，第 94 頁）。在美國專利第5,834,473號中揭示使用甜菜鹼來處理球蟲症。爲了相同的相的，由WO 94/24886敎導甜菜鹼和球蟲預防藥的混合使用。歐洲專利-A-0 681 787號建議使用諸如蛋白酶及/或糖酶之類的酵素來治療及/或預防球蟲症。英國專利-A-2 W7 345敎導可藉著將促進飼料消化的酵素合併到動物飼料中，來處理在家畜迴腸中的細菌感染。這類酵素將出現在飼料之穀類成份中的多醣類分解成單醣’可由出現在腸道中、對宿主-有益之微生物用來做爲良物來源。由於其增殖的結果，致病性細菌因爲競爭性排除的過程而無法繁盛。這個策略在食物的品質低時更有效 (Classen 等人，proc.第 2 版 Eur. Symp. on Feed Enzymes 1995, 65 ; Pack and Bedford, Poultry International, 1998, 43) 〇曰本專利- A-01 238538和日本專利- A-01 l 3333敎導混合使用甜菜驗和各種酵素來改善動物的消化功能。然而，這些文獻並沒有建議使用這類的組合來治療或預防球蟲症或細菌感染，也沒有用來幫助維持遭受球蟲挑戰之動物的生長速率。在豕1中一種最受爭議的疾病是由產氣莢膜梭菌 (Clostfidium perfringens)引起的壞死性腸炎。在梭菌感染之觔通常有球蟲症。球蟲症拖累動物的免疫系統，使得動本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---------------------訂--------- (、請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

581663 A7 B7 試劑五、發明說明（5 ) 物接著暴露在細菌感染之下時，沒有能他的因素，像是昏、6 、〜付。Λ、：而，其 ” 疋糸追、過度擁擠或塾褥的、、n、之。通常藉著在動物飼料中補充水；=1成在接下來的説明和申請專利範圍的罝铲疋Α Λ· 紅及木聚糖酶活性 :扭活性的單位，以及《_爽粉酶活性的單 ^。。下敎在酵素預混物或液體酵素混合物中的這些活木聚糖酶活性的測定方法一早位之木聚糖酶活性爲該酵素在所描述的條件下，在一分鐘内從受酶質中釋放出丨微莫耳還原糖（以木糖相物表TF )的含量。 1 · 1 % (重量/體積）木聚糖酶受酶質將1 〇毫升0_5 Μ的氫氧化鈉加至〗·〇克木聚糖酶 (Fluka 95590)中。利用磁性攪拌子混合3〇分鐘。加入大約4 0毫升〇.〇5 Μ的醋酸鈉緩衝溶液， 5.3。利用1 μ醋酸將pH値調整到5.3。以〇〇5 M 醋酸鈉緩衝溶液，pH 5· 3加滿至1 〇〇毫升。在使用時受酶質應該始終是已經混合好的。 2 · 1 Μ醋酸吸移5.7毫升冰醋酸至計量燒瓶中，並加滿蒸餘水至100毫升。 - 3 . 0.05 Μ醋酸鈉緩衝溶液，pH 5.3 A ·將4 · 1克醋酸鈉溶解於蒸餾水中，並加滿蒸餘 •丨丨 1111 1----1---訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 8- 581663 A7

矽主1〇〇〇毫升。 Β·將3.0克冰醋酸溶解於蒸餾水中，亚加滿7及偷至1000毫升。 …、瑚以溶液Β將溶液Α的ρ Η値調整到pH 5 3。 4 · 一硝基水楊酸（DNS)試劑將20.0克3，5 _二硝基水楊酸懸浮於大約8〇〇亳升的蒸餾水中。逐漸地加入300毫升氫氧化鈉溶液 (32.0克MaOH在300毫升蒸餾水中），同時持續地攪拌。在水浴中加溫該懸浮液（溫度不可超過+料 °C)，同時攪拌直到該溶液變成澄清的爲止。逐漸地加入600克酒石酸鈉鉀。如有需要加溫該溶液（溫度不可超過+48°C )，直到該溶液變成澄清的爲止。加滿瘵餾水至2000毫升，並通過粗燒結玻璃遽器過遽。在室溫下儲存在暗色的瓶子裏。該試劑最多6個月是穩定的。程序經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 1 · 酵素試樣在+50°C下平衡1毫升的酵素溶液（在〇.〇5 μ醋酸鈉緩衝溶液，pH 5·3中）。加入1毫升木聚糖受酶質，攪拌並在+5〇°C下培養恰好3 0分鐘。加入3毫升DNS-試劑，攪拌並煮滞-該反應混合物恰好5分鐘。在冰水浴中將該反應混合物冷卻至室溫，並測量在540毫微米處對蒸餾水的吸光度。 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 581663 A7 B7 五、發明說明（ 7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製計算 2. 酵素空白在+50°C下培養1毫升木聚糖受酶質3 〇分鐘。加入 3耄升DNS-溶液並授摔之。加入1毫升酵素稀釋物（在0.05 Μ醋酸鈉緩衝溶液，pH 5.3中）並揽摔之。煮沸該混合物恰好5分鐘。在冰水浴中將該反應混合物冷卻至室溫，並測量在540毫微米對蒸餾水的吸光度。在酵素試樣和酵素空白之間的吸光度差異應該是 0.3-0.5 。 3 . 標準曲線在0.05 Μ醋酸鈉緩衝溶液，pH 5.3中，從無水的木糖來製備標準溶液。在標準物中的木糖濃度應孩是0.05-0.5毫克/毫升。將t毫升標準溶液、1毫升木聚糖受S聲質和3愛升DNS-試劑吸移至試管中。攪拌並煮沸恰好5分鐘。在冰水浴中冷卻至室溫，並測量在540毫微米處對標準空白的吸光度。在標準空白中，以1毫升〇〇5 M醋酸鈉緩衝溶液，pH 5.3來代替木糖溶液。以類似木糖標準物之方式另行處理標準空白。以及光度函數對木糖濃度做圖。對每種新的Dns一試劑準備新的標準曲線。根據下列的等式來计算試樣的木聚糖酶活性 ([Α(Χ)-Α(0)] X k +C〇) x 1000 X Df 活性（單位/克）= -10- C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

MW xyl 一一tfJI ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ·1 I ϋ ϋ ·ϋ ^1 ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ ^1 if ϋ ^1 ϋ ϋ I ϋ ϋ ϋ ϋ I · M1663 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（8其中： A(X)=酵素試樣的吸光度酵素空白的吸光度標準曲線的斜率木糖標準曲線的截取値因子，毫莫耳-> 微莫耳稀釋因子，（毫升/克） xy厂木糖的分子量（150.13 t =反應時間（3 0分鐘）蛋白質酶活性的測定方法一單位之蛋白酶活性爲該酵素在所描述的條件下，在刀姜里内彳文5：酶質中釋放出丨毫克酚系化合物（以胰蛋白酶相等物表示）的含量。試劑 1 · 0 · 6 % (重量/體積）酪蛋白受酶質在200愛升燒杯中稱取重〇 6克無水的Hammarsten 酪蛋白（Merck 2242)。以少量（大約5毫升）的蒸餾水潤濕。當赂蛋白冗全弄濕之後，加入2 〇毫升〇·2 Μ的磷酸氫二鈉溶液。將該混合物加溫至+6〇 °C，並加以攪拌，直到酪蛋白溶解而獲得蛋白色的溶液爲止。加入60毫升蒸餾水，如有需要加入 1 - 2滴的辛醇（抗泡沫劑；可使用類似的產物）。在冷卻至室溫之後，以〇·5_Μ氫氧化鈉和1M乳酸將P Η値調整到7.5。將該溶液移至計量燒瓶中，並加滿备館水至1 〇〇愛升。

A(0) k C〇 1000 Df MW 毫克/毫莫耳） -----I I I I I--------I--訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581663 A7 ____ B7 五、發明說明（9) 如果儲存在冰室中，該受酶質溶液可使用一週。 2 · 0·2 M Na2HP〇4溶液將17. 80克磷酸氫二鈉二水合物溶解於蒸餾水中，並加滿蒸餾水至500毫升。 3 · 0.02 M NaCl 溶液將1 · 1 68克氣化鈉溶解於蒸餾水中，並加滿蒸餘水至1000毫升。 4. 沉澱試劑（TCA) . 將18.80克三氣乙酸（CCl3COOH)、18.10克無水的醋酸鈉（CH3COONa)和18.80克醋酸（CH3C〇〇H)溶解於蒸餾水中，並加滿蒸餾水至1 〇〇〇毫升。 5 . S分試劑在測定之前才將一份⑴弗西二氏（F〇lin-Ciocalteau)酚試劑與一份（1)蒸餾水混合。 6 · 0.55 M Na2C03溶液將5 8· 295克碳酸鈉溶解於蒸館水中，並加滿蒸餾水至1000毫升。程序 1 . 酵素試樣在+40 °C下平衡1毫升的酵素稀釋物（在0.02 Μ NaCl溶液中）（大約5分鐘）。加入5毫升平衡過的酪蛋白受酶質，攪拌並在+40°C下培養恰好3 0分鐘。加入5毫升沉澱試劑並攪拌之。在+4〇°C下培養恰好3 0分鐘，並立刻以濾紙（Whatman 1或 Macherey Nagel 640 we)過滤之。 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I I I I---I I-----------訂· I I------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 一 11 "1 B7 . 五、發明說明（10) 吸移2毫升滤液、5毫升0.55 MNa2C〇2溶液和1 ===劑。撥拌並在+4(rc下培養分鐘。冷卻土至/皿，並測量在66〇毫微米處對蒸餾水的吸光度。 2. 酵素空白在+4〇t：下平衡1毫升的酵素稀釋物（在0.02 Μ NaCl /合液中）（大約5分鐘）。加入5毫升沉澱試劑，攪拌並在+40。(：下培養恰好3〇分鐘。加入5毫升酪蛋白受酶質，攪拌並在+4〇t：下培養恰好3〇分&。互刻以濾紙（Whatman 1 或 Macherey 640 we)過濾之。像酵素樣一樣地處理濾液。在酵素試樣和酵素空白之間的吸光度差異應該是 0.2_0·5 。 3 . 標準曲線藉著在計量燒瓶中稱取重1 〇毫克的L_胰蛋白酶，溶解於0·02 M NaCl溶液中，並加滿0.02 M NaCl溶液至100毫升，來製備胰蛋白酶母液。如下在0·02 M NaCl溶液中製備胰蛋白酶母液的稀釋物： 1:50 = 2微克/毫升 1:20 = 5微克/毫升-1:10 = 10微克/毫升 1:5 = 2 0微克/毫升 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^^1 i^i l^i —ϋ ·ϋ ί ϋ ϋ m n in mmmm§ n i i§ tMmm f ，I i^i ϋ a^i ^^1 ^i_· Hi an I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 581663 A7 B7 五發明說明（ 11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1:3 = 33微克/亳升 1:2 = 5 0微克/毫升吸移2毫升每種胰蛋白酶的稀釋物、5毫升〇.55 m NafC»3溶液和！毫升酚試劑。攪拌並在+4〇t：下培養3 0分鐘。冷卻至室溫，並測量在66〇毫微米處對蒸館水的吸光度。以吸光度函數對胰蛋白酶濃度做圖。計算根據下列的等式來計算試樣的蛋白酶活性 [A(X).A(〇)]xkxFxDf 活性（單位/克）= t 其中： A(X)=酵素試樣的吸光度 A(O)=酵素空白的吸光度 k 二標準曲線的斜率 F =反應稀釋因子（=11)

Df =稀釋因子（亳升/克） t =反應時間（3 0分鐘）〇c -;殿粉活性的測足方法一單位α -澱粉酶活性，在所描述的條件下，在一分鐘内催化一微莫耳糖甞鍵的水解作用。試劑 1 . 受酶質使用可供在活體外之消化用途使用的Phadebas殿粉酶測試錠（Pharmacia Diagnostics )做為受酶質。該錠劑在蒸餾水中，用不溶於水之藍色澱粉聚合 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------------—訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

581663 A7 五、發明說明（12 ) 物、牛血清白蛋白和緩衝溶液製成。 2 . 試劑溶液在計量燒瓶中，將9.0克氯化鈉、2()克牛血清白蛋白和2.2克氯化約溶解於蒸餾水中，並加滿蒸餾水至1000毫升。 3 . 〇·5 M NaOH 溶液在計量燒瓶中，將20.0克氫氧化麵溶解於蒸餘水中’並加滿蒸餾水至1 〇〇〇毫升。 4 · 滤紙

Macherey Nagel 640 mn 或相等物。程序 1 · 酵素試樣將200微升在試劑溶液中之適當的酵素稀釋物，和4.0毫升試劑溶液吸移至試管中。在+37C>c下平衡5分鐘。利用鑷子加入受酶質錠劑，並徹底混合1 〇秒。在+37°C下培養恰好1 5分鐘。反應時間從加入錠劑開始。加入丨.〇毫升〇 5 M Na〇H溶液’並徹底揽拌。過滤或以35〇〇 rpm離心1 〇分名里，並測金在620當微米處對試劑空白的吸光度。酵素樣品的吸光度應為0.3-0.5。 2 . 試劑空白在+3 7°C下平衡4.2毫升試劑·溶液5分鐘。利用鑷子加入受g^：質鍵劑’並徹底揽掉1 〇秒。在+ 3 7。〇下培養恰好1 5分鐘。加入1.0毫升〇·5 μ NaOH溶 -15- 本紙張尺度刺中關家鮮（CNS)A4規格（210 X 297公爱）" * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _丨丨丨丨丨丨备---------##-------丨丨丨------------- 五、發明說明（13) 液’攪掉並過濾、或以3500 rpm離心1 0分鐘。十算試樣的吸光度與α -殿粉酶的活性成正比。從鍵劑工具組所附的表中讀取酵素稀釋物的α _澱粉g祭活性。對每批錠劑均提供校正表。如下計算試樣的α -澱粉酶活性：

Act X Df 活性（單位/克）--- 1000 其中：

Act =從Phadebas澱粉酶測試表中讀取之酵素稀釋物的α -澱粉酶活性値（以單位/公升表示） Df =稀釋因子（毫升/克） 1 000 =將公升換算爲毫升的因數發明的主要目的是提供在動物飼料中所含有之成份的組合，其可改善健康動物的增重率。第二個目的提供這類口在裟迻預防及/或治療球蟲症，或諸如壞死性腸炎之類細菌感染之製劑上的用途。第三個目的是提供動物飼料〈添加物的組合，其對抗艾美球蟲挑戰，降低動物之增重比例的影響。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ’:因此，本發明的第-個觀點是提供蛋白酶和四級胺羧酸 (内鹽，在製造治療及/或預防球蟲症之製劑上的用涂，特別是在由艾美球蟲感染引起的時候。 ~ •因此，第二個觀點，本發明提供蛋白酶和四級胺羧酸之内鹽，在製造治療及/或預防細菌感染，例如由沙門桿# 屬（Salmonella)、弧形菌屬或李氏菌屬引起的感染之^ = -16- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制取 581663

上的用途。因此，第三個觀點，本發明提供成白酶和四級胺羧酸之内鹽，在製造治療及/或預防特別是 ,、> 一 U σ P 』疋由屋氣莢膜梭菌所引起之壞死性％关疋製劑上的用途。因此，第四個觀點，本發明接供# 4 权彳/'動物飼料的添加物，包括蛋白酶和四級胺叛酸之内鹽。圖片簡述圖！顯示以甜菜驗；蛋白酶；以及甜菜鹼和蛋白酶之組合來補充健康肉雖飼料之影響的圖解說明。圖2孕示以甜菜鹼；蛋白酶；以及甜菜鹼和蛋白酶之組合以百型艾美球蟲挑戰之肉雞飼料之影響的圖解説明。圖3爲凝膠層析譜，顯示以在各種方式補充之飼料餵食，並以各種病原挑戰之雞迴腸中，產氣莢膜梭菌毒素基因的存在。在下列的说明中’提及的各種方法論，均爲熟諳獸醫免疫學和免疫病理學、疫苗、動物藥理學和動物農業之技藝者的共同通識。陳述這類已知之方法論的出版物和其他資料包括：例如在 The Merck Veterinary Manual，第 6 版，Fraser 等人編輯，1 986 ; the Food and Drug Administration’s FDA 1994

Feed Additive Compendium, US. Food and Drug Adminstration ，1 994 : Trends in Veterinary Research and Development，第 6 卷。Anti-coccidials，Lloyd-Evans, PJB Publications

Ltd., 1991 ： Diseases of Poultry, B.W. Calnek, Iowa State -17- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

581663 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_____ 五、發明說明（15)

University Press, Ames, Iowa, 1991 中陳述的獸醫科學之共同原則。例如在 H. Patrick 等人，Poultry : Feeds & Nutrition，第 2 版，AVI Publishing Co· Inc·，Westport，Conn. (1980)中陳述的動物農業之共同原則。在 Remington’s Pharmaceutical Sciences (第 18 版，A.R· Gennaro 編輯，Mack Publishing，Easton，Pa. 1990)中陳述的藥學科學之共同原則。如同上文提及的，本發明提供蛋白酶和四級胺竣酸之内鹽，在製造治療及/或預防球蟲症、細菌感染，或特別是由於產氣莢膜梭菌感染引起之壞死性腸炎之製劑上的用返。圈飼動物使用含有甜菜驗和蛋白酶組合之飼料的優點爲可減少先前例行合併於飼料中之抗微生物藥物的含量，或在某些案例中可完全省略。在禁止使用這類藥物的國家’它代表控制細菌性疾病的新方法。當從動物的飲食中省略抗生素時，有數個可能的優點。以前在屠宰之前，必須從動物的飲食书停用抗生素一段時間。這可確保獸肉中相對上不含這類藥物，因此而適合人類消耗。相反的，如果從動物的飲食中完全省略抗生素，可利用本發明而達成，此時可在任何年齡屠宰動物，=不必在某個停藥期間之後。這使得農夫有餘力去改善適應性，並除去動物在屠宰之前短暫感-染的風險。此外，並保證獸肉和蛋不含抗生素。這類獸肉和蛋，與不提供這類保證的產品相比較，更具有市場上的優勢。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x ------—-------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本發明π具有人類健康的利益。藉著容許從動物甸料中 ^抗生素，它的使用降低了抗生素·抗藥性之細菌品系 ^選擇I力。因此’在動物腸道中將出現較多的抗生素、 =性之品系、，藉此雜萬_在相當的人類條件中使用抗生素時，更可能有致命的效果。可以各種方式來製備根據本發明之飼料添加物n 可間單地藉著混合不同的適當化合物，產生添加物〈。然後可將其直接與飼料混合，或更便利地灌入以殼馬基礎的媒介物質中，像是磨碎的小麥、玉米或大豆粉适類灌入的媒介物中，亦可包括根據本發明第四個觀點飼料添加物。可直接將飼料添加物與動物飼料混合，或另外與一戈種其他的飼料添加物混合，像是維生素飼料添加物'礦物質飼料添加物，或胺基酸飼料添加物。然後可將所得的冬有數種不同類型成份之飼料添加物，以適當的份量盘㈣漏合。亦可能藉著將飼料添加物併入第二種（且不同的）匈料或動物能夠接近的飲水中，而使動物的飲食中含有兮料添加物。因此，不一定要將本發明提供之添加物併：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製類的

f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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多飼以明榖類爲基礎的主要動物飼料中，雖然這類合併形又特佳的觀點。又他造將可將本發明提供的飼料添加物，與想的酵素-起調配成預混物。可在飼料製造之前、飼料製期間’將涊預混物加至原料中，或在預備使用該飼料時做馬最後的步驟。亦可能在形成小球或成爲糊狀之前 -19- 297公釐）本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21石 581663 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣五、發明說明（17, 内鹽和蛋白酶的組合直接加至飼料原料中。果和本發明之添加物併入動物飼料中，此時飼料應該包括至少2 5重量％的榖類，而更佳的是至少3 5重量％的 I又涵攻^又類可以是任何一或多種的小麥、玉米、裸麥、大夕«麥、小麥類、稻米和高梁。特佳的是該榖類爲玉米或小麥。雖然以秋類爲基礎之飲食的榖類成份包括蛋白質來源，但其通常需要在飲食中包括補充的蛋白質，像是衍生自魚门被闪或說菜的那些。達些補充的蛋白質來源，可組成同達5 0重f %的動物飼料。蔬菜蛋白質的來源，包括至少、一種充滿脂肪的大豆，、油菜籽、卡諾拉（can〇u)、大豆粉、油菜籽粉和卡諾拉粉。四級胺羧酸的内鹽具有共同結構式RlR2R3N+_L_C〇〇-，其中R1、R2和R3分別代表任何的有基基團，通常是烷基，更佳的是具有1 - 6個碳原子的烷基，而最佳的是均爲甲基；連接基團-L -代表任何的有機連接基團，像是烷氧烷基或伸烷基，較佳的是Cl_C(3伸烷基，而最佳的是亞甲基。四級胺岁k S父之内鹽的實例包括甜菜驗（Me3N+CH9COCT)、

Me3N+_CHMeCOCr、Et3N+CH2COO·、Me2EtN+CH2COO·、 Me3N+CH2CH2CO〇- 、 Me3N+CH2OCH2CO〇.以及 Me3N+C(CHMe2)HCOO·。該内鹽最好是甜菜鹼，其可以商標名 Betafin⑧講自 Finnfeeds。 - 在飼料中所含有的内鹽，最好是按每公斤飼料〇〇1 克之比例，更佳的是0.1-10克/公斤，而最佳的是〇 5至2克/ -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I<--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

581663 A7 ' --~---~~一五、發明說明（18) 公斤。所使用的蛋白酶可以是任何形式的蛋白酶，然而最好是使用衍生自枯草桿菌（Bacillussubtilis)，具有不低於 40，_單位/克之活性的枯草桿菌蛋白酶。在例如美國專利第4,760,025A號中描述了這類枯草桿菌蛋白酶。以使該飼料具有相當於每公斤飼料100單位至丨〇〇〇〇〇單位蛋白酶活性的含量，將蛋白酶納入飼料中，更佳的是每公斤飼料含有500單位至10,000單位。適當的译白酶包括但不限於下列可購得的蛋白酶：Novo NEUTRASE (TM)(購自Novo Nordisk) ; PURAFECT (TM)購自 Genencor Internati〇nal ⑻) ’ SAVINASE (TM)(購自 Novo Nordisk) ; MAXACAL(購自 Gist-Brocades) ; DURAZYM (TM)(購自 Novo Nordisk);以及 MAXAPEM (TM)(賭自 Gist Brocades)。在本發明較佳的具體實施例中，製劑或添加物可額外地含有木聚糖酶。木聚糖酶係衍生自眞菌來源，像是木徽屬 (Trichoderma)、麴黴屬（Aspergillus)、腐質黴屬 (Humicola)、新卡利馬斯提克黴屬（Neocallimastix)或嗜熱黴屬（Thermomyces)。較佳的木聚糖酶是獲自長分枝木黴 (Trichoderma longibrachiatum)的低 p I 木聚糖 S每及 / 或高 p I 木聚糖酶，如同在WO 92/06209之實例2 2中描述的。另外，木聚糖酶亦可獲自諸如桿菌屬（Bacillus)、鏈黴菌屬 (Streptomyces)、小四孢菌屬（Microtetraspora)、梭菌屬、瘤胃球菌屬（Ruminococcus)之類的細菌。該木聚糖酶亦可能獲自已經受到遺傳操縱的宿主，像是藉著將適當的基因 -21 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ------訂---------線

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581663

五、發明說明（19 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製入佰王細囷或具囷品系中。木聚糖酶的較佳活性應該是大〜000單仏/克。得自長分枝木黴具有最低活性3綱單位/克的木聚糖酶’可以商標名AVIZ YME@賭自Flnnfeeds Internationai。以使飼料具有相當於每公斤飼料100單位到 1〇〇，_單位之木聚_活性的含量，將木聚糖酶納入飼料中’更佳的是每公斤飼料具有單位至_〇單位。在本發月更佳的具肢實施例中，以_殿粉酶亦可出現在製劑或添加物中。雖'然在本發明的範圍内可使用任何形式的 α-殿。粉酶’但最好是使用得料草桿菌、具有最低活性 4曰000早=/克的α_澱粉酶。具有最低活性單位/克，得自枯草桿菌的α-澱粉酶，可以商標名AVIZYME®購自 Fir^feeds International。以使飼料具有相當於每公斤飼料 10早位至ΙΟΟ’ΟΟΟ單位之α_澱粉酶活性的含量，將心澱粉 S㈣入飼料中，更佳的是每公斤飼料具有ι〇〇單位至4，_ 單位。，可在使用之前將内鹽、蛋白酶和視需要的木聚糖酶及/ 或cx-澱粉酶混合在一起，但亦可分別應用於飼料中。蛋白酶、木聚糖酶和α_澱粉酶的組合，可以商標名 AVIZYME® 1510購自Finnfeeds…⑽如咖丨這類酵素進一步的組合，以乾燥預混物之形式，亦以商標名 AVIZYME® 1500 購自 Finnfeeds Internati〇nal。應注意到通常不建議將蛋白酶與其他蛋白質儲存在一起長時間：因爲它有使後者降解的傾向。本發明之飼料添加物適用於各種動物，但是本發明之用 -22- 本紙張尺i適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581663 A7 ~^^---— B7_;___ 五、發明說明（2〇 ) 途對於冢百和農場動物是特佳的。特別獲益於本發明的動物包括禽類（像是雞、火雞、鴨和鵝）、反魯動物（像是牛、馬和綿羊）、豬類（豬）、嚆齒類（像是兔子）和魚。本發明對於肉難是特別有用的。根據本發明，可投予有效含量的本發明添加物，以便緩和由病原體引起之任何球蟲症的有害影響，且特別是任何的又美球蟲屬，包括例如壞死艾美球蟲、蓋洛帕弗尼斯艾美球蟲（galloparvonis)、墨勒格米提斯艾美球蟲 (meleagnmitis)、伊諾丘艾美球蟲（inn〇cua)、火雞艾美^ ，（meleagndls)、薩布洛坦達艾美球蟲（subr〇t⑽,散播 =美球蟲（dispersa)、特朗卡他艾美球蟲（truncata)、堆型 =美球蟲、褐色艾美球蟲、百型艾美球蟲、米提斯艾美球姓（m山s)、晋拉克司艾美球蟲（praec〇x)和禽盲腸型球蟲。更特定而言，該添加物促進了感染艾美球蟲之動物的增重。 —根據本發明，可投予有效含量的本發明添加物，以便在永㈣中瑗和因為父美球蟲感染而產生的有害影響，特別是艾美球蟲屬，堆型艾美球屬、褐色艾美球蟲、；型艾蟲、米提斯艾美球蟲、壞死艾美球蟲、普拉克司艾美球蟲和禽盲腸型球蟲。根據本發明，可投予有效含量的本發明添加物，以便缓和以艾美球蟲屬之成員感染牛所引起的有害影響，特別視爾尼氏艾美球蟲（zuernii)、牛艾美球蟲（bQvis)(sm丨削）、擴圓艾美球蟲（ellipsoidlis)。 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---I I ---訂·---I---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) %

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五、發明說明（21 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製根據本發明，可投予有效含量的本發明添加物，以便緩和以艾美球蟲屬之成員感染綿羊所引起的有害影響，包括 2洛英氏A型艾美球蟲（arloingi A)(羊艾美球蟲（〇vina))、早布里奇艾美球蟲（weybridgensis)(阿洛英氏B型艾美球蟲 (arlongis B))、克蘭多艾美球蟲（crandalHs)、阿沙塔艾美球蟲（ahsata)、羊依達利艾美球蟲（〇vin〇idaHs)、吉爾露西艾美球蟲（gilruthi)。根據本發明，可投予有效含量的本發明添加物，以便緩和以艾美球蟲屬之成員感染山羊所引起的害影響，包括例 =^用阿洛英氏艾美球蟲屬、富爾艾美球蟲（faurei)、卡晋羅那艾美球蟲（capr〇ina)、尼那古艾美球蟲 (mnakohlyakimovae)、克里斯坦森艾美球蟲（christensem)來免疫接種的。根據本發明，可投予有效含量的本發明添加物，以便緩和以艾美球蟲屬之成員感染豬所引起的有害影響，包括例如利用艾美球蟲屬之帝伯利克艾美球蟲（deb丨ieck〗）、司卡巴艾美球蟲（scabra)、彭尼紐塔艾美球蟲（penninuta)免疫接種的，並包括由同形孢子蟲屬（Is〇sp〇ra)之成員引起的有害影響，例如豬同形孢子蟲（Isosp〇ra suis)。一根據本發明，可投予有效含量的本發明添加物，以便在家禽中緩和由於細菌感染所引起的有害影響，像是梭菌屬々門和菌屬、孤开）菌屬、大腸稈菌和李氏菌屬，且特別是產氣莢膜梭菌、腸炎沙門桿菌（Salm〇nella entedtidis) 和2腸弧形菌（Campylobacter jejuni)。因爲產氣莢膜梭菌 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------丨tr---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 581663 A7 五、發明說明（ 22 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製疋壞圯性腸炎的王要原因之一，因此可使用營養性的添力口物來製備用來治療及/或預防壞死性腸炎的製劑。可使用其他的藥學方法來控制作用的期間。可藉著選擇週當的巨分子，像是聚酯類、聚胺基酸、聚吡洛烷酮？乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白，並混合這些，根據為了控制釋放而已經確立的程^ : 來完成經過控制之遞送。亦可藉著將這些製劑併入聚合物貝的顆粒中，像是聚酯類、聚胺基酸、水膠體、聚（乳酸）或乙烯乙酸乙烯酯共聚物，來控制内鹽和蛋白酶的作用期間。另外，亦可在微膠囊中調配内鹽和蛋白酶。在 Remington s Pharmaceutical Sciences，（第 16版，A. 〇sl〇w 編輯，Mack Easton，pa· 1980 )揭示製造和使用微膠囊的種材料和方法。 fe 了本發明之具體實施例，其中以動物飲食之飼料的叩式，對動物投予内鹽和蛋白酶的方法以外，本發明更包括使用含有内鹽和蛋白酶的其他組合物，其可與任何想要組合物共同投予，包括任何疫苗、營養物或藥劑。實例實例1 下列的實例解釋在將本發明之飼料添加物併入健康動的飼料中，以及製造治療艾美球蟲感染之製劑時的作用 (a )共同程序 _ 將9 6雙雌性肉雞（R〇ss 2〇8 )分成四組，每組2 *隻動物在第〇天開始餵食的處理，並在第1 4天時，使鳥類接受 -25- 本紙張尺度剌㈣國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱各形的物百 -------•丨tT--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 581663 A7 五、發明說明（23 ) ^艾美球蟲的挑戰。藉著以在2毫升體積來自水中的堆刑艾吴球蟲和百型艾美球蟲之卵囊接種雞群，广 1¾ —隹* a 1丁 k頰挑戰。母又鳥的劑量爲1〇〇,〇〇〇個堆型艾美球蟲的卵囊， 50,000個百型艾美球蟲的卵囊。這兩種艾美球蟲在空間上，在小腸中分開；堆型艾美球蟲感染十二指腸和空腸前丰又，而百型艾美球蟲喜歡中間的小腸；從遠端的空腸到中段的迴腸。在第〇_14天時將鳥群關在籠子裏，而在第丨肛h 天之間’使其在舖有木屑墊料的開放圍攔中。提供給鳥的飼料爲沒有抗球蟲製劑，以Λ米-大豆爲礎的。該飼料被冷_壓成小而易碎的小球，.具有大約$ 米之直徑。在第〇-14天使用最初的飼料，而在第14·2ι 使用結束的飼料。適當地經由甜菜驗的水溶液（以每公飼料1克之劑量），以及AVIZYME® .1510水溶液，其本, 大約300單位/克之木聚糖酶、4 〇〇〇單位/克蛋白酶和4〇〇單位/克α -;殿粉酶’購自Finnfeeds International，以1克/ 公斤飼料之劑量，將添加物噴灑在飼料小球上。所使用之飼料組合物如下：基毫天斤有每 ------:—訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) #

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 581663 A7 B7 五、發明說明（24) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製玉米-大旦飼料成份最初的飼料最終的飼料玉米 60.81% 61.09% 魚粉65脂肪 0.05% 0.50% 大豆粉48 33.38% 30.18% 大豆油 1.09% 4.18% 鹽 0.39% 0.32% 碳酸氫鈉 0.01% 0.00% DL甲硫胺酸 0.18% 0.10% 石灰石 1.11% 1.17% 磷酸二鈣 1.53% 1.46% 維生素+礦物質混合物 1.00% 1.00% 總量 100.00% 100.00% -27- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 581663 A7 B7 五、發明說明（）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製這些飼料的營養組成如下：營養物最初的飼料最終的飼料粗蛋白質％ 21.5 20 禽類ME千卡/公斤 2975 3175 豬DE千卡 3377.25 3500.69 鈣％ 0.9 0.9 磷％ 0.7 0.67 可利用磷％ 0.42 0.4 脂肪％ 3.92 6.85 纖維％ 2.59 2.49 甲硫胺酸％ 0.52 0.42 半胱胺酸％ 0.36 0.34 甲硫胺酸+半胱胺酸％ 0.88 0.76 離胺酸％ 1.17 1.07 組胺酸％ 0.58 0.54 色胺酸％ 0.25 0.23 蘇胺酸％ 0.83 0.77 精胺酸％ 1.44 1.33 異亮胺酸％ 0.92 0.85 亮胺酸％ 1.9 1.79 苯丙胺酸％ 1.06 0.98 酪胺酸％ 0.79 0.73 纈胺酸％ 1.01 0.94 甘胺酸％ 0.89 0.83 苯丙胺酸+酪胺酸％ 1.84 1.72 Na% 0.18 0.15 Cl% 0.29 0.24 K% 0.92 0.85 亞麻油酸％ 1.64 2.86 Na+K-Cl (毫當量/公斤） 232.46 * 214.64 DUA (毫當量/公斤） 439.53 436.23 鎂％ 0.2 0.18 -28· -------—訂·--------*5^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) #

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） « 瓦、發明說明（ (b )結果在第I 4天以百型艾美球蟲重。表1顯示使用甜菜驗和蛋白二才測量烏類的f *龙曰g母 < 組人，b 化合物加至飼料中的相比較，' 口人刀別將這座〜果有增加之增重。

多別 A JB D 飲食對照組（未補甜菜竺的充蛋白酶交的） 418

43 I 442 在圖1中以圖解表示表I之結果再度在第2 1天取得鳥的體 ^ - 7 . £也就疋在艾美球蟲挑戰 I後7天。在表2中概述並处耍。而—廿力 ^ ^ , 7δ, ΑΑ 〃、，、°果與在其飼料中補充甜菜 2蛋白㈣8和。組之增重比I觀察到D組有改善的曰：再I ^兩種成分的組合所產生的改善，比個別成份之影響的總和更大。表2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ------- 組別（飲食如同表]中的）平均重哥、 A --1 』王王v几_____— 65 1 B ^ ^ Λ. __ 一 644 一 C 665 D -— - \j kj — 690 一在圖2中以圖解表示在表2中陳述的結果。 -29- 297公釐）良尺度適用中國國 -------21 -------21 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581663 A7 五、發明說明（27) 實例2 在本實例中探討在實例！中使用之甜菜鹼和蛋白酶的組合，對產氣莢膜梭菌感染的活性。所使用之飼料爲在實例 1中描述的最終飼料。 ^ (a) 共同程序：. 知1 2隻2 1日齡的難分成E、F和G三組，每組4隻鳥。使暴露在百型艾美球蟲的挑戰之下，F組接受產氣莢▲ 梭菌的挑戰，而G组同時接受艾美球蟲和產氣莢膜梭菌兩者的挑戰。如下從全部的微生物DNA中，檢測產氣莢膜梭菌的ex-毒素基因：利用根據已知的產氣英膜梭菌α•毒素基因之核甞酸序列來設計的引子，使盲腸的全部微生物隠接受PCR。由s〇nger和如Meer，在^^ ^ 1997 July;5^7)，第7〇2_7()5頁中描述了毒素引子的序列，和進行p c R反應的條件。 (b) 結果在圖3中所示凝膠之跑道3中的集中帶，代表在動物中存有内源性的產氣莢膜梭菌之α_#素基I在跑道2和4 中缺乏這樣的帶，顯示艾美球蟲的挑戰是抓住產氣英膜梭菌感染的必要先決條件。不希望與任何理論結合，咸相信艾吴球蟲的挑戰降低了在腸道中蛋白酶的正常冬量，狄後減少了在小腸上端的營養攝取，、结果增加了在迴腸的蛋白質含量(並因此改善了產氣笑膜梭菌的生長環境）。其他可旎具有重要性的觀點是艾美球蟲的挑戰對宿主動物免疫系統的影響。可能當艾美球蟲的挑戰已經預先佔據了免疫系 -3〇 - 本紙張尺度適财關家鮮（CNS)A4規格⑵Q ---- ------------· I I I----訂-----------*5^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

581663 五、發明說明（28) 、，充時#產氣英膜梭菌的挑戰的免疫反應就減弱了。在圖3,中比軟跑道6知7，顯示僅在以蛋白酶處理的組別 =(九迢6 )觀察到代表產氣莢膜梭菌α -毒素基因的帶狀區仁並未在/昆合使用甜菜鹼和蛋白酶的組別中（跑道7 ) 觀察到。而冑菜驗並不能有效地對抗產氣荚膜梭菌的挑戰，ie在此員技藝中是共通的知識。因此，可推論甜菜鹼和蛋白酶的組合，可有效對抗產氣莢膜梭菌的感染，而分別使用蛋白酶或甜菜鹼並不能產生對梭菌感染的有效治療0 ________^i — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --^1訂---------線

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

581663 第088123131號申請專利案土文申請專利範圍替換太「的车1 E；申請專利範圍；種用表/口療或預防表禽球蟲症之飼料組合物，其包括甜菜鹼及蛋白酶作為添加物，其中在每公斤的飼料組合物中，甜菜驗的量為Ο.ΟΚΜ，且蛋白酶的量相當於 100至1 〇〇,〇〇〇單位的蛋白酶活性。 2. 根據2請專利範圍第丨項之飼料組合物，其係用來製造治療家禽之艾美球蟲（五/wen.a)感染的製劑。 3. 根據申請專利範圍第丨項之飼料組合物，其係用來促進被艾美球蟲感染之家禽的增重。 4· 一種用於治療及/或預防家禽細菌感染之飼料組合物，其包括甜菜鹼及蛋白酶作為添加物，其中在每公斤的飼料組合物中，甜菜鹼的量為〇〇1至2〇克，且蛋白酶的量相當於1 00至1 〇〇,〇〇〇單位的蛋白酶活性。 5·根據申請專利範圍第4項之飼料組合物，其係用於治療及/或預防特別是由於產氣莢膜梭菌謂 Wr/rhgew)感染而引起之壞死性腸炎。 6·根據申請專利範圍第丨至5項中任一項之飼料組合物，其係進一步包括每公斤100至1〇〇,〇〇〇單位的木聚糖酶活性。 7·根據申請專利範圍第丨至5項中任一項之飼料組合物，其係進一步包括每公斤10至1〇〇,〇〇〇單位的心澱粉酶活性。 8· —種用於動物飼料的添加物，其包括蛋白酶、木聚糖酶及甜菜驗，其中在每公斤的飼料中，甜菜鹼的量為〇〇1 至20克’木聚糖酶的量相當於1〇〇至1〇〇,〇〇〇單位的木聚糖酶活性’且蛋白酶的量相當於丨〇〇至1 〇〇，〇〇〇單位 O:\62\62069-930114

581663 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍的蛋白酶活性。 9. 根據申請專利範圍第8項之用於動物飼料的添加物，其係進一步包括α -澱粉酶。 10. —種動物飼料，其係包括根據申請專利範圍第8或9項之添加物，以及至少2 5重量％的穀類。 O:\62\62069-930114.DOC 5 ~ 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）