PL203144B1

PL203144B1 - Zastosowanie proteazy i betainy do produkcji środka leczniczego i zastosowanie proteazy i betainy jako dodatku paszowego oraz dodatek do paszy dla zwierząt

Info

Publication number: PL203144B1
Application number: PL356152A
Authority: PL
Inventors: Juha Heikki Antero Apajalahti; Nina Rautonen; Michael Richard Bedford
Original assignee: Finnfeeds Int Ltd
Priority date: 1999-12-09
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2009-08-31
Also published as: JP4786103B2; ES2204740T3; PL356152A1; CA2393464C; US20030059498A1; DE60004879T2; DK1237569T3; MXPA02005577A; PT1237569E; EP1237569B1; JP2003516133A; GB2358135A; DE60004879D1; KR20020070313A; US20060134091A1; EP1237569A1; KR100730604B1; JP2011041576A; GB9929152D0; CA2393464A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są zastosowania proteazy i betainy do produkcji środka leczniczego i zastosowanie proteazy i betainy jako dodatku paszowego oraz dodatek do paszy dla zwierząt.

Wynalazek ten odnosi się do dodatku do paszy, a szczególnie do takiego dodatku, który poprawia tempo przyrostów wagowych zwierzęcia karmionego paszą, do jakiej jest on wprowadzony. Odnosi się on ponadto do takiego dodatku, który jest użyteczny przy leczeniu i/lub profilaktyce kokcydiozy i/lub zakażenia bakteryjnego, włączając te, które mogą powodować martwicowe zapalenie jelita.

Chów wielu różnych rodzajów zwierząt jest ważny na całym świecie, w związku z produkcją żywności spożywanej przez ludzi. Podczas chowu zwierząt, mogą się one stykać z rozmaitymi bakteriami i pasożytami powodującymi zakażenia, takimi jak Eimeria, Campylobacter, Clostridium, Salmonella, E.coli i Listeria.

Kokcydioza jest powszechną przyczyną choroby w intensywnych hodowlach zwierząt gospodarskich, szczególnie u drobiu. Kokcydiozę powodują pierwotniaki, jednokomórkowe pasożyty podtypu Apicomplexa. Wiele gatunków, które powodują choroby u zwierząt domowych należy do rodzaju Eimeria. Pasożyty te mnożą się w nabłonku jelita. U kurcząt zidentyfikowano siedem gatunków Eimeria, z których pięć uważa się za patogenne. Są to E. acervulina, E. maxima, E. necratrix, E. tenella i E. brunetti.

Kokcydia są organizmami powszechnie występującymi i są generalnie endemiczne, gdziekolwiek hodowane są kurczęta. Początki choroby mogą być różne, od ciężkich do bardzo łagodnych infekcji. Jak wiele pasożytnicznych pierwotniaków, cykl życiowy Eimeria jest stosunkowo złożony. Rozmnażanie płciowe i bezpłciowe następuje w jelitach kurczęcia. W czasie tego procesu rozmnażania i rozwoju pasoż yta, niszczona jest tkanka ż ywiciela, co prowadzi do róż nych objawów klinicznych obserwowanych w początkach kokcydiozy. Produkowane i wydzielane oocysty rozwijają się dalej na zewnątrz żywiciela, gdzie mogą przejść dalszy rozwój i zakażać inne kurczęta. W rzeczywistości oocysty mogą przeżywać poza żywicielem długi okres czasu, który umożliwia im zakażenie innych ptaków, nawet po usunięciu najpierw zakażonych żywicieli. Mogą być także rozprzestrzeniane między stadami przez inne czynniki, włączając ludzi, zwierzęta domowe, owady, gryzonie, ptaki oraz kurz.

Oocysty po sporulacji zawierają cztery sporocysty, przy czym każda zawiera dwa sporozoity. Te sporozoity są uwalniane przez działanie mechaniczne lub enzymatyczne w przewodzie pokarmowym kurczęcia. Umożliwia to wniknięcie do komórek nabłonka jelita lub kątnicy, w zależności od zakażającego gatunku Eimeria.

Chociaż istnieją różnice w patogenności między gatunkami i szczepami Eimeria, objawami przejawianymi przez zakażone zwierzę, mogą być jeden lub więcej z następujących: krwawe odchody, wysoka śmiertelność, ogólna ospałość, wyniszczenie, znaczny spadek zużycia paszy, biegunka i spadek produkcji jaj. Oszacowano, że kokcydioza jest prawdopodobnie odpowiedzialna za 6-10% niepożądanej śmiertelności wśród stad drobiu. Ponadto, choroba podkliniczna zwiększa szybkość przemiany paszy (FCR) i zmniejsza wydajność. W związku z tym, konsekwencje ekonomiczne tej choroby są poważne i jak najbardziej niepożądane.

Aby zwalczyć kokcydiozę przebadano różne metody. Czyniono próby kontrolowania choroby poprzez strategie zarządzania w oparciu o wysokie standardy higieny, razem ze stosowaniem chemicznych środków dezynfekujących w środowisku drobiu. Jednakże nawet w skrupulatnie higienicznych warunkach niemożliwe było wytępienie kokcydiozy, choć znaleziono takie środki zaradcze, które obniżają początkowy napór infekcji w kurniku. Jako metody kontroli badano szczepionki, zarówno żywe jak i atenuowane, lecz są one relatywnie drogie i mają tendencję do obniżania tempa wzrostu zwierząt w wyniku ich działania.

Obecnie, kokcydioza drobiu jest rutynowo kontrolowana za pomocą stosunkowo drogich, zapobiegawczych antykokcydiozowych programów lekowych. Przez takie programy próbuje się ograniczyć zakażanie kokcydiami, ograniczając w ten sposób wpływ podklinicznego początku choroby. Osiąga się to zazwyczaj przez ciągłe wprowadzanie środków zapobiegających kokcydiozie do paszy, od wczesnego okresu życia stada, aż do zabicia w rzeźni w przypadku broilerów, albo kontrolowanego wycofywania, w przypadku niosek. Początkowo po opracowaniu, takie środki stosowano indywidualnie. W wyniku tego często powstawały szczepy pasożytów opornych na leki. Obecnie podejmuje się próby kontrolowania kokcydiozy przez ciągłe wprowadzanie nowych leków, albo przez stosowanie programów lekowych obejmujących rotacyjne stosowanie czynników antykokcydiozowych o różnych strukturach biochemicznych, albo podczas okresu wyrastania (programy wahadłowe) albo przy częstych

PL 203 144 B1 przerwach (programy rotacyjne). Mimo rutynowego stosowania czynników antykokcydiozowych w paszach dla drobiu, kokcydioza podkliniczna wciąż znajduje się na większości ferm drobiowych.

Sole wewnętrzne kwasów karboksylowych amin czwartorzędowych działają jako środki zabezpieczające osmozę. Takie sole zwiększają siłę osmotyczną komórek bez szkodliwego wpływu na aktywność enzymatyczną oraz zabezpieczają enzymy przed inaktywacją jonową lub temperaturową (Nash i inni, Aust.J.Plant Physiol. 9:47-57 (1982); Yancey i inni, Science 224:1064-1069 (1982); Rudolph i inni, Archives Biochem. Biophys. 245:134-143 (1986); McCue i Hanson, Trends in Biotechnology 8:358-362 (1990); Papageorgiou i inni, Curr. Res. In Photosythesis 1:957-960 (1990)). Mimo, że niektóre organizmy (i tkanki) mogą akumulować sole wewnętrzne, takie jak betaina, w dużych ilościach w stresie osmotycznym, poprzez syntezę indukowaną osmotycznie, większość zwierząt nie posiada tej zdolności i są zależne od wychwytu egzogenicznych soli wewnętrznych. Przykładowo, wyizolowane mitochondria wątroby łososia po poddaniu stresowi osmotycznemu, wykazują zwiększony wychwyt betainy, ale nie syntezy (Bjorkoy, G., Synthesis and Accumulation of glycine betainę in Salmon (Salmo salar) and Mussels, Msc thesis, Norwegian College of Fisheries, Uniwersytet Tromso, strona 94).

Stosowanie betainy do leczenia kokcydiozy jest opisane w opisie patentowym US 5,834,473. Połączone stosowanie betainy i kokcydiostatu w tym samym celu, podaje się w publikacji WO 94/24886. Publikacja EP-A-0 681 787 sugeruje stosowanie enzymów, takich jak proteaza i/lub karbohydraza, do leczenia i/lub zapobiegania kokcydiozie.

Opis GB-A-2 327345 poucza, że infekcje bakteryjne w jelicie krętym zwierząt gospodarskich, można leczyć przez wprowadzanie enzymów do paszy dla zwierząt, które pobudzają trawienie paszy. Takie enzymy rozrywają polisacharydy występujące w składniku zbożowym paszy, do oligosacharydów, które są używane jako źródło pokarmu przez korzystne dla żywiciela drobnoustroje występujące w jelicie. W konsekwencji tej proliferacji, bakterie patogenne nie mogą przetrwać z powodu współzawodniczego wykluczania się. Strategia ta jest generalnie skuteczniejsza gdy jakość paszy jest niska (Classen i inni, Proc. 2^nd Eur. Symp. on Feed Enzymes 1995, 65; Pack i Bedford, Poultry International, 1998, 43).

JP-A-01 238538 i JP-A-01 132533 opisują połączone stosowanie betainy i różnych enzymów w celu poprawienia funkcji trawiennych zwierzą t. Jednak ż aden z tych dokumentów nie sugeruje stosowania takich połączeń do leczenia lub zapobiegania kokcydiozie czy infekcjom bakteryjnym, albo pomocniczo w utrzymaniu tempa wzrostu zwierząt poddanych prowokacji kokcydiami.

Jedną z najbardziej problematycznych chorób zwierząt gospodarskich jest martwicowe zapalenie jelita powodowane przez Clostridium perfringens. Infekcje Clostridium są zwykle poprzedzone kokcydiozą. Kokcydioza upośledza odpowiedź immunologiczną zwierzęcia tak, że zwierzę jest mniej zdolne do odpowiedzi przy kolejnej ekspozycji wobec infekcji bakteryjnej. Jednakże mogą się do tego przyczyniać też inne czynniki, takie jak stres, zatłoczenie lub nasycenie ściółki odchodami. Martwicowe zapalenie jelita leczy się zwykle przez uzupełnienie paszy zwierzęcej rozpuszczalną w wodzie bacytracyną cynkową, wirginamycyną lub penicyliną.

W opisie i zastrzeżeniach, podaje się jednostki aktywności proteazowej, jednostki aktywności ksylanazowej oraz jednostki aktywności α-amylazowej. Te rodzaje aktywności w premiksie enzymatycznym lub płynnej mieszance enzymatycznej, testuje się następująco.

Metoda testowania pod względem aktywności proteazowej

Jedna jednostka aktywności proteazowej jest to ilość enzymu, która uwalnia z substratu jeden mikrogram związku fenolowego (wyrażony jako równoważniki tyrozynowe) w ciągu jednej minuty w opisanych warunkach.

Odczynniki 1. 0,6% (ciężar/objętość) substratu kazeinowego

Odważyć 0,6 g suchej Hammarsten Casein (Merck 2242) do zlewki o objętości 200 ml. Zwilżyć małą ilością (około 5 ml) wody destylowanej. Gdy kazeina jest dokładnie zwilżona, dodać 20 ml 0,2 M roztworu wodorofosforanu disodowego. Ogrzewać mieszaninę w temperaturze +60°C mieszając aż kazeina rozpuści się i otrzyma się opalizujący roztwór. Dodać 60 ml wody destylowanej i jeśli trzeba, 1-2 krople alkoholu oktylowego (środek zapobiegający pienieniu się; można użyć podobny środek). Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej wyregulować pH do 7,5 z użyciem 0,5 M wodorotlenku sodu i 1 M kwasu mlekowego. Przenieść roztwór do kolby wolumetrycznej i dopełnić do 100 ml wodą destylowaną.

Roztwór substratu można używać przez jeden tydzień jeśli jest przechowywany w chłodni.

PL 203 144 B1

2. Roztwór 0,2 M Na2HPO4

Rozpuścić 17,80 g wodorofosforanu disodowego w wodzie destylowanej i dopełnić do 500 ml wodą destylowaną.

3. Roztwór 0,02 M NaCl

Rozpuścić 1,168 g chlorku sodu w wodzie destylowanej i dopełnić do 1000 ml wodą destylowaną.

4. Odczynnik strącający (TCA)

Rozpuścić 18,80 g kwasu trichlooctowego (CCl3COOH), 18,10 g bezwodnego octanu sodu (CH3COONa) i 18,80 g kwasu octowego CH3COOH) w wodzie destylowanej i dopełnić do 1000 ml wodą destylowaną.

5. Odczynnik fenolowy

Wymieszać jedną (1) część odczynnika fenolowego Folin-Ciocalteau z jedną (1) częścią wody destylowanej tuż przed testem.

6. Roztwór 0,55 M Na2CO3

Rozpuścić 58,295 węglanu disodowego w wodzie destylowanej i dopełnić do 1000 ml wodą destylowaną.

Procedura 1. Próbka enzymatyczna

Zrównoważyć 1 ml rozcieńczonego enzymu (w 0,02 M roztworze NaCl) w temperaturze +40°C (przez około 5 minut). Dodać 5 ml zrównoważonego substratu kazeinowego, mieszać i inkubować w temperaturze +40°C dokł adnie przez 30 minut. Dodać 5 ml odczynnika strą cają cego i mieszać . Inkubować w temperaturze +40°C dokładnie przez 30 minut i filtrować natychmiast przez filtr papierowy (Whatman 1 lub Macherey Nagel 640 we).

Odmierzyć pipetą 2 ml przesączu, 5 ml 0,55 M roztworu Na2CO3 i 1 ml odczynnika fenolowego. Mieszać i inkubować w temperaturze +40°C przez 30 minut. Ochłodzić do temperatury pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 660 nm wobec wody destylowanej.

2. Ślepa próba enzymatyczna

Zrównoważyć 1 ml rozcieńczonego enzymu (w 0,02 M roztworze NaCl) w temperaturze +40°C (przez około 5 minut). Dodać 5 ml odczynnika strącającego, mieszać i inkubować w temperaturze +40°C dokładnie przez 30 minut. Dodać 5 ml substratu kazeinowego, mieszać i inkubować w temperaturze +40°C dokładnie przez 30 minut. Filtrować natychmiast przez filtr papierowy (Whatman 1 lub Macherey Nagel 640 we).

Traktować przesącz jak próbkę enzymatyczną

Różnica absorbancji między próbką enzymatyczną i ślepą enzymatyczną powinna wynosić 0,2-0,5.

3. Krzywa standardowa

Sporządzić roztwór wyjściowy tyrozyny przez odważenie 10 mg L-tyrozyny do kolby wolumetrycznej, rozpuszczenie w 0,02 M roztworze NaCl i dopełnienie do 100 ml 0,02 M roztworem NaCl.

Sporządzić rozcieńczenia wyjściowego roztworu tyrozyny w 0,02 M roztworze NaCl, w następujący sposób:

1:50 = 2 μg/ml

1:20 = 5 μg/ml

1:10 = 10 μg/ml

1:5 = 20 μg/ml

1:3 = 33 μg/ml

1:2 = 50 μg/ml

Odmierzyć pipetą 2 ml każdego rozcieńczenia tyrozyny, 5 ml 0,55 M roztworu Na2CO3 i 1 ml odczynnika fenolowego. Mieszać i inkubować w temperaturze +40°C przez 30 minut. Ochłodzić do temperatury pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 66 0 nm wobec wody destylowanej.

Nanieść stężenie tyrozyny jako funkcję absorbancji.

Obliczenia

Aktywność proteazową próbki oblicza się zgodnie z następującym równaniem:

₌ [A(X) - A(O) x k xFxDf

Aktywność (U/g) = ^{1 v} gdzie:

A(X) = absorbancja próbki enzymatycznej

A(O) = absorbancja ślepej enzymatycznej k = nachylenie krzywej standardowej

PL 203 144 B1

F = czynnik reakcji rozcieńczenia (=11)

Df = czynnik rozcieńczenia (ml/g) t = czas reakcji (30 minut)

Metoda testu aktywności ksylanazowej

Jedna jednostka aktywności ksylanazowej jest to ilość enzymu, jaka uwalnia jeden μmol cukrów redukujących (wyrażony jako równoważniki ksylozy) z substratu, w ciągu jednej minuty, w opisanych warunkach.

Odczynniki 1. 1% (ciężar/objętość) substratu ksylanowego

Dodać 10 ml 0,5 M wodorotlenku sodu do 1,0 g ksylanu (Fluka 95590). Mieszać przez 30 minut za pomocą mieszadła magnetycznego. Dodać około 40 ml 0,05 M buforu octanu sodu, pH 5,3. Wyregulować pH do 5,3 za pomocą 1 M kwasu octowego. Dopełnić do 100 ml 0,05 M buforem octanu sodu, pH 5,3. Substrat powinien być mieszany przez cały czas stosowania.

2. 1 M kwas octowy

Odmierzyć pipetą 5,7 ml lodowatego kwasu octowego do kolby wolumetrycznej i dopełnić do 100 ml wodą destylowaną.

3. 0,05 M bufor octanu sodu, pH 5,3

A. Rozpuścić 4,1 g octanu sodu w wodzie destylowanej i dopełnić do 1000 ml wodą destylowaną.

B. Rozpuścić 3,0 g lodowatego kwasu octowego w wodzie destylowanej i dopełnić do 1000 ml wodą destylowaną.

Wyregulować pH roztworu do pH 5,3 za pomocą roztworu B.

4. Odczynnik kwasu dinitrosalicylowego (DNS)

Zawiesić 20,0 g kwasu 3,5-dinitrosalicylowego w około 800 ml wody destylowanej. Stopniowo dodawać 300 ml roztworu wodorotlenku sodu (32,0 g NaOH w 300 ml wody destylowanej) podczas ciągłego mieszania. Ogrzać zawiesinę w kąpieli wodnej (temperatura nie może przekroczyć +48°C) przy mieszaniu aż do wyklarowania roztworu. Stopniowo dodawać 600 g winianu potasowo-sodowego. Ogrzewać roztwór (temperatura nie może przekroczyć +48°C) jeśli trzeba, aż do wyklarowania roztworu.

Dopełnić do 2000 ml wodą destylowaną i filtrować przez filtr z szorstkiego szkła spiekanego.

Przechowywać w ciemnej butelce w temperaturze pokojowej. Odczynnik jest stabilny przez maksymalnie 6 miesięcy.

Procedura Próbka enzymatyczna ml rozcieńczenia enzymu (w 0,05 M buforze octanu sodu, pH 5,3) równoważy się w temperaturze +50°C. Dodać 1 ml substratu ksylanowego, mieszać i inkubować w temperaturze +50°C przez dokładnie 30 minut. Dodać 3 ml odczynnika DNS, mieszać i gotować mieszaninę reakcyjną przez dokładnie 5 minut. Ochłodzić mieszaninę reakcyjną w zimnej wodzie do temperatury pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 540 nm wobec wody destylowanej.

2. Ślepa próba enzymatyczna

Inkubować 1 ml substratu ksylanowego w temperaturze +50°C przez 30 minut. Dodać 3 ml roztworu DNS i mieszać. Dodać 1 ml rozcieńczonego enzymu (w 0,05 M buforze octanu sodu, pH 5,3) i mieszać. Gotować mieszaninę przez dokładnie 5 minut. Ochłodzić mieszaninę reakcyjną w zimnej kąpieli wodnej do temperatury pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 540 nm wobec wody destylowanej.

Różnica absorbancji między próbką enzymatyczną i ślepą enzymatyczną, powinna wynosić 0,3-0,5.

3. Krzywa standardowa

Sporządzić roztwory standardowe z bezwodnej ksylozy w 0,05 M buforze octanu sodu, pH 5,3. Stężenie ksylozy w standardach powinno wynosić 0,05-0,5 mg/ml. Odmierzyć pipetą 1 ml roztworu standardowego, 1 ml substratu ksylanowego i 3 ml odczynnika DNS do probówki testowej. Mieszać i gotować dokładnie przez 5 minut. Ochłodzić w kąpieli z zimną wodą do temperatury pokojowej i zmierzyć absorbancję przy 540 nm wobec ślepej standardowej. W ślepej standardowej, roztwór ksylozy jest zastąpiony 1 ml 0,05 M buforu octanu sodu, pH 5,3. Poza tym ślepa standardowa jest traktowana jak standard ksylozowy.

Nanieść stężenie ksylozy jako funkcję absorbancji, Nową krzywą standardową sporządza się dla każdego nowego odczynnika DNS.

Obliczenia aktywności ksylanazowej w próbce oblicza się zgodnie z następującym równaniem:

Aktywność (U/g) = ^{([A(X)- A(O)]xk} + Co^)1000xDf

MWksyl x t gdzie:

PL 203 144 B1

A(X) = absorbancja próbki enzymatycznej

A(O) = absorbancja ślepej enzymatycznej k = nachylenie krzywej standardowej

Co = punkt przecięcia krzywej standardowej ksylozy

1000 = współczynnik, mmol-^mol

Df = współczynnik rozcieńczenia

MWksyl = ciężar cząsteczkowy ksylozy (150,13 mg/mmol) t = czas reakcji (30 minut)

Metoda testowa aktywności α-amylazy

Jedna jednostka aktywności α-amylazowej katalizuje jeden mikromol hydrolizy wiązań glikozydowych w ciągu jednej minuty, w opisanych warunkach.

Odczynniki 1. Substrat

Jako substrat, stosuje się tabletkę Phadebas Amylase Test do stosowania diagnostycznego in vitro (Pharmacia Diagnostics). Wykonuje się tabliczki w wodzie destylowanej, z nierozpuszczalnego polimeru błękitnej skrobi, albuminy surowicy bydlęcej oraz buforu.

2. Roztwór odczynnika

Rozcieńczyć 9,0 g chlorku sodu, 2,0 g albuminy surowicy bydlęcej i 2,2 g chlorku sodu w wodzie destylowanej, w kolbie wolumetrycznej i dopełnić do 1000 ml wodą destylowaną.

3. Roztwór 0,5 M NaOH

Rozpuścić 20,0 g wodorotlenku sodu w wodzie destylowanej, w kolbie wolumetrycznej i dopełnić wodą destylowaną do 1000 ml.

4. Filtr papierowy

Mecherey Nagel 640 mn lub równy.

Procedura 1. Próbka enzymatyczna

Odmierzyć pipetą 200 μl odpowiedniego rozcieńczonego enzymu w roztworze odczynnika i 4,0 ml roztworu odczynnika, do rurki testowej. Zrównoważyć w temperaturze +37°C przez 5 minut. Dodać tabletkę substratu pensetą i mieszać dobrze przez 10 sekund. Inkubować w temperaturze +37°C dokładnie przez 15 minut. Czas reakcji rozpoczyna się wraz z dodaniem tabletki. Dodać 1,0 ml 0,5 M roztworu NaOH i dobrze wymieszać. Filtrować lub wirować z prędkością 3500 obrotów na minutę przez 10 minut i zmierzyć absorbancję wobec ślepej odczynnikowej odczynnikowi przy 620 nm.

Absorbancja próbki enzymatycznej powinna wynosić 0,3-0,5.

2. Ślepa odczynnikowa

Zrównoważyć 4,2 ml roztworu odczynnika w temperaturze +37°C przez 35 minut. Dodać tabletkę substratu pensetą i dobrze mieszać przez 10 sekund. Inkubować w temperaturze +37°C dokładnie przez 5 minut. Dodać 1,0 ml 0,5 M roztworu NaOH, dobrze wymieszać, sączyć lub wirować z prędkością 3500 obrotów na minutę przez 10 minut.

Obliczenia

Absorbancja próbki jest proporcjonalna do aktywności α-amylazy. Aktywność α-amylazy rozcieńczenia enzymu odczytuje się z tabliczki załączonej w zestawie z tabletkami. Dla każdego wsadu kąpieli tabletki dostarczona jest skalibrowana tabliczka.

Aktywność α-amylazową próbki oblicza się następująco:

Aktywność (U/g) = ^{Act x} D^f1000 gdzie:

Act = wartość aktywności α-amylazowej (wyrażona w U/l) rozcieńczenia enzymu, odczytana z tablicy Phadebas Amylase Test

Df = współczynnik rozcieńczenia (ml/g)

1000 = współczynnik, aby przekształcić litry w ml

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem zastosowanie proteazy i betainy do produkcji środka do leczenia i/lub profilaktyki kokcydiozy. Środek ten, może dodatkowo korzystnie obejmować ksylanazę i ewentualnie α-amylazę.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku środek występuje w postaci paszy dla zwierząt, która może korzystnie zawierać także 0,01-20 g betainy na kg paszy.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku ilość proteazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności proteazowej na kg paszy, ilość ksylanazy obecnej w paszy odpowiada

PL 203 144 B1

100-100000 jednostkom aktywności ksylanazowej na kg paszy, a ilość α-amylazy obecnej w paszy odpowiada korzystnie 10-100000 jednostkom aktywności α-amylazowej na kg paszy.

Zgodnie z następnym korzystnym aspektem wynalazku, zastosowanie proteazy i betainy służy do produkcji środka do leczenia infekcji Eimeria u zwierzęcia. Środek taki dodatkowo obejmuje ksylanazę, ewentualnie także dodatkowo obejmuje α-amylazę i korzystnie środek występuje w postaci paszy dla zwierząt.

Według tego wynalazku pasza obejmuje 0,01-20 g betainy na kg paszy. Ilość proteazy obecnej w paszy korzystnie odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności proteazowej na kg paszy, a ilość ksylanazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności ksylanazowej na kg paszy, natomiast ilość α-amylazy obecnej w paszy odpowiada 10-100000 jednostkom aktywności α-amylazowej na kg paszy.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie proteazy i betainy jako dodatku paszowego do pobudzania przyrostów wagi u zwierzęcia zakażonego Eimeria.

W tym aspekcie wynalazku, środek dodatkowo obejmuje ksylanazę, ewentualnie środek dodatkowo obejmuje α-amylazę. Środek ten korzystnie może być paszą dla zwierząt, w której znajduje się ponadto 0,01-20 g betainy na kg paszy.

Zgodnie z tym zastosowaniem według wynalazku ilość proteazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności proteazowej na kg paszy, ilość ksylanazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności ksylanazowej na kg paszy, a ilość a-amylazy obecnej w paszy odpowiada 10-100000 jednostkom aktywności α-amylazowej na kg paszy.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie proteazy i betainy do produkcji środka do leczenia i/lub profilaktyki martwicowego zapalenia jelit wynikającego między innymi z infekcji Clostridium perfringens.

W tym zastosowaniu według wynalazku, środek dodatkowo obejmuje ksylanazę i ewentualnie α-amylazę. Korzystnie, środek występuje w postaci paszy dla zwierząt.

W zastosowaniu według wynalazku pasza obejmuje 0,01-20 g betainy na kg paszy. Ilość proteazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności proteazowej na kg paszy, ilość ksylanazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności ksylanazowej na kg paszy, a ilość α-amylazy obecnej w paszy odpowiada 10-100000 jednostkom aktywności α-amylazowej na kg paszy.

Przedmiotem wynalazku jest także dodatek do paszy dla zwierząt, charakteryzujący się tym, że obejmuje proteazę, ksylanazę i betainę. Dodatek może także dodatkowo obejmować α-amylazę.

Przedmiotem wynalazku jest także pasza dla zwierząt, charakteryzująca się tym, że obejmuje dodatek jak zdefiniowano powyżej i co najmniej 25% wagowych zboża.

Krótki opis rysunków

Figura 1 ukazuje graficzne przedstawienie wpływu uzupełnienia paszy zdrowych broilerów, betainą; proteazą; oraz połączeniem betainy i proteazy.

Figura 2 ukazuje graficzne przedstawienie wpływu uzupełnienia paszy broilerów poddanych prowokacji Eimeria maxima, betainą; proteazą; oraz połączeniem betainy i proteazy.

Figura 3 ukazuje (chromatogram żelowy pokazujący obecność genu toksyny C. perfringens w jelicie krętym kurcząt karmionych rozmaicie uzupełnianymi paszami i prowokowanych różnymi patogenami.

W niniejszym opisie znajdują się odniesienia do różnych metodologii, które stanowią powszechną ogólną wiedzę fachowców z dziedziny weterynarii, immunologii i immunopatologii, szczepionek, farmacji zwierzęcej i hodowli zwierząt. Publikacje i inne materiały przedkładające takie znane metodologie, obejmują:

Ogólne zasady nauki weterynaryjnej są przedłożone np. w The Merck Veterinary Manual, wydanie 6, wydane przez Fraser i innych, 1986; the Food and Drug Administration's FDA 1994 Feed Additive Compendium, U.S. Food and Drug Administration, 1994; Trends in Veterinary Research and Development, część 6, Anti-coccidials, wydane przez Lloyd-Evans, L.P.M., PJB Publications Ltd., 1991; Diseases of Poultry, wydane przez B.W. Calnek, Iowa State University Press, Ames, Iowa, 1991.

Ogólne zasady hodowli zwierząt są przedłożone np. w H. Patrick i inni, Poultry: Feeds & Nutrition, wydanie drugie, AVI Publishing Co. Inc., Wesport, Conn. (1980).

Ogólne zasady nauk farmaceutycznych są przedłożone np. w Remington's Pharmaceutical Sciences (18 wydanie, A.R. Gennaro wydawca, Mack Publishing, Easton, Pa. 1990).

PL 203 144 B1

Jak wspomniano powyżej, niniejszy wynalazek zapewnia zastosowanie proteazy i wewnętrznej soli kwasu karboksylowego aminy czwartorzędowej, do produkcji środka do leczenia i/lub profilaktyki kokcydiozy, infekcji bakteryjnej lub martwicowego zapalenia jelita, wynikającego, między innymi, z infekcji Clostridium perfringens. Korzy ś cią stosowania pasz zawierają cych połączenie betainy i proteazy przy hodowli zwierząt, jest to, że można zredukować ilość leków przeciwdrobnoustrojowych, które poprzednio rutynowo wprowadzano do pasz, albo, w pewnych przypadkach, ominąć je całkowicie. W krajach, gdzie takie leki są zakazane, stanowi to nowe podejście do kontrolowania chorób bakteryjnych.

Usunięcie antybiotyków z diety zwierzęcej posiada kilka potencjalnych dodatkowych korzyści. Wcześniej, konieczne było wycofanie antybiotyków z diety zwierząt na pewien czas przed zabiciem w rzeź ni. Daje to pewność, ż e mię so jest wzglę dnie wolne od takich leków, a wi ę c nadaje się do konsumpcji przez ludzi. Przeciwnie, jeśli antybiotyki są całkowicie usunięte z diety zwierząt, co można uzyskać stosując niniejszy wynalazek, wtedy zwierzę może być zabite w każdym czasie, bez określonego okresu wycofywania. Pozwala to na zwiększoną elastyczność farmera i usuwa ryzyko zakażenia zwierząt na krótko przed zabiciem. Ponadto, mięso i jaja mają gwarancję że są wolne od antybiotyków. Takie mięso i jaja mają lepszą jakość rynkową w porównaniu z produktami, które nie mogą być poparte taką gwarancją.

Niniejszy wynalazek posiada także korzyści dla ludzkiego zdrowia. Stosowanie go zmniejsza nacisk selekcji pod względem szczepów bakterii opornych na antybiotyki, przez usunięcie antybiotyków z paszy dla zwierząt. W związku z tym, w jelicie zwierzęcia obecne będą szczepy bardziej wrażliwe na antybiotyki, zapewniając przez to bardziej prawdopodobny wpływ letalny stosowanych antybiotyków, na równoważny stan człowieka.

Dodatek do paszy według niniejszego wynalazku można sporządzić licznymi sposobami. Przykładowo, można go sporządzić przez proste wymieszanie różnych odpowiednich składników, wytwarzając dodatek. Można go zatem mieszać albo bezpośrednio z paszą, albo dogodniej, impregnować materiał nośny na bazie zbóż, taki jak mielona pszenica, kukurydza lub mączka sojowa. Taki impregnowany nośnik stanowi także dodatek paszowy zgodny z czwartym aspektem niniejszego wynalazku.

Dodatek paszowy można mieszać bezpośrednio z paszą dla zwierząt albo alternatywnie, mieszać z jednym lub więcej innych dodatków paszowych, takich jak witaminowy dodatek paszowy, mineralny dodatek paszowy lub aminokwasowy dodatek paszowy. Otrzymany dodatek paszowy obejmujący kilka różnych rodzajów składników, można następnie mieszać w odpowiedniej ilości z paszą. Jest także możliwe włączenie dodatku paszowego w diecie zwierzęcej przez wprowadzenie go do drugiej (i innej) paszy lub wody do picia, do której zwierzę ma dostęp. W związku z tym, nie jest zasadnicze, że dodatek podany w niniejszym wynalazku jest wprowadzony do zwykłej głównej paszy na bazie zbóż, choć takie wprowadzenie stanowi szczególnie korzystny aspekt niniejszego wynalazku.

Dodatek do paszy zapewniony przez niniejszy wynalazek, można opracować jako premiks, razem z wszelkimi innymi enzymami, które chce się wprowadzić. Premiks można dodawać do materiałów wyjściowych przed wyprodukowaniem paszy, podczas produkcji paszy lub jako ostatni etap, po którym pasza jest gotowa do użycia. Można dodawać połączenie soli wewnętrznej i proteazy bezpośrednio do materiału paszowego wstępnie uformowanego w postaci śruty lub paszy gniecionej.

Jeśli dodatek według niniejszego wynalazku jest wprowadzany do paszy dla zwierząt, wtedy pasza powinna zawierać co najmniej 25% wagowych zboża, a korzystnie co najmniej 35% wagowych zboża. Zbożem może być jedno lub więcej spośród pszenicy, kukurydzy, żyta, jęczmienia, owsa, pszenżyta, ryżu i sorga. Szczególnie poleca się, aby zbożem była kukurydza lub pszenica. Jeśli zbożem jest kukurydza, wtedy dodatek lub środek korzystnie dodatkowo obejmuje α-amylazę.

Chociaż składnik zbożowy diety w oparciu o zboża stanowi źródło białka, zwykle konieczne jest wprowadzenie do diety źródeł białka uzupełniającego, takiego jak pochodzące z mączki rybnej, mączki mięsnej lub roślin. Te źródła białka uzupełniającego mogą stanowić do 50% wagowych paszy dla zwierząt. Źródła białka roślinnego obejmują co najmniej jedno spośród pełnotłuszczowej soi, rzepaku, rośliny o nazwie canola, mączki sojowej, mączki rzepakowej i mączki z canoli.

Wewnętrzna sól kwasu karboksylowego aminy czwartorzędowej, ma ogólny wzór strukturalny

2 3 + - 1 2 3

R¹R²R³N⁺-L-COO^- przy czym podstawniki R¹, R² i R³ niezależnie oznaczają każdą grupę organiczną, korzystnie grupy alkilowe, korzystniej grupy alkilowe mające 1-6 atomów węgla, a najkorzystniej wszystkie oznaczają metyl; grupa łącząca -L- oznacza każdą organiczną grupę łączącą, taką jak alkoksyalkil lub alkilen, korzystnie alkilen C1-C6, a najkorzystniej metylen. Przykładami soli wewnętrznej kwasu karboksylowego aminy czwartorzędowej są betaina (Me3N⁺CH2COO^-), Me3N⁺CHMeCOO^-, Et3N⁺CH2COO^-,

PL 203 144 B1

Me2EtN⁺CH2COO^-, Me3N⁺CH2CH2COO^-, Me3N⁺CH2OCH2COO^- oraz Me3N⁺C(CHMe2)HCOO^-. Solą wewnętrzną jest korzystnie betaina, która jest dostępna na rynku od Finnfeeds pod nazwą handlową Betafin®.

Sól wewnętrzna korzystnie wchodzi w skład paszy w ilości wynoszącej 0,01-20 g na kg paszy, korzystniej 0,1-10 g/kg, a najkorzystniej 0,5 do 2 g/kg.

Stosowaną proteazą może być jakakolwiek postać proteazy, jednakże zaleca się stosowanie subtylizyny otrzymanej z Bacillus subtilis, o aktywności nie mniejszej niż 40 000 jednostek/g. Takie subtylizyny są opisane np. w US 4,760,025 A. Proteazą jest zawarta w paszy w takiej ilości, że pasza ma aktywność proteazową odpowiadającą 100 jednostek do 100 000 jednostek na kg paszy, korzystnie 500 jednostek do 10 000 jednostek na kg paszy. Odpowiednie proteazy obejmują, lecz bez ograniczenia, następujące dostępne na rynku proteazy: Novo NEUTRASE (TM) (dostępne na rynku od Novo Nordisk); PURAFECT (TM) (dostępne na rynku od Genencor International, Inc); SAVINASE (TM) (dostępne na rynku od Novo Nordisk); MAXACAL (TM) (dostępne na rynku od Gist-Brocades); DURAZYM (TM) (dostępne na rynku od Novo Nordisk); oraz MAXAPEM (TM) (dostępne na rynku od Gist-Brocades).

W zalecanych postaciach realizacji wynalazku, ś rodek lub dodatek dodatkowo obejmuje ksylanazę. Ksylanazy można otrzymać ze źródeł grzybowych, takich jak Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Neocallimastix lub Thermomyces. Zaleca się, aby ksylanaza była ksylanazą o niskim pI i/lub ksylanazą o wysokim pI możliwą do otrzymania z Trichoderma longibrachatum, takie jak opisane w przykładzie 22 WO 92/06209. Alternatywnie, ksylanazę można także otrzymać z bakterii, takiej jak Bacillus, Streptomyces, Microtetraspora, Clostridium lub Ruminococcus. Możliwe jest także otrzymanie ksylanazy z żywiciela, którego poddano manipulacjom genetycznym, tak jak przez inkluzję odpowiedniego genu do żywicielskiego szczepu bakteryjnego lub grzybowego. Zalecana aktywność ksylanazowa powinna wynosić około 3000 jednostek/g. Ksylanaza z Trichoderma longibrachiatum o minimalnej aktywności wynoszącej 3000 jednostek/g jest dostępna na rynku od Finnfeeds International pod nazwą handlową AVIZYME®. Ksylanaza występuje w paszy w takiej ilości, że pasza ma aktywność ksylanazową odpowiadającą 200 jednostek do 1000 jednostek na kg paszy.

W dodatkowej zalecanej postaci realizacji wynalazku, w ś rodku lub dodatku moż e być takż e obecna α-amylaza, szczególnie w przypadku, gdzie środek lub dodatek ma być zawarty w paszy obejmującej kukurydzę. Chociaż w zakresie wynalazku leży stosowanie jakiejkolwiek postaci α-amylazy, zaleca się stosowanie α-amylazy z Bacillus subtilis o aktywności minimalnej, wynoszącej 4000 jednostek/g. α-amylaza z Bacillus subtilis o aktywności minimalnej, wynoszącej 4000 jednostek/g jest dostępna na rynku od Finnfeeds International pod nazwą handlową AVIZYME®. α-amylaza występuje w paszy w takiej ilości, że pasza ma aktywność α-amylazy odpowiadającą 10 jednostek do 100000 jednostek na kg paszy, korzystnie aktywność wynoszącą 100 jednostek do 4000 jednostek na kg paszy.

Sól wewnętrzną, proteazę i ewentualnie ksylanazę i/lub α-amylazę można wymieszać przed użyciem, lecz można także dodawać do paszy oddzielnie. Połączenie proteazy, ksylanazy i α-amylazy jest dostępne na rynku pod nazwą handlową AVIZYME® 1510 od Finnfeeds International. Dodatkowe połączenie tych enzymów jest dostępne na rynku w postaci suchego premiksu, pod nazwą handlową AVIZYME® 1500. Należy zauważyć, że generalnie nie doradza się przechowywania proteazy razem z innymi białkami przez dłuższy okres czasu, jako że ma ona tendencję do rozkładania tych ostatnich.

Dodatek do paszy według niniejszego wynalazku można stosować wobec wielu różnych zwierząt, lecz stosowanie wynalazku jest szczególnie polecane dla zwierząt domowych i inwentarza gospodarskiego. Zwierzęta, które szczególnie mogą skorzystać z wynalazku, obejmują drób (tak jak kurczęta, indyki, kaczki i gęsi), przeżuwacze (tak jak bydło mleczne, konie i owce), trzoda (świnie), gryzonie (tak jak króliki) oraz ryby. Wynalazek jest szczególnie użyteczny dla broilerów.

Zgodnie z wynalazkiem, skuteczne poziomy dodatku według niniejszego wynalazku mogą być podawane w celu, zmniejszenia szkodliwego wpływu jakiegokolwiek patogenu indukującego kokcydiozę, a zwłaszcza jakiegokolwiek gatunku Eimeria, włączając np. gatunki Eimeria necatrix, galloparvonis, meleagrimitis, innocua, meleagridis, subrotunda, despersa, truncata, acervulina, brunetti, maxima, mitis, praecox i tenella. Bardziej szczegółowo, dodatek pobudza przyrosty wagowe zwierzęcia zakażonego Eimeria.

Zgodnie z wynalazkiem, można podawać skuteczne ilości dodatku według niniejszego wynalazku, który zmniejsza szkodliwy wpływ u drobiu, spowodowany zakażeniem gatunkiem Eimeria, zwłaszcza gatunkami Eimeria E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox i E. tenella.

PL 203 144 B1

Zgodnie z wynalazkiem, można podawać skuteczne ilości dodatku według niniejszego wynalazku, który zmniejsza szkodliwy wpływ indukowany u owiec po zakażeniu członkiem grupy gatunków Eimeria, włączając gatunki Eimeria arloingi A (ovina), weybridgensis (arlongis B), crandallis, ahsata, ovinoidalis, gilruthi.

Zgodnie z wynalazkiem, można podawać skuteczne poziomy dodatku według niniejszego wynalazku, który skutecznie zmniejsza szkodliwy wpływ indukowany u kóz po zakażeniu członkiem grupy gatunków Eimeria, włączając np. immunizację gatunkiem Eimeria arloingi, faurei, caproina, ninakohlyakimovae, christenseni.

Zgodnie z wynalazkiem, można podawać skuteczne poziomy dodatku według niniejszego wynalazku, który zmniejsza szkodliwy wpływ indukowany u świń po zakażeniu gatunkami Eimeria, włączając np. immunizację gatunkami Eimeria debliecki, scabra, penninuta; oraz włączając szkodliwy wpływ indukowany przez członka grupy gatunków Isospora, np. Isospora suis.

Zgodnie z wynalazkiem, można podawać skuteczne poziomy dodatku według niniejszego wynalazku, który skutecznie zmniejsza szkodliwy wpływ na drób wywołany zakażeniem bakteriami, takimi jak Clostridium, Salmonella, Campylobacter, E. coli, Listeria, a zwłaszcza Clostridium perfringens, Salmonella enteritidis oraz Campylobacter jejuni. Jako, że Clostridium perfringens jest jednym z głównych przyczyn powstawania martwicowego zapalenia jelita, dodatek odżywczy można w związku z tym stosować do sporzą dzania ś rodka do leczenia i/lub profilaktyki martwicowego zapalenia jelit.

W celu kontrolowania czasu trwania działania, można wykorzystać dodatkowe metody farmaceutyczne. Kontrolowane dostarczanie można uzyskać przez wybór odpowiednich makrocząsteczek, takich jak poliestry, poliaminokwasy, polipirolidon, etylenowinylooctan, metyloceluloza, karboksymetyloceluloza lub siarczan protaminy oraz łączenie ich, zgodnie z dobrze ustalonymi procedurami, w celu kontroli uwalniania. Czas trwania działania soli wewnętrznej i proteazy można także kontrolować przez wprowadzenie tych środków do cząstek materiałów polimerowych, takich jak poliestry, poliaminokwasy, hydrożele kwas polimlekowy lub kopolimery etylenu i winylooctanu. Alternatywnie, sól wewnętrzną i proteazę można opracować w mikrokapsułkach. Różne materiały i metody wykonania i stosowania mikrokapsułek, są opisane w Remington's Pharmaceutical Science (16 wydanie, A. Oslow, wydawca, Mack, Easton, Pa, 1980).

Oprócz postaci realizacji wynalazku, w której sposobem podawania zwierzętom wewnętrznej soli i proteazy jest postać paszy dietetycznej dla zwierząt, niniejszy wynalazek dodatkowo ukazuje zastosowanie innych kompozycji zawierających sól wewnętrzną i proteazę, które można podawać równocześnie z jakąkolwiek żądaną kompozycją, włączając wszystkie szczepionki, odżywki czy leki.

P r z y k ł a d y w y k o n a n i a w y n a l a z k u

P r z y k ł a d 1

Następujący przykład ilustruje wpływ wprowadzenia dodatku paszowego według niniejszego wynalazku do paszy zdrowych zwierząt, jak również do produkcji środka do leczenia infekcji Eimeria.

(a) Procedura generalna:

kurcząt broilerów (Ross 208) dzieli się na cztery oddzielne grupy, każda po 24 zwierzęta. Karmienie paszą rozpoczęto w dniu 0 i ptaki poddano prowokacji Eimeria maxima w dniu 14. Taką prowokację wykonano przez wszczepienie oocyst E. acervulina i E. maxima do wola kurcząt, w 2 ml objętości wody z kranu. Dawka na ptaka wynosiła 100 000 oocyst E. acervulina i 50 000 oocyst E. maxima. Te dwa gatunki Eimeria ulegają przestrzennej segregacji w jelicie: E. acervulina zakaża dwunastnicę i górne jelito czcze, podczas gdy E. maxima preferuje środkową część jelita cienkiego: od dalszej części jelita czczego do środkowej części jelita krętego. Ptaki trzymywano w klatkach w dniach 0-14 i otwartych kojcach wysłanych wiórami drewnianymi, w dniach 14-21.

Pasza dostarczana ptakom była na bazie kukurydzy i soi, bez kokcydiostatyków. Pokarm był prasowany na zimno, w małe kruche kulki o średnicy około 5 mm. Pasza początkowa była stosowana w dniach 0-14, a pasza koń cowa w dniach 14-21. Dodatki rozpryskiwano na kulkach paszy, gdzie stwierdzono taką potrzebę, za pomocą wodnego roztworu betainy (w dawce 1 g na kg paszy) oraz wodnego roztworu AVIZYME® 1510, który obejmuje około 300 jednostek/g ksylanazy, 4000 jednostek/g proteazy i 400 jednostek/g α-amylazy dostępnych od Finnfeeds International, w dawce 1 g/kg paszy.

Skład stosowanych pasz był następujący:

PL 203 144 B1

Pasza kukurydziano-sojowa

Składniki	Pasza początkowa	Pasza końcowa
1	2	3
Kukurydza	60,81%	61,09%
Mączka rybna 65 tłuszczu	0,50%	0,50%
Mączka sojowa 48	33,38%	30,18%
Olej sojowy	1,09%	4,18%
Sól	0,39%	0,32%
Wodorowęglan sodu	0,01%	0,00%
D L Metionina	0,18%	0,10%
Wapień	1,11%	1,17%
Fosforan diwapniowy	1,53%	1,46%
Mieszanka witamin+minerałów	1,00%	1,00%
Całość	100,00%	100,00%

Skład odżywczy tych pasz był następujący:

Składniki odżywcze	Pasza początkowa	Pasza końcowa
Białko surowe%	21,5	20
Poult M E kcal/kg	2975	3175
Pig D E Kcal	3377,25	3500,69
Wapń%	0,9	0,9
Fosfor%	0,7	0,67
Dostępny fosfor%	0,42	0,4
Tłuszcz%	3,92	6,85
Włókno%	2,59	2,49
Met%	0,52	0,542

Składniki odżywcze	Pasza początkowa	Pasza końcowa
1	2	3
Cys%	0,36	0,34
Met+Cys%	0,88	0,76
Lys%	1,17	1,07
His%	0,58	0,54
T ryp%	0,25	0,23
Thr%	0,83	0,77
Arg%	1,44	1,33
Iso%	0,92	0,85
Leu%	1,9	1,79
Phe%	1,06	0,98
Tyr%	0,79	0,73

PL 203 144 B1

c.d. tabeli

1	2	3
Val%	1,01	0,94
Gly%	0,89	0,83
Phe+Tyr%	1,84	1,72
Na%	0,18	0,15
Cl%	0,29	0,24
K%	0,92	0,85
Kwas linolenowy%	1,64	2,86
Na+K-Cl (milirównoważnik/kg)	232,46	214,64
D U A (milirównoważnik/kg)	439,53	436,23
Magnez%	0,2	0,18

(b) Wyniki

Ciężar ptaków mierzono tuż przed prowokacją Eimeria maxima w dniu 14. Tablica 1 ukazuje, że stosowanie połączenia betainy i proteazy powoduje zwiększenie przyrostów w porównaniu z indywidualnym dodawaniem składników do paszy.

T a b l i c a 1

Grupa	Dieta	Średni ciężar (g)
A	Kontrolna (pasza nieuzupełniona)	422
B	Pasza uzupełniona betainą (porównawcza)	418
C	Pasza uzupełniona proteazą (porównawcza)	431
D	Pasza uzupełniona betainą i proteazą (wynalazek)	442

Wyniki z tablicy 1 są przedstawione graficznie w fig. 1.

Ciężary ptaków zmierzono ponownie w dniu 21, czyli po okresie 7 dni po prowokacji Eimeria. Wyniki omówiono w tablicy 2. Obserwuje się poprawę przyrostów wagowych dla grupy D w porównaniu z grupami B i C, w których pasze są uzupełnione albo betainą albo proteazą. Znowu, połączenie tych dwóch składników prowadzi do poprawy, która jest większa niż suma wpływów poszczególnych składników.

T a b l i c a 2

Grupa (dieta jak w tablicy 1)	Średni ciężar (g)
A	651
B	644
C	665
D	690

Wyniki wyszczególnione w tablicy 2 są przedstawione graficznie w fig. 2.

P r z y k ł a d 2

W tym przykładzie prześledzono aktywność połączenia betainy i proteazy użytych w przykładzie 1 wobec zakażenia Clostridium perfringens. Stosowaną paszą była Finisher Feed jaką opisano w przykładzie 1.

PL 203 144 B1 (a) Procedura generalna:

kurcząt, każde w wieku 21 dni, podzielono na 3 oddzielne grupy, E, F i G, każda po 4 ptaki. Grupę E poddano prowokacji Eimeria maxima, grupę F prowokacji Clostridium perfringens, a grupę G równoczesnej podwójnej prowokacji Eimeria i Clostridium perfringens. Gen α-toksyny C. perfringens wykrywano z całkowitego DNA drobnoustroju, w następujący sposób: całkowity DNA drobnoustroju z kątnicy poddano PCR z użyciem primerów zaplanowanych zgodnie ze znaną sekwencją nukleotydową genu α-toksyny C. perfringens. Sekwencja primerów α-toksyny i warunki przeprowadzania reakcji PCR są opisane przez Songer i de Meer w Am.J.Vet.Res lipiec 1997; 58(7), strony 702-705.

(b) Wyniki

Intensywny prążek w torze 3 żelu, ukazany w fig. 3, wskazuje obecność genu α-toksyny endogenicznego C. perfringens u zwierzęcia. Brak takich prążków w torach 2 i 4 ukazuje, że prowokacja Eimeria jest zasadniczym wstępnym wymogiem dla występowania infekcji C. perfringens. Bez wiązania się z jakąkolwiek teorią, uważa się, że prowokacja Eimeria zmniejsza normalny poziom proteazy w jelicie, który następnie zmniejsza wychwyt składników odżywczych w górnych regionach jelita i powoduje zwiększenie poziomu białka (a więc poprawę warunków wzrostu dla C. perfringens) w jelicie krętym. Dodatkowym aspektem, który może być znaczący, jest wpływ prowokacji Eimeria na układ odpornościowy zwierzęcia żywicielskiego. Jest prawdopodobne, że odpowiedź immunologiczna wobec prowokacji C. perfringens jest osłabiona, gdy układ odpornościowy jest już wstępnie zajęty prowokacją Eimeria.

Porównanie torów 6 i 7 w fig. 3 ukazuje, że prążek, który jest wskaźnikiem genu α-toksyny C. perfringens, jest obserwowany jedynie dla traktowania samą proteazą (tor 6), lecz nie dla połączonego stosowania betainy i proteazy (tor 7). Ponadto, jest powszechnie wiadomo w technice, że betaina jako taka nie jest skuteczna przy prowokacji C. perfringens. Tak więc, można wywnioskować, że połączenie betainy i proteazy jest skuteczne przeciwko infekcji C. perfringens, podczas gdy użycie proteazy lub betainy indywidualnie nie daje w wyniku skutecznego leczenia infekcji Clostridium.

Claims

1. Zastosowanie proteazy i betainy do produkcji środka do leczenia i/lub profilaktyki kokcydiozy.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że środek dodatkowo obejmuje ksylanazę.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że środek dodatkowo obejmuje α-amylazę.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że środek występuje w postaci paszy dla zwierząt.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że pasza obejmuje 0,01-20 g betainy na kg paszy.

6. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że ilość proteazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności proteazowej na kg paszy.

7. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że ilość ksylanazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności ksylanazowej na kg paszy.

8. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że ilość α-amylazy obecnej w paszy odpowiada 10-100000 jednostkom aktywności α-amylazowej na kg paszy.

9. Zastosowanie proteazy i betainy do produkcji środka do leczenia infekcji Eimeria u zwierzęcia.

10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że środek dodatkowo obejmuje ksylanazę.

11. Zastosowanie według zastrz. 9 albo 10, znamienne tym, że środek dodatkowo obejmuje α-amylazę.

12. Zastosowanie według zastrz. 11, znamienne tym, że środek występuje w postaci paszy dla zwierząt.

13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że pasza obejmuje 0,01-20 g betainy na kg paszy.

14. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że ilość proteazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności proteazowej na kg paszy.

15. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że ilość ksylanazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności ksylanazowej na kg paszy.

PL 203 144 B1

16. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że ilość α-amylazy obecnej w paszy odpowiada 10-100000 jednostkom aktywności α-amylazowej na kg paszy.

17. Zastosowanie proteazy i betainy jako dodatku paszowego do pobudzania przyrostów wagi u zwierzęcia zakażonego Eimeria.

18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że środek dodatkowo obejmuje ksylanazę.

19. Zastosowanie według zastrz. 17 albo 18, znamienne tym, że środek dodatkowo obejmuje α-amylazę.

20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że środek występuje w postaci paszy dla zwierząt.

21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że pasza obejmuje 0,01-20 g betainy na kg paszy.

22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że ilość proteazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności proteazowej na kg paszy.

23. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że ilość ksylanazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności ksylanazowej na kg paszy.

24. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że ilość α-amylazy obecnej w paszy odpowiada 10-100000 jednostkom aktywności α-amylazowej na kg paszy.

25. Zastosowanie proteazy i betainy do produkcji środka do leczenia i/lub profilaktyki martwicowego zapalenia jelit wynikającego między innymi z infekcji Clostridium perfringens.

26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że środek dodatkowo obejmuje ksylanazę.

27. Zastosowanie według zastrz. 25 albo 26, znamienne tym, że środek dodatkowo obejmuje α-amylazę.

28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że środek występuje w postaci paszy dla zwierząt.

29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że pasza obejmuje 0,01-20 g betainy na kg paszy.

30. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że ilość proteazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności proteazowej na kg paszy.

31. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że ilość ksylanazy obecnej w paszy odpowiada 100-100000 jednostkom aktywności ksylanazowej na kg paszy.

32. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że ilość α-amylazy obecnej w paszy odpowiada 10-100000 jednostkom aktywności α-amylazowej na kg paszy.

33. Dodatek do paszy dla zwierząt, znamienny tym, że obejmuje proteazę, ksylanazę i betainę.

34. Dodatek do paszy dla zwierząt według zastrz. 33, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje α-amylazę.

35. Pasza dla zwierząt, znamienna tym, że obejmuje dodatek jak zdefiniowano w zastrz. 33 i co najmniej 25% wagowych zboża.