ES2204740T3 - Aditivo para piensos para animales. - Google Patents
Aditivo para piensos para animales.Info
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Abstract
Utilización de proteasa y una sal interna de un ácido carboxílico de amina cuaternaria para la fabricación de un agente para el tratamiento y/o profilaxis de coccidiosis.
Description
Aditivo para piensos para animales.
La presente invención se refiere a un aditivo
para piensos para animales y en particular, a un aditivo que mejora
la ganancia de peso de un animal alimentado con un pienso en el que
se incorpora. Se refiere además a un aditivo útil para el
tratamiento y/o profilaxis de la coccidiosis y/o una infección
bacteriana que incluye las que pueden tener como resultado enteritis
necrótica.
La cría de diferentes tipos de animales es
importante en todo el mundo para la producción de alimentos para el
consumo humano. Durante la cría de los animales, éstos pueden
establecer contacto con una serie de bacterias que provocan
infecciones y parásitos, tales como Eimeria,
Campylobacter, Clostridium, Salmonella,
E.coli y Listeria.
La coccidiosis es una causa común de enfermedades
en ganado en cría intensiva de granjas, particularmente averío. La
coccidiosis es provocada por protozoos, un parásito monocelular del
subfilo Apicomplexa. Muchas de las especies que provocan la
enfermedad en animales domésticos pertenecen al género
Eimeria. Los parásitos se multiplican en el epitelio del
intestino. En los pollos, siete especies de Eimeria han sido
identificadas, cinco de las cuales se consideran patógenas. Éstas
son E. acervulina, E. maxima, E. necratix, E. tenella y E.
brunetti.
Los coccidios son organismos omnipresentes y son
en general endémicos, siempre que se crían pollos. Las
manifestaciones de la enfermedad pueden variar entre grave y muy
suaves. Tal como muchos protozoos parásitos, el ciclo de vida de
Eimeria es relativamente complejo. La multiplicación sexual y
asexual tiene lugar dentro del intestino de los pollos. Durante este
proceso de multiplicación y desarrollo del parásito, el tejido
hospedante es destruido, lo que conduce a diferentes manifestaciones
clínicas observadas en los accesos de coccidiosis. Los oocistos
producidos y excretados se desarrollan adicionalmente en el exterior
del animal hospedante donde pueden desarrollarse adicionalmente e
infectar a otros pollos. Los oocistos pueden en realidad sobrevivir
fuera del animal hospedante durante un largo período de tiempo, lo
que posibilita que infecten a otras aves, incluso después de la
retirada del animal hospedante inicialmente afectado. También se
pueden extender entre grupos de otros agentes, incluyendo personas,
animales domésticos, insectos, roedores, polvo y otras aves.
Los oocistos esporulados contienen cuatro
esporocistos, cada uno de los cuales contiene dos esporozoitos.
Estos esporozoitos son liberados por acción mecánica y enzimática en
el tubo digestivo del pollo. Esto posibilita que invadan las células
epiteliales del intestino o cecal, dependiendo de la especie de
Eimera involucrada.
Si bien existen diferencias en la patogenicidad
entre especies y cepas de Eimeria, los síntomas mostrados por
un animal infectado pueden ser uno o varios de los siguientes:
hemorragias sanguíneas, elevada mortalidad, letargo general,
emaciación, reducción notable en el consumo de alimentos, diarrea y
disminución de la producción de huevos. Se ha estimado que la
coccidiasis es responsable probablemente de 6-10% de
la mortalidad no deseada en grupos de aves. Adicionalmente, los
incrementos de enfermedades de tipo subclínico aumentan las
proporciones de conversión alimenticia (FCR) y reducen el
rendimiento. De acuerdo con ello, las consecuencias económicas de
esta enfermedad son considerables y muy poco deseables.
Se han investigado diferentes métodos para
combatir la coccidiosis. Se han realizado intentos de controlar la
enfermedad por estrategias de control basadas en elevadas normas de
higiene, junto con la utilización de desinfectantes químicos en el
medio ambiente de las aves. No obstante, incluso en escrupulosas
condiciones higiénicas, no se ha observado que fuera posible
erradicar la coccidiosis, si bien dichas medidas se observaron que
reducían la presión de la infección inicial en una granja de aves.
Las vacunas vivas y atenuadas han sido investigadas como métodos de
control, pero éstas son relativamente caras y tienden a reducir las
tasas de crecimiento de animales como resultado de su acción.
En la actualidad, la coccidiasis en las aves se
controla de manera rutinaria por la utilización de programas de
medicamentos anticoccidianos preventivos que son costosos. Estos
programas intentan restringir las infecciones de coccidios,
limitando de esta manera los efectos de accesos subclínicos de la
enfermedad. Esto se consigue habitualmente por la inclusión
continuada de agentes anticoccídicos en el pienso, desde el inicio
de la vida del grupo de animales hasta poco tiempo antes de la
matanza para los pollos de consumo o por extracción controlada para
las ponedoras. Al principio de su desarrollo, estos agentes fueron
utilizados individualmente. Esto obtuvo como resultado
frecuentemente cepas de parásitos que desarrollaban resistencia al
medicamento. En la actualidad, se intenta controlar la coccidiosis
por la introducción continuada de nuevos medicamentos o por la
utilización de programas medicamentosos que comportan la utilización
con rotación de agentes anticoccídicos de diferentes estructuras
bioquímicas durante el período de crecimiento (programas lanzadera o
"shuttle") o a intervalos frecuentes (programas de rotación). A
pesar de la utilización rutinaria de agentes anti coccidiosis en
alimentos para aves, la coccidiosis subclínica se encuentra todavía
en la mayor parte de granjas de aves.
Las sales internas de amina cuaternaria de ácidos
carboxílicos funcionan como osmoprotectores. Estas sales aumentan la
resistencia osmótica de las células sin afectar de forma adversa la
actividad enzimática y protegen las enzimas contra inactivación
iónica o por temperatura (Nash y otros, Aust. J. Plant Physiol.
9:47-57 (1.982); Yancey y otros, Science
224:1064-1069 (1982); Rudolph y otros, Archives
Biochem. Biophys. 245:134-143 (1986); McCue &
Hanson, Trends in Biotechnology 8:358-362 (1990);
Papageorgiou y otros, Curr. Res. In Photosynthesis
1:957-960 (1990)). Si bien algunos organismos (y
tejidos) pueden acumular sales internas, tales como betaína en
elevadas cantidades, en condiciones de estrés osmótico, a través de
síntesis osmóticamente inducida, la mayor parte de animales carecen
de esta capacidad y dependen de la toma de sales internas exógenas.
Por ejemplo, los mitocondrios de hígado de salmón aislados, cuando
se exponen a estrés osmótico, muestran una absorción incrementada de
betaína, pero no muestran síntesis (Bjorkoy, G., Synthesis and
Accumulation of glycine betaine in Salmon (Salmo salar) and Mussels,
MSc thesis, Norwegian College of Fisheries, University of Tromso,
pp.94).
La utilización de betaína para el tratamiento de
la coccidiosis se da a conocer en la patente US 5.834.473. La
utilización combinada de betaína y de un cocciodiostato con la misma
finalidad, es el objetivo de la patente WO 94/24886. La patente
europea EP-A-0 681 787 sugiere la
utilización de enzimas, tales como proteasa y/o una carbohidrasa
para el tratamiento y/o prevención de la coccidiosis.
La patente GB-A-2
327 345 da a conocer que las infecciones bacterianas en el íleo de
aves pueden ser tratadas con incorporación de enzimas en el pienso
para los animales, lo que favorece la digestión del pienso. Estas
enzimas fraccionan los polisacáridos presentes en el componente
cereal del pienso, formando oligosacáridos que se utilizan como
fuente alimenticia por microorganismos beneficiosos para el animal
principal, que se encuentran presentes en la masa interna el animal.
Como consecuencia de esta proliferación, las bacterias patógenas no
pueden prosperar debido al proceso de exclusión competitiva. Esta
estrategia es en general más eficaz cuando la calidad del alimento
es baja (Classen y otros, Proc. 2^{nd} Eur.Symp. on Feed Enzymes,
1995, 65; Pack and Bedford, Poultry International, 1998, 43).
Las patentes japonesas
JP-A-01 238538 y
JP-A-01 132533 indican la
utilización combinada de betaína y diferentes enzimas para mejorar
la función digestiva de los animales. No obstante, ninguno de estos
documentos sugiere la utilización de dichas combinaciones para
tratamiento o prevención de coccidiosis o de infecciones bacterianas
o para ayudar a mantener la tasa de crecimiento de animales
sometidos a la acción de coccidios.
Una de las enfermedades más problemáticas en las
aves es la enteritis necrótica provocada por Clostridium
perfringens. Las infecciones por Clostridium son
precedidas habitualmente por coccidiosis. La coccidiosis compromete
la respuesta inmune del animal, de manera que éste es menos capaz de
responder cuando después queda expuesto a una infección bacteriana.
No obstante, otros factores tales como estrés, exceso de aves en la
explotación o saturación de desperdicios, pueden también contribuir
a ello. La enteritis necrótica es tratada habitualmente
suplementando el pienso de los animales con bacitracina de zinc
soluble en agua, virginamicina o bien penicilina.
En la descripción siguiente y reivindicaciones se
hace referencia a unidades de actividad de proteasa, unidad de
actividad de xilanasa y unidades de actividad de
\alpha-amilasa. Estas actividades en una premezcla
enzimática o mezcla de enzimas de tipo líquido se ensayan del modo
siguiente.
Una unidad de actividad de proteasa es la
cantidad de encima que libera del sustrato un microgramo de
compuesto fenólico (expresado como equivalentes de tirosina) por
minuto en las condiciones que se describen.
Se pesan 0,6 gr de caseina Hammarsten (Merck
2242) seca en un matraz de 200 ml. Se humedece con una pequeña
cantidad de agua destilada (unos 5 ml). Cuando la caseina ha quedado
completamente humedecida, se añaden 20 ml de una solución de
bifosfato disódico 0,2 M. Se calienta la mezcla a +60ºC con
agitación, hasta que la caseina se disuelve y se obtiene una
solución opalina. Se añaden 60 ml de agua destilada y si es
necesario 1-2 gotas de octil alcohol (agente
antiespuma; se pueden utilizar productos similares). Después de
enfriar a temperatura ambiente se ajusta el pH a 7,5 con hidróxido
sódico 0,5 M y ácido láctico 1 M. Se transfiere la solución a un
matraz volumétrico y se llena hasta 100 ml con agua destilada.
La solución del substrato es utilizable durante
una semana si se almacena en un recinto frío.
Se disuelven 17,80 gr de bifosfato disódico
dihidratado en agua destilada y se llena hasta 500 ml con agua
destilada.
Se disuelven 1,168 gr de cloruro sódico en agua
destilada y se llena hasta 1000 ml con agua destilada.
Se disuelven 18,80 gr de ácido tricloroacético
(CCl_{3}COOH), 18,10 gr de acetato sódico anhidro (CH_{3}COONa)
y 18,80 gr de ácido acético (CH_{3}COOH) en agua destilada y se
llena hasta 1000 ml con agua destilada.
Se mezcla una (1) parte de reactivo de Fenol
Folin-Ciocalteau con una (1) parte de agua
destilada, justamente antes del ensayo.
Se disuelven 58,295 gr de carbonato disódico en
agua destilada y se llena hasta 1000 ml con agua destilada.
Se equilibra 1 ml de dilución de encima (en
solución de 0,02 M NaCl) a +40ºC (durante unos 5 minutos). Se añaden
5 ml de sustrato de caseina equilibrado, se agita y se incuba a
+40ºC durante 30 minutos exactamente. Se añaden 5 ml de reactivo de
precipitación y se agitan. Se incuba a +40ºC durante 30 minutos
exactamente y se filtra inmediatamente con papel de filtro (Whatman
1 o Macherey Nagel 640 we).
Se pipetean 2 ml de filtrado, 5 ml de solución de
0,55 M Na_{2}CO_{3} y 1 ml de reactivo de fenol. Se agita y se
incuba a +40ºC durante 30 minutos. Se enfría a temperatura ambiente
y se mide la absorbancia a 660 nm contra agua destilada.
Se equilibra 1 ml de dilución de encima (en
solución de 0,02 M NaCl) a +40ºC (durante unos 5 minutos). Se añaden
5 ml de reactivo de precipitación, se agita y se incuba a +40ºC
durante 30 minutos exactamente. Se añaden 5 ml de substrato de
caseina, se agita y se incuba a +40ºC durante 30 minutos
exactamente. Se filtra inmediatamente con papel de filtro (Whatman 1
o Macherey Nagel 640 we).
Se trata el filtrado como muestra de la
encima.
La diferencia de absorbancia entre la muestra de
encima y la encima en blanco debe ser de
0,2-0,5.
Preparar una solución de tirosina, pesando 10 mg
de L-tirosina en un recipiente volumétrico, se
disuelven 0,02 M NaCl en solución y se llena hasta 100 ml con una
solución de 0,02 M Nacl.
Se preparan soluciones a partir de una solución
de tirosina en una solución de 0,02 M NaCl del modo siguiente:
1:50 = 2 \mug/ml
1:20 = 5 \mug/ml
1:10 = 10 \mug/ml
1:5 = 20 \mug/ml
1:3 = 33 \mug/ml
1:2 = 50 \mug/ml
Se pipetean 2 ml de cada una de las diluciones de
tirosina, 5 ml de solución de solución de 0,55 M Na_{2}CO_{3} y
1 ml de reactivo de fenol. Se agita y se incuba a +40ºC durante 30
minutos. Se enfría a temperatura ambiente y se mide la absorbancia a
660 nm contra agua destilada.
Se traza gráfico de la concentración de tirosina
como función de la absorbancia.
La actividad de proteasa de la muestra se calcula
de acuerdo con la siguiente ecuación:
Actividad (U/g) =
\frac{[A(X) - A(O)] \ x \ k \ x \ F \ x \
Df}{t}
\newpage
en la
que:
A(X) = absorbancia de la muestra de
encima
A(O) = absorbancia de la encima en
blanco
k = pendiente de la curva estándar
F = factor de dilución de reacción (=11)
Df = factor de dilución (ml/g)
t = tiempo de reacción (30 minutos)
Una unidad de actividad de xilanasa es la
cantidad de encima que libera un \mumol de azúcares reductores
(expresados como equivalentes de xilosa) a partir del substrato en
un minuto, en las condiciones que se describen.
Se añaden 10 ml de una solución de hidróxido
sódico 0,5 M a 1,0 gr de xilano (Fluka 95590). Se mezcla durante 30
minutos con un agitador magnético. Se añaden aproximadamente 40 ml
de un tampón de acetato sódico 0,05 M, pH 5,3. Se ajusta el pH a 5,3
con 1 M ácido acético. Se llena hasta 100 ml con tampón de acetato
sódico 0,05 M, pH 5,3. El substrato se debe mezclar durante todo el
tiempo en que se utiliza.
Pipetear 5,7 ml de ácido acético glacial en un
matraz volumétrico y llenar hasta 100 ml con agua destilada.
A. Disolver 4,1 gr de acetato sódico en agua
destilada y llenar hasta 1000 ml con agua destilada.
B. Disolver 3,0 gr de ácido acético glacial en
agua destilada y llenar hasta 1000 ml con agua destilada.
Ajustar el pH de la solución A a pH 5,3 con
solución B.
Suspender 20,0 gr de ácido 3,5 dinitrosalicílico
en unos 800 ml de agua destilada. Añadir nuevamente 300 ml de
solución de hidróxido sódico (32,0 gr de NaOH en 300 ml de agua
destilada) con agitación continuada. Calentar la suspensión en un
baño de agua (la temperatura no debe exceder +48ºC) con agitación
hasta que la solución es transparente. Añadir gradualmente 600 gr de
tartrato sódico potásico. Calentar la solución (la temperatura no
puede superar +48ºC) si es necesario hasta que la solución es
transparente.
Llenar hasta 2000 ml con agua destilada y filtrar
a través de un filtro de vidrio grosero sinterizado.
Almacenar en una botella de color oscuro a
temperatura ambiente. El reactivo es estable durante un máximo de 6
meses.
1 ml de dilución de encima (en tampón de acetato
sódico 0,05 M, pH 5,3) se equilibra a +50C. Se añade 1 ml de
substrato de xilano, se agita y se incuba a +50ºC durante 30 minutos
exactamente. Se añaden 3 ml de reactivo DNS, se agita y se hace
hervir la mezcla de reacción exactamente 5 minutos. Se enfría la
mezcla de reacción en un baño de agua fría a temperatura ambiente y
se mide la absorbancia a 540 nm contra agua destilada.
Se incuba 1 ml de substrato de xilano a +50ºC
durante 30 minutos. Se añaden 3 ml de solución DNS y se agita. Se
añade 1 ml de dilución de encima (en tampón de acetato sódico 0,05
M, pH 5,3) y agitación. Se hierve la mezcla durante 5 minutos
exactamente. Se enfría la mezcla de reacción en un baño de agua fría
a temperatura ambiente y se mide la absorbancia a 540 nm contra agua
destilada.
La diferencia de absorbancia entre la muestra de
encima y la encima en blanco debe ser de
0,3-0,5.
Se preparan soluciones estándar a partir de
xilosa anhidra en tampón de acetato sódico 0,05 M, pH 5,3. La
concentración de xilosa en los estándares debe ser de
0,05-0,5 mg/ml. Se pipetea 1 ml de solución
estándar, 1 ml de sustrato de xilano y 3 ml de reactivo DNS en un
tubo de ensayo. Se agita y hierve durante 5 minutos exactamente. Se
enfría en un baño de agua fría a temperatura ambiente y se mide la
absorbancia a 540 nm contra una muestra virgen estándar
("blanca"). En la muestra virgen estándar, la solución de
xilosa es sustituida por 1 ml de tampón de acetato sódico 0,05 M, pH
5,3. Por lo demás, la muestra virgen estándar es tratada igual que
la estándar de xilosa.
Se traza gráfico de la concentración de xilosa
como función de absorbancia. Una nueva curva estándar es preparada
para cada nuevo reactivo DNS.
La actividad de xilanasa de la muestra se calcula
de acuerdo con la siguiente ecuación:
Actividad (U/g) =
\frac{([A(X)-A(O)] \ x \ k + \ C_{o})
\ x \ 1000 \ x \ Df}{MW_{xyl} \ x \
t}
en la
que:
A(X) = absorbancia de la muestra de
encima
A(O) = absorbancia de la muestra en blanco
de encima
K = pendiente de la curva estándar
C_{o} = interceptación de la curva estándar de
xilosa
1000 = factor mmol -> \mumol
Df = factor de dilución (ml/g)
MW_{xyl} = peso molecular de la xilosa (150,13
mg/mmol)
t = tiempo de reacción (30 minutos)
Una unidad de actividad
\alpha-Amilasa cataliza un micromol de hidrólisis
de enlaces glicosílicos en un minuto, en las condiciones
descritas.
Como substrato se utiliza una tableta de pruebas
Phadebas Amylasa para diagnóstico in vitro (Pharmacia
Diagnostics) para utilización de diagnóstico in vitro. Las
tabletas se preparan en agua destilada a partir de polímero de
almidón azul insoluble en agua, albúmina de suero bovino y
tampón.
Diluir 9,0 g de cloruro sódico, 2,0 g de albúmina
de suero bobino y 2,2 g de cloruro cálcico en agua destilada en un
matraz volumétrico, llenando hasta 1000 ml con agua destilada.
Disolver 20,0 g de hidróxido sódico en agua
destilada en un matraz volumétrico y llenar con agua destilada hasta
1000 ml.
Macherey Nagel 640 mn o equivalente
Se pipetean 200 \mul de una dilución de encima
adecuada en una solución de reactivo y 4,0 ml de solución de
reactivo en un tubo de ensayo. Se equilibra a +37ºC durante 5
minutos. Se añade la tableta de sustrato con pinzas y se mezcla bien
durante 10 segundos. Se incuba a +37ºC durante 15 minutos
exactamente. El tiempo de la reacción empieza con la adición de la
tableta. Se añade 1,0 ml de solución de 0,5 M NaOH y se agita bien.
Se filtra o centrifuga a 3500 rpm durante 10 minutos y se mide la
absorbancia contra muestra en blanco de reactivo a 620 nm.
La absorbancia de la muestra de encima debe ser
0,3-0,5.
Se equilibran 4,2 ml de solución de reactivo a
+37ºC durante 5 minutos. Se añade la tableta substrato con pinzas y
se agita bien durante 10 segundos. Se incuba a +37ºC durante 15
minutos exactamente. Se añade 1,0 ml de solución de NaOH 0,5 M, se
agita bien y se filtra o se centrifuga a 3500 rpm durante 10
minutos.
La absorbancia de la muestra es proporcional a la
actividad de \alpha-amilasa. La actividad de
\alpha-amilasa de la dilución de encima es leída
de una tabla incluida en el equipo ("kit") de la tableta. Para
cada lote de tabletas se suministra una tabla calibrada.
La actividad de \alpha-amilasa
de la muestra se calcula del modo siguiente:
Actividad (U/g) = \frac{Act
\ x \
Df}{1000}
en la
que:
Act = valor de la actividad de
\alpha-amilasa (expresada U/1) de dilución de
encima leída de la tabla de pruebas de Phadebas Amylase
Df = Factor de dilución (ml/g)
1000 = factor para convertir litros en ml
Es un primer objetivo de la presente invención
dar a conocer una combinación de compuestos para su inclusión en un
pienso animal que mejora la tasa de ganancia de peso de animales
sanos. Un segundo objetivo de la invención consiste en dar a conocer
la utilización de dicha combinación para la fabricación de un agente
para la prevención y/o tratamiento de coccidiosis o infecciones
bacterianas, tales como enteritis necrótica. Un tercer objetivo
consiste en dar a conocer una combinación de aditivos para un pienso
animal que contrarresta el efecto de una afección producida por
Eimeria, que reduce la tasa de ganancia de peso de un
animal.
De acuerdo con ello, un primer aspecto de la
presente invención da a conocer la utilización de una proteasa y una
sal interna de un ácido carboxílico de amina cuaternaria para la
fabricación de un agente para un tratamiento y/o profilaxis de la
coccidiosis.
Según otro aspecto de la invención, ésta da a
conocer la utilización de una proteasa y una sal interna de un ácido
carboxílico de amina cuaternaria, para la fabricación de un agente
para el tratamiento de infecciones por Eimeria en
animales.
De acuerdo con un tercer aspecto de la invención,
ésta da a conocer la utilización de una proteasa y una sal interna
de un ácido carboxílico de amina cuaternaria para la fabricación de
un aditivo para piensos para aumentar la ganancia en peso de un
animal afectado por Eimeria.
De acuerdo con un cuarto aspecto, la presente
invención da a conocer la utilización de una proteasa y una sal
interna de un ácido carboxílico de amina cuaternaria, para la
fabricación de un agente para el tratamiento y/o profilaxis de una
infección bacteriana provocada por Salmonella, Campylobacter,
E.coli o Listeria.
\newpage
De acuerdo con un quinto aspecto, la presente
invención da a conocer la utilización de una proteasa y una sal
interna de un ácido carboxílico de amina cuaternaria para la
fabricación de un agente para el tratamiento y/o profilaxis de
enteritis necrótica, resultante de infección entre otros de
Clostridium perfringens.
De acuerdo con un sexto aspecto, la presente
invención da a conocer un aditivo para piensos de animales que
comprende una proteasa, una xilanasa y una sal interna de un ácido
carboxílico de amina cuaternaria.
En cada uno de los cinco primeros aspectos
anteriores es especialmente preferente que el agente o aditivo
comprende además una xilanasa.
La figura 1 muestra una representación gráfica de
los efectos de suplementar la alimentación de pollos sanos con
betaína, una proteasa, y con una combinación de betaína y una
proteasa.
La figura 2 muestra una representación gráfica de
los efectos de suplementar el pienso de pollos atacados por
Eimeria máxima con betaína, una proteasa y con una
combinación de betaína y una proteasa.
La figura 3 es un cromatograma de gel que muestra
la presencia del gen de la toxina C. perfringens en el íleo
de pollos, alimentados con alimentos con diferentes suplementos y
atacados por diferentes patógenos.
En la descripción siguiente se hará referencia a
diferentes metodologías que constituyen el conocimiento general
común de los expertos en inmunología y en inmunopatología
veterinaria, vacunas, farmacia animal y en la producción ganadera.
Entre las publicaciones y otros materiales que dan a conocer dichas
metodologías, se incluyen:
Principios generales de ciencia veterinaria, por
ejemplo, en la publicación The Merck Veterinary Manual, 6ª Edición,
editada por Fraser y otros en 1986, y las publicaciones Food and
Drug Administration's FDA 1994 Feed Additive Compendium, U.S, Food
and Drug Administration, 1994; Trends in Veterinay Research and
Development, parte 6, Anti-coccidials, editado por
Lloyd-Evans, L.P.M,. PJB Publications Lrd., 1991;
Diseases of Poultry, editado por B.W. Calnek, Iowa State University
Press, Ames, Iowa, 1991.
Los principios generales de cría de animales se
establecen, por ejemplo, en la publicación H. Patrick y otros,
Poultry: Feeds & Nutrition, 2ª Edición, AVI Publishing Co. Inc.,
Westport, Conn. (1980).
Los principios generales de ciencia farmacéutica
se establecen, por ejemplo, en la publicación Remington's
Pharmaceutical Sciences (18ª edición, A.R. Gennaro, ed., Mack
Publishing, Easton, Pa. 1990).
Tal como se ha mencionado anteriormente, la
presente invención da a conocer la utilización de una proteasa y de
una sal interna de un ácido carboxílico de amina cuaternaria de una
fabricación de un agente para el tratamiento y/o profilaxis de
coccidiosis, infección bacteriana o enteritis necrótica, resultado
de infección, entre otros, por Clostridium perfringens. La
ventaja de utilización de piensos que contienen la combinación de
betaína y una proteasa para la cría de animales, es que la cantidad
de medicamentos antimicrobianos que se han incorporado anteriormente
de modo rutinario en los piensos se puede reducir, o en algunos
casos se puede omitir por completo. En países en los que dichos
medicamentos están prohibidos, representa un nuevo enfoque para el
control de enfermedades bacterianas.
Cuando se omiten los antibióticos de la dieta de
animales, hay varias ventajas potenciales adicionales. Anteriormente
ha sido necesario retirar los antibióticos de la dieta de animales
durante un cierto tiempo antes de la matanza. Esto asegura que la
carne se encuentra relativamente libre de dichos medicamentos y, por
lo tanto, es apropiada para el consumo humano. Como contraste, si se
omiten por completo los antibióticos de una dieta de alimentación
animal, tal como se puede conseguir mediante la presente invención,
entonces el animal puede ser sacrificado a cualquier edad, en vez de
hacerlo después de un período de tiempo predeterminado. Esto
facilita a los granjeros un mayor flexibilidad y elimina el riesgo
de que los animales queden infectados poco tiempo antes de la
matanza. Además, la carne y los huevos se pueden garantizar que se
encontrarán libres de antibióticos. Estas carne y huevos tienen una
ventaja de comercialización en comparación con productos que no
pueden presentar dicha garantía.
La presente invención tiene también ventajas para
la salud humana. Su utilización reduce la necesidad de seleccionar
cepas de bacterias resistentes a antibióticos, al permitir la
retirada de antibióticos de los piensos de los animales. De acuerdo
con ello, se encontrarán en la cavidad interna del animal más cepas
susceptibles a los antibióticos, asegurando de esta manera un efecto
probablemente más letal en el caso de utilizar antibióticos para
estados humanos equivalentes.
El aditivo de pienso, de acuerdo con la presente
invención, se puede preparar en una serie de formas. Por ejemplo, se
puede preparar simplemente por mezcla de compuestos distintos
apropiados para producir el aditivo. Éste puede ser entonces, o bien
mezclado directamente con un pienso, o de manera más conveniente,
impregnado en un material portador basado en cereales, tal como
trigo molido, maíz o harina de soja. Un portador impregnado de este
tipo constituye también un aditivo alimenticio, de acuerdo con el
cuarto aspecto de la presente invención.
El aditivo para piensos puede ser mezclado
directamente con el pienso para los animales, o de manera
alternativa, puede ser mezclado con uno o varios otros aditivos de
piensos, tales como aditivos de vitaminas para piensos, aditivos de
piensos de tipo mineral, o aditivos para piensos con aminoácidos. El
aditivo de piensos resultante que comprende diferentes tipos de
componentes puede ser entonces mezclado en la cantidad apropiada con
el pienso. También es posible incluir el aditivo de pienso en la
dieta animal, al incorporarla en un segundo pienso (distinto) o en
el agua de beber a la que tiene acceso el animal. De acuerdo con
ello, no es esencial que el aditivo provisto por la presente
invención sea incorporado en el pienso principal usual basado en
cereales de los animales, si bien dicha incorporación forma un
aspecto especialmente preferente de la presente invención.
El aditivo para pienso de la presente invención
puede ser formulado como premezcla, junto con cualesquiera otras
enzimas que se desee incluir. La premezcla se puede añadir a las
materias primas antes de la fabricación del pienso, durante dicha
fabricación o como etapa final una vez que el pienso se encuentra
listo para su utilización. Es posible añadir la combinación de sal
interna y proteasa directamente a un material de pienso preformado
en forma de pastillas o una masa.
Si el aditivo de la presente invención es
incorporado en un pienso para animales, entonces el pienso debe
comprender, como mínimo, 25% en peso de un cereal, y con preferencia
un mínimo de 35% en peso del cereal. El cereal puede ser uno o
varios de los siguientes: trigo, maíz, cebada, avena, centeno,
"triticale", arroz y sorgo. Es especialmente preferente que el
cereal sea maíz o trigo. Si el cereal es maíz, entonces el aditivo o
agente comprende preferentemente además una
\alpha-amilasa.
Si bien el componente cereal de una dieta basada
en cereales constituye una fuente de proteínas, es habitualmente
necesario incluir fuentes de proteínas suplementarias en la dieta,
tales como las derivadas de harina de pescado, harina de carne o
vegetales. Estas fuentes suplementarias de proteínas pueden
constituir hasta el 50% en peso del pienso del animal. Se incluyen
entre las fuentes de proteínas vegetales, como mínimo, una de las
siguientes con pleno contenido de grasas: soja, colza, canola,
melaza de soja, melaza de colza y melaza de canola.
Una sal interna de un ácido carboxílico de amina
cuaternaria tiene la fórmula general estructural
R^{1}R^{2}R^{3}N^{+}-L-COO^{-}
en la que los sustituyentes R^{1}, R^{2} y R^{3} representan
independientemente cualesquiera radicales orgánicos, preferentemente
grupos alquilo, más preferentemente, grupos alquilo que tienen de 1
a 6 átomos de carbono, y con mayor preferencia todos los grupos
metilo; el grupo de enlace -L- representa cualquier grupo de enlace
orgánico, tal como alcoxialquilo o alquileno, preferentemente
C_{1}-C_{6} alquileno, y de manera más
preferente metileno. Se incluyen entre los ejemplos de una sal
interna de ácido carboxílico de amina cuaternaria
(Me_{3}N^{+}CH_{2}COO^{-}),
Me_{3}N^{+}-CHMeCOO^{-},
Et_{3}N^{+}CH_{2}COO^{-} y
Me_{2}EtN^{+}CH_{2}COO^{-},
Me_{3}N^{+}CH_{2}CH_{2}COO^{-},
Me_{3}N^{+}CH_{2}OCH_{2}COO^{-} y
Me_{3}N^{+}C(CHMe_{2})HCOO^{-} betaína. La sal
interna es preferentemente betaína que se puede conseguir
comercialmente de la firma Finnfeeds con la Marca Comercial
Betafin®.
La sal interna se incluye preferentemente en el
pienso con una proporción de 0,01-20 gr por kg de
pienso, más preferentemente 0,1-10 gr/kg, y de
manera todavía más preferente 0,5 a 2 gr/kg.
La proteasa utilizada puede ser cualquier forma
de proteasa, no obstante, la utilización de una subtilisina derivada
de Bacillus subtilis con una actividad no inferior a 40.000
U/gr es preferente. Estas subtilisinas se describen, por
ejemplo, en la patente USA 4.760.025 A. La proteasa se incluye en el
pienso en una cantidad tal que éste tiene una actividad de proteasa
correspondiente a 100 U hasta 100.000 U por kilo de pienso,
preferentemente de 500 U a 10.000 U por kilo de pienso. Se incluyen
entre las proteasas adecuadas, sin que ella sirva de limitación, las
siguientes proteasas comerciales: Novo NEUTRASA (Marca Registrada)
(disponible comercialmente de Novo Nordisk); PURAFECT (Marca
Registrada) (Comercialmente disponible de Genencor International,
Inc); SAVINASE (Marca Registrada) (disponible comercialmente de
Novo Nordisk); MAXACAL (Marca Registrada) (disponible comercialmente
de Gist-Brocades); DURAZYM (Marca Registrada)
(disponible comercialmente de Novo Nordisk); y MAXAPEM (Marca
Registrada) (disponible comercialmente de Gist Brocades).
En una realización preferente de la invención, el
agente o aditivo comprende adicionalmente una xilanasa. Las
xilanasas pueden ser derivadas de fuentes fúngicas, tales como
Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Neocallimastix o
Thermomyces. Es preferible que la xilanasa sea la pI xilanasa
baja y/o la pI xilanasa alta que se pueden conseguir de
Trichoderma Longibrachiatum, tal como se describe en el
ejemplo 22 del documento WO 92/06209. De manera alternativa, la
xilanasa puede ser también obtenida a partir de una bacteria, tal
como Bacillus, Streptomyces, Microtetraspora, Clostridium o
Ruminococcus. También es posible que la xilanasa puede ser
obtenida de una hospedante que ha sido sometido a manipulación
genética, por ejemplo, por la inclusión de un gen apropiado dentro
de una bacteria hospedante o cepa fúngica. La actividad preferente
de la xilanasa debe ser aproximadamente de 3.000 U/gr. La xilanasa
de Trichoderma longibrachiatum con una actividad mínima de
3.000 U/g se puede conseguir comercialmente de Finnfeeds
International con la marca AVIZYME®. La xilanasa se incluye en el
pienso en una cantidad tal que éste tiene una actividad de xilanasa
que corresponde de 100 U a 100.000 U por kg de pienso,
preferentemente una actividad de 200 U a 1000 U por kg de
pienso.
En otra realización preferente de la invención,
la \alpha-amilasa puede también encontrarse
presente en el agente o aditivo, particularmente en el caso de que
el agente o aditivo se tiene que incluir en un pienso que contiene
maíz. Si bien se encuentra dentro del campo de la invención el
utilizar cualquier forma de \alpha-amilasa, es
preferible utilizar \alpha-amilasa procedente de
Bacillus subtilis con 4000 U/g de actividad mínima. Se puede
disponer comercialmente de \alpha-amilasa
procedente de Bacillus subtilis con una actividad mínima de
4000 U/g de la firma Finnfeeds International con el nombre comercial
AVIZYME®. La \alpha-amilasa se incluye en el
pienso, en una cantidad tal que éste tiene una actividad de
\alpha-amilasa que corresponde de 10 U a 100.000 U
por kg de pienso, preferentemente una actividad de 100 U a 4000 U
por kg de pienso.
La sal interna, proteasa, y opcionalmente
xilanasa y/o \alpha-amilasa se pueden mezclar
entre sí antes de su utilización, pero también se pueden aplicar
separadamente al pienso. Una combinación de proteasa, xilanasa y
\alpha-amilasa se encuentra a disposición
comercialmente con la marca AVIZYME® 1510 de Finnfeeds
International. Otra combinación de estas enzimas se encuentra a
disposición comercial como premezcla en seco con la marca AVIZYME®
1500. Se debe observar que, en general, no es aconsejable almacenar
una proteasa junto con otras proteínas durante un período prolongado
de tiempo, dado que tiende a degradar a las segundas.
El aditivo de piensos de la presente invención
puede ser utilizado para una amplia variedad de animales, pero la
utilización de la invención es particularmente preferente en
animales domésticos y en la cría de animales en granja. Los animales
que se pueden beneficiar especialmente de la invención incluyen aves
(tales como pollos, pavos, patos y gansos), rumiantes (tales como
vacas, caballos y corderos), cerdos, roedores (tales como conejos) y
peces. La invención es particularmente útil con respecto a pollos
para consumo.
De acuerdo con la invención, se pueden
administrar niveles eficaces del aditivo objeto de la misma, para
aliviar los efectos adversos de cualquier patógeno inductor de
coccidiosis, y especialmente los de especie Eimeria,
incluyendo por ejemplo la especie Eimeria necatrix,
galloparvonis, meleagrimitis, innocua, meleagridis, subrotunda,
dispersa, truncata, acervulina, brunetti, maxima, mitis, praecox
y tenella. Más particularmente, el aditivo ayuda la ganancia
en peso de un animal infectado de Eimeria.
De acuerdo con la presente invención, se pueden
administrar niveles eficaces del aditivo de la presente invención
para aliviar los efectos adversos en aves, debido a la infección por
la especie Eimeria, especialmente la especie Eimeria
acervulina, Eimeria brunetti, Eimeria maxima, Eimeria mitis, Eimeria
necatrix, Eimeria praecox y Eimeria tenella.
De acuerdo con la presente invención, los niveles
eficaces del aditivo objeto de la misma se pueden administrar para
aliviar los efectos adversos inducidos en ganado infectado por un
miembro de la especie Eimeria, en especial, las especies de
Eimeria Zuernii, bovis (smithii), ellipsoidlis.
De acuerdo con la invención, se pueden
administrar niveles eficaces del aditivo para aliviar los efectos
adversos inducidos en corderos, infectados con un miembro de especie
Eimeria incluyendo las especies de Eimeria arloingi A
(ovina), weybridgensis (arlongis B), crandallis, ahsata,
ovinoidalis, gilruthi.
De acuerdo con la presente invención, se pueden
administrar niveles eficaces del aditivo objeto de la misma para
aliviar los efectos adversos inducidos en cabras infectadas por un
miembro de la especie Eimeria, incluyendo, por ejemplo,
inmunización con especies de Eimeria arloingi, faurei, caproina,
ninakohlyakimovae, christenseni.
De acuerdo con la presente invención, se pueden
administrar niveles eficaces del aditivo objeto de la misma para
aliviar los efectos adversos inducidos en cerdos infectados con un
miembro de la especie Eimeria, incluyendo, por ejemplo,
inmunización con las especies de Eimeria debliecki, scabra,
penninuta; e incluyendo efectos adversos inducidos por miembros
de especie Isospora, por ejemplo, Isospora suis.
De acuerdo con la presente invención, se pueden
administrar niveles eficaces del aditivo objeto de la misma para
aliviar los efectos adversos en las aves debido a infecciones por
bacterias, tales como Clostridium, Salmonella, Campylobacter, E.
coli, Listeria y especialmente Clostridium perfringens,
Salmonella enteritidis y Campylobacter jejuni. Dado que
Clostridium perfringens es una de las causas más importantes
de enteritis necrótica, el aditivo nutritivo puede ser utilizado, de
acuerdo con ello, para la preparación de un agente para el
tratamiento y/o profilaxis de enteritis necrótica.
Se pueden utilizar métodos farmacéuticos
adicionales para controlar la duración de la acción. El suministro
controlado puede ser conseguido seleccionando macromoléculas
apropiadas, tales como poliésteres, poliaminoácidos,
polipirrolidona, etileno vinilacetato, metilcelulosa,
carboximetilcelulosa o sulfato de protamina, y combinando éstos de
acuerdo con procedimientos bien establecidos a efectos de controlar
la liberación. La duración de la acción de la sal interna y proteasa
se puede controlar también por incorporación de estos agentes en
partículas de materiales polímeros, tales como poliésteres,
poliaminoácidos, hidrogeles, poli (ácido láctico) o copolímeros de
etileno y acetato de vinilo. De manera alternativa, la sal interna y
la proteasa pueden ser formuladas en microcápsulas. Se dan a conocer
diferentes materiales y métodos para la fabricación y utilización de
las microcápsulas en la obra "Remington's Pharmaceutical
Sciences", (16ª edición, A. Oslow, ed., Mack, Easton, Pa.
1980).
Además de la realización de la presente
invención, en la que la sal interna y la proteasa se administran a
animales en forma de pienso para la dieta animal, la presente
invención comprende también la utilización de otros compuestos que
contienen la sal interna y la proteasa que se pueden coadminsitrar
con cualquier composición deseada, incluyendo cualesquiera vacunas,
nutrientes o medicamentos.
El siguiente ejemplo muestra los efectos cuando
se incorpora un aditivo de pienso de la presente invención en el
pienso de animales sanos y también en la fabricación del agente para
el tratamiento de infecciones por Eimeria.
96 pollos de consumo hembra (Ross 208) fueron
divididos en cuatro grupos separados, cada uno de 24 animales. El
tratamiento de alimentación fue empezado al día 0, y las aves
sometidas a ataque de Eimeria maxima en el día 14. Este
ataque se realizó por inoculación de oocistos de E.
acervulina y E. maxima a los pollos en un volumen de 2 ml
de agua del grifo. La dosis por ave fue de 100.000 oocistos de E.
acervulina y 50.000 oocistos de E. maxima. Estas dos
especies de Eimeria son segregadas espacialmente en el
intestino: la E. acervulina infecta el duodeno y el principio
del yeyuno, mientras que la E. maxima prefiere la parte media
del intestino delgado, desde la parte alejada o distal del yeyuno
hasta la parte media del íleon. Las aves se mantuvieron en jaulas
entre los días 0-14 y en recintos abiertos con lecho
de virutas de madera entre los días 14-21.
El pienso suministrado a las aves era un pienso
basado en soja, sin coccidiostatos. El pienso fue prensado en frío
formando pastillas pequeñas y triturables, con un diámetro
aproximado de 5 mm. Los piensos iniciales fueron utilizados en los
días 0-14 y los piensos finales en los días
14-21. Los aditivos fueron proyectados sobre las
pastillas de pienso en caso apropiado mediante una solución acuosa
de betaína (a una dosis de 1 gr por kg de pienso) y una solución
acuosa de AVIZYME® 1510 que comprende aproximadamente 300 U/g de
xilanasa, 4.000 U/g de proteasa y 400 U/g de
\alpha-amilasa que se puede conseguir de la firma
Finnfeeds International, con una dosis de 1 gr/kg de pienso.
Las composiciones del pienso utilizado fueron las
siguientes:
Pienso de
soja
La composición nutricional de estos piensos era
la siguiente:
El peso de las aves se midió justamente antes del
ataque por Eimeria máxima a los 14 días. La tabla 1 muestra
que la utilización de una combinación de betaína y la proteasa
tienen como resultado una ganancia en peso, incrementada en
comparación con la adición de estos compuestos individualmente al
pienso.
Los resultados de la tabla 1 se representan
gráficamente en la figura 1.
Los pesos de las aves fueron tomados solamente en
el día 21, es decir, un período de 7 días después del ataque por
Eimeria. Los resultados se resumen en la tabla 2. Se observa
una ganancia mejorada de peso para el grupo D en comparación con los
del grupo B y C, en los que los piensos están suplementados por
betaína o proteasa. Nuevamente, una combinación de estos dos
componentes conduce a una mejora mayor que la suma de los efectos de
los componentes individuales.
Los resultados de la tabla 2 se representan
gráficamente en la figura 2.
Se investigó en este ejemplo la actividad de una
combinación de betaína y proteasa utilizada en el ejemplo 1 sobre la
infección de Clostridium perfringens. El pienso utilizado era
el pienso final descrito en el ejemplo 1.
12 pollos de 21 días fueron divididos en tres
grupos separados E, F y G, cada uno de 4 aves. El grupo E fue
sometido a ataque de Eimeria maxima, el grupo F al ataque de
Clostridium perfringens y el grupo G a un ataque doble
simultáneo de Eimeria y Clostridium perfringens. El
gen de la \alpha-toxina de C. perfringens
fue detectado del ADN microbiano total de la manera siguiente: el
ADN microbiano total del ciego fue sometido a PCR con cebadores
diseñados de acuerdo con una secuencia nucleótica conocida del gen
de \alpha-toxina de C. perfringens. La
secuencia de los cebadores de \alpha-toxina y las
condiciones para llevar a cabo la reacción PCR se describen en la
publicación de Songer y de Meer en Am. J. Vet. Res ''de julio de
1997; 58 (7), páginas 702-705.
\newpage
La banda intensa en la franja 3 del gel que se
muestra en la figura 3 indica la presencia del gen de
\alpha-toxina de C. perfringens endógeno en
el animal. La ausencia de estas bandas en las franjas 2 y 4 muestran
que el ataque de Eimeria es un prerequisito esencial para que
se produzca la infección por C. perfringens. Sin desear la
limitación a cualquier teoría, se cree que el ataque de
Eimeria reduce los deberes normales de proteasa en el
intestino, lo cual disminuye entonces la absorción de nutrientes en
las zonas superiores del intestino, resultando en niveles de
proteínas incrementados (y por lo tanto, condiciones de crecimiento
incrementadas para C. perfringens) en el íleon. Otro aspecto
que debe ser de significación es el efecto del ataque de
Eimeria en el sistema inmune del animal hospedando. Es
probable que la respuesta inmune ante un ataque de C.
perfringens se debilite cuando el sistema inmune se halla ya
influido por el ataque de Eimeria.
La comparación de las franjas 6 y 7 de la figura
3 muestra que la banda indicativa del gen de
\alpha-toxina de
C. perfringens se observa solamente para el tratamiento con proteasa sola (franja 6) pero no para la utilización combinada de betaína en proteasa (franja 7). Es de conocimiento general además en esta técnica que la betaína como tal no es eficaz contra el ataque de C. perfringens. Por lo tanto, se puede deducir que la combinación de betaína y proteasa es eficaz contra una infección de C. perfringens mientras que la utilización de proteasa o betaína individualmente no tiene como resultado un tratamiento efectivo de una infección de Clostridium.
C. perfringens se observa solamente para el tratamiento con proteasa sola (franja 6) pero no para la utilización combinada de betaína en proteasa (franja 7). Es de conocimiento general además en esta técnica que la betaína como tal no es eficaz contra el ataque de C. perfringens. Por lo tanto, se puede deducir que la combinación de betaína y proteasa es eficaz contra una infección de C. perfringens mientras que la utilización de proteasa o betaína individualmente no tiene como resultado un tratamiento efectivo de una infección de Clostridium.
Claims (17)
1. Utilización de proteasa y una sal interna de
un ácido carboxílico de amina cuaternaria para la fabricación de un
agente para el tratamiento y/o profilaxis de coccidiosis.
2. Utilización de proteasa y una sal interna de
un ácido carboxílico de amina cuaternaria para la fabricación de un
agente para el tratamiento de infección por Eimeria en un
animal.
3. Utilización de proteasa y una sal interna de
un ácido carboxílico de amina cuaternaria para la fabricación de un
aditivo de piensos para aumentar la ganancia en peso de un animal
afectado por Eimeria.
4. Utilización de proteasa y una sal interna de
un ácido carboxílico de amina cuaternaria para la fabricación de un
agente para el tratamiento y/o profilaxis de una infección
bacteriana provocada por Salmonella, Campylobacter, E.
coli o Listeria.
5. Utilización de proteasa y una sal interna de
un ácido carboxílico de amina cuaternaria para la fabricación de un
agente para el tratamiento y/o profilaxis de enteritis necrótica,
resultado de infección entre otros de Clostridium
perfringens.
6. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la sal interna es
betaína.
7. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el agente comprende además
una xilanasa.
8. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el agente comprende además
una
\alpha-amilasa.
\alpha-amilasa.
9. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el agente adopta forma de
pienso de animal.
10. Utilización, según la reivindicación 9, en la
que el pienso comprende 0,01-20 gr de la sal interna
por kg del pienso.
11. Utilización, según la reivindicación 9 o la
reivindicación 10, en el que la cantidad de proteasa presente en el
pienso corresponde a 100-100.000 U de actividad de
proteasa por kg de pienso.
12. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones 9-11, en lo que depende de la
reivindicación 7, en la que la cantidad de xilanasa presente en el
pienso corresponde a 100-100.000 U de actividad de
xilanasa por kg de pienso.
13. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones 9-12, en lo que depende de la
reivindicación 8, en la que la cantidad de
\alpha-amilasa presente en el pienso corresponde a
10-100.000 U de actividad de
\alpha-amilasa por kg de pienso.
14. Aditivo para un pienso de animal que
comprende una proteasa, una xilanasa y una sal interna de un ácido
carboxílico de amina cuaternaria.
15. Aditivo, según la reivindicación 14, en el
que la sal interna es betaína.
16. Aditivo para pienso animal, según la
reivindicación 14 ó 15, que comprende además una
\alpha-amilasa.
17. Pienso animal que comprende un aditivo, según
cualquiera de las reivindicaciones 14-16, y como
mínimo, 25% en peso de cereal.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GB9929152A GB2358135A (en) | 1999-12-09 | 1999-12-09 | Animal feed additives comprising betaine and a protease |
| GB9929152 | 1999-12-09 |
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|---|---|
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