ES2298614T3 - Composicion antimicrobiana y metodo de uso. - Google Patents

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Abstract

Un agente para inhibir el crecimiento de patógenos entéricos en el intestino del ganado, y dicho agente se proporciona como una composición antimicrobiana que comprende: (a) una sustancia de lisis de la pared celular o su sal; (b) al menos uno de huevo en polvo deshidratado y albúmina; y (c) un agente secuestrante.

Description

Composición antimicrobiana y método de uso.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición para inhibir el crecimiento de microorganismos en el intestino del ganado, y más en particular a una composición antimicrobiana que se puede administrar al ganado en forma de un aditivo para el agua o el pienso para inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos en el intestino.
Antecedentes de la invención
Las bacterias provocan numerosas enfermedades intestinales en el ganado. Estos tipos de bacterias están incluidos en la clase general de bacterias entéricas patógenas. Una bacteria que provoca enfermedad intestinal es Clostridium perfringens, que provoca enteritis necrótica ("EN") en aves de corral yenteritis por Clostridium perfringens ("ECP") en cerdos. Escherichia coli, otro patógeno entérico habitual, provoca enfermedades en muchos tipos de animales, tales como enfermedad diarreica en lechones. Cada año la EN, ECP y las enfermedades diarreicas provocan pérdidas económicas significativas a las industrias de cría de aves y cerdos. Además de Cl. perfringens y E. coli, varios serotipos de Salmonella provocan enfermedades en animales que se pueden transmitir a los humanos a través del consumo de los productos alimentarios de origen animal.
Se han informado casos de EN y ECP en casi todas las partes del mundo, y desempeñan un papel económico significativo en la viabilidad de las industrias avícolas y porcinas. Por ejemplo, se estima que la pérdida anual mundial debida a las infecciones por EN es mayor de dos mil millones de dólares estadounidenses.
EN se describió por primera vez como una enfermedad aviaria doméstica en 1961. Clostridium perfringens se halla de forma natural en el intestino aviario. En condiciones favorables, sin embargo, Clostridium perfringens se puede multiplicar rápidamente y puede liberar toxinas, lo que provoca lesiones macroscópicas que consisten en grandes áreas de necrosis de la membrana interna del intestino delgado distal. En algunos casos las bacterias pueden afectar también al ciego y al hígado. Las condiciones favorables que llevan a la proliferación de Clostridium perfringens se pueden inducir mediante agresiones intestinales provocadas por factores de riesgo alimentarios y otros factores tales como coccidiosis, etc., que actúan como factores predisponentes para la enfermedad. La forma clásica de EN tiende a darse como un brote, que afecta principalmente a aves en el intervalo de edad de dos a cinco semanas, y se caracteriza por un curso agudo de pérdida de apetito, depresión, plumas erizadas, diarrea y ganancia de peso disminuida, que puede ir seguido por muerte súbita. La tasa de mortalidad en grupos de aves sin tratar puede alcanzar el 10% o más. Igualmente en cerdos, Clostridium perfringens de tipo A y de tipo C provocan diarrea, ganancia de peso disminuida y a veces muerte en las formas agudas.
La diarrea bacteriana, conocida de otra manera como enfermedad diarreica, se ha convertido en general en una enfermedad económicamente importante en la industria ganadera, y más en particular en cerdos como resultado de la intensificación creciente del manejo del parto, la tendencia hacia piaras grandes y el destete temprano. La enfermedad diarreica provocada por Escherichia coli enterotoxigénica es la enfermedad entérica más habitual hallada en cerdos neonatales. En el inicio de la enfermedad, Escherichia coli coloniza el intestino adhiriéndose al epitelio del intestino delgado. Una vez que E. coli coloniza, las bacterias producen toxinas que provocan trastornos gastrointestinales. El proceso de infestación se puede dar tanto en lechones neonatales como tras el destete. La infección tras el destete por Escherichia coli, sin embargo, es una causa importante de pérdida económica en la industria porcina debido a las tasas de crecimiento reducidas y las tasas de mortalidad incrementadas. Una de las causas más habituales de mortalidad tras el destete en las granjas porcinas, que mata al 1,5-2% de los cerdos destetados, es la enfermedad diarreica.
Se ha usado una diversidad de antibióticos tales como virginiamicina y bacitracina para controlar y prevenir las enfermedades provocadas por Clostridium perfringens y otras enfermedades relacionadas. Estos antibióticos se administran a diversas poblaciones aviarias y porcinas añadiéndolos en sus piensos. Se analizan agentes antibacterianos sinérgicos en el documento EP466244 junto con un componente antimicótico. El desarrollo continuado de resistencia hacia y contra los antibióticos en piensos para consumo animal, sin embargo, ha provocado un revés en la prevención y el control de las enfermedades anteriormente mencionadas. Además, en julio de 1999, la Comunidad Europea prohibió el uso de antibióticos en piensos para consumo animal, lo que incluye virginiamicina y bacitracina. Es posible que se tomen medidas similares en el resto del mundo debido al creciente conocimiento público del impacto negativo del uso de antibióticos y de su efecto sobre el medio ambiente y la salud humana. Uno de los problemas más importantes asociados a la reducción y eliminación de los antibióticos para el uso en aves de corral y cerdos será el incremento de la incidencia de EN, junto con un incremento potencial de la incidencia de ECP y enfermedad diarreica. Además, otros sectores de la industria animal se verán amenazados inmediatamente debido a la prevalencia de diversas enfermedades tras la retirada de los antibióticos. La retirada dará como resultado además una disminución de la seguridad de los alimentos que son consumidos por los humanos como productos alimentarios de origen animal. Debido a las razones anteriores, existe la necesidad de una alternativa rentable para reducir la incidencia o para prevenir las enfermedades gastrointestinales, tales como EN, ECP y enfermedad diarreica, en animales y más en particular en poblaciones aviarias y porcinas. Otros han discutido el uso de materiales distintos de los antibióticos tradicionales, tales como anticuerpos derivados de huevo, por ejemplo se discuten las yemas de huevo liofilizadas o los huevos líquidos en el documento EP 955061, mientras el documento JP 62145025 mencionó el uso de albúmina como antiviral.
Resumen de la invención
Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar una composición antimicrobiana mejorada para la administración de la misma para ayudar a controlar la infección patógena entérica en el ganado, y más en particular en poblaciones aviarias y porcinas.
Así, según la invención, se proporciona un agente nuevo para inhibir el crecimiento de patógenos entéricos en el intestino del ganado como se expone en la reivindicación 1. En particular, la composición antimicrobiana incluye lisozima en combinación con una sustancia antimicrobiana y un agente secuestrante para reducir el crecimiento y las enfermedades o los efectos epidemiológicos significativos provocados por Clostridium perfringens, E. coli y Salmonella, y para abordar al menos algunos de los problemas identificados anteriormente.
La composición antimicrobiana según las realizaciones de la invención inhibe diversos tipos de bacterias que pueden estar presentes in vivo en los intestinos aviarios y porcinos, que pueden afectar a la salud de los animales y pueden llevar a complicaciones tales como ganancia de peso disminuida y muerte. Más en particular, la composición antimicrobiana y el método se refieren a un aditivo para el agua o el pienso que se puede administrar al ganado para inhibir el crecimiento de Clostridium perfringens, que provoca EN en aves de corral y ECP en cerdos. El uso de tal aditivo para el agua o el pienso puede inhibir también el crecimiento de E. coli, que provoca enfermedad diarreica en cerdos, y también puede inhibir el crecimiento de Salmonella typhimurium y Salmonella mbandaka, lo que incluye otros patógenos entéricos presentes en los intestinos aviarios y porcinos.
Según una realización de la invención, se proporciona una composición antimicrobiana que incluye:
(a)
una sustancia de lisis de la pared celular o su sal;
(b)
una sustancia antimicrobiana; y
(c)
un agente secuestrante.
En un caso particular, la proporción de la sustancia de lisis de la pared celular o su sal, la sustancia antimicrobiana y el agente secuestrante es 2:5:3 en peso.
En poblaciones aviarias y porcinas, los patógenos entéricos particulares seleccionados como objetivo incluyen los miembros de las siguientes familias de bacterias: Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella typhimurium y Salmonella mbandaka.
En otro caso particular, la sustancia de lisis de la pared celular o su sal puede ser lisozima.
En otro caso particular, la sustancia antimicrobiana puede ser huevo en polvo deshidratado y/o albúmina.
En un caso particular adicional, el agente secuestrante puede ser un ácido orgánico y/o un quelador de metal, y se puede seleccionar de etilendiamintetraacetato (EDTA) disódico, ácido cítrico o quitosano.
En otro caso particular, la composición comprende además un lantibiótico que puede ser nisina.
En otro caso particular, la composición antimicrobiana está en forma pulverizada o en disolución acuosa.
En otro caso particular, la composición antimicrobiana se administra como un aditivo para el pienso.
La administración de la composición antimicrobiana es para reducir la incidencia o para tratar la enteritis necrótica, la enteritis por Clostridium perfringens y la enfermedad diarreica.
En otro caso particular, el huevo en polvo deshidratado puede inhibir el crecimiento de microbios adicionales tales como mohos y virus en el intestino del ganado. Además, el huevo en polvo deshidratado puede inhibir también enzimas adicionales tales como proteasas y lipasas en el intestino del ganado.
En un caso particular adicional, la composición antimicrobiana se puede administrar en forma acuosa mezclando la composición antimicrobiana con el agua de bebida para el ganado, en las que la composición antimicrobiana puede tener una concentración final de aproximadamente 100 a 200 partes por millón.
En aún otro caso particular, la composición antimicrobiana se puede administrar en forma de un aditivo alimentario, en el que la composición antimicrobiana puede tener una concentración final de aproximadamente 100 a 200 partes por millón.
También se proporciona un método para inhibir el crecimiento de patógenos entéricos en el intestino del ganado y la incidencia de las enfermedades relacionadas con ellos, y el método incluye administrar una composición antimicrobiana al ganado, y la composición antimicrobiana comprende:
(a)
una sustancia de lisis de la pared celular o su sal;
(b)
una sustancia antimicrobiana;
(c)
un agente secuestrante; y
(d)
un lantibiótico.
En un caso particular, la proporción de la sustancia de lisis de la pared celular o su sal, la sustancia antimicrobiana, el agente secuestrante y el lantibiótico es aproximadamente 50:150:50:20 en peso.
Además, se proporciona una composición antimicrobiana para inhibir el crecimiento de patógenos entéricos en el intestino del ganado y la incidencia de enfermedades relacionadas con ellos, y la composición antimicrobiana comprende:
(a)
una sustancia de lisis de la pared celular o su sal;
(b)
una sustancia antimicrobiana;
(c)
un agente secuestrante; y
(d)
un lantibiótico.
En un caso particular, los patógenos bacterianos entéricos seleccionados como objetivo incluyen los miembros de las siguientes familias de bacterias: Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella typhimurium y Salmonella mbandaka.
En otro caso particular, la sustancia de lisis de la pared celular o su sal puede ser lisozima.
En otro caso particular, la sustancia antimicrobiana puede ser huevo en polvo deshidratado y/o albúmina.
En otro caso particular, el agente secuestrante puede ser un ácido orgánico y/o un quelador de metal, y se puede seleccionar de etilendiamintetraacetato (EDTA) disódico, ácido cítrico o quitosano.
En otro caso particular, el lantibiótico puede ser nisina.
En otro caso particular, la composición antimicrobiana puede estar en forma pulverizada o en solución acuosa.
En otro caso particular, la composición antimicrobiana puede ser un aditivo para el pienso.
Otros aspectos y características de la presente invención serán aparentes para las personas de experiencia habitual en la técnica tras examinar la siguiente descripción de las realizaciones de la invención junto con las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Las realizaciones de la presente invención se entenderán más fácilmente con referencia a la siguiente descripción de las realizaciones preferidas y a las figuras adjuntas, en las que:
la Fig. 1 ilustra la concentración inhibitoria mínima (CIM) de lisozima contra Cl. perfringens,
la Fig. 2 ilustra la CIM de una mezcla que contiene lisozima, albúmina y ácido cítrico en una proporción 50:100:50 contra Cl. perfringens;
la Fig. 3 ilustra la inhibición de Cl. perfringens mediante lisozima, EDTA disódico y huevo en polvo deshidratado en una proporción 2:3:5 (Inovapure® Plus 532 de Canadian Inovatech Inc., Abbotsford, B.C., Canadá) a concentraciones de 100 y 200 ppm;
la Fig. 4 ilustra la CIM de Inovapure® Plus 532 contra E. coli;
la Fig. 5 ilustra la CIM de Inovapure® Plus 532 contra Salmonella typhimurium;
la Fig. 6 ilustra la CIM de Inovapure® Plus 532 contra Salmonella mbandaka;
la Fig. 7 ilustra la concentración inhibitoria fraccional (CIF) de lisozima y nisina contra Cl. perfringens; y
la Fig. 8 ilustra el efecto de lisozima, nisina, ácido cítrico y albúmina contra Cl. perfringens.
Descripción de la invención
Se conoce el uso de sustancias de lisis celular para descomponer las paredes celulares de las bacterias en el control o en la inhibición de bacterias en productos alimentarios para humanos. Por ejemplo, la enzima conocida comúnmente como lisozima (también conocida como EC 3.2.1.17 o muramidasa) se da de forma natural en varias secreciones mamíferas tales como leche, saliva y lágrimas. En la industria, la lisozima se extrae de claras de huevos de gallinas debido a su abundancia natural, ya que incluyen aproximadamente un 3% de la proteína. La lisozima es una proteína formada por un único péptido de 14,6 kDa que puede lisar células bacterianas mediante la escisión del enlace glicosídico \beta(1-4) entre el ácido N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina en la capa de peptidoglicano. La lisozima tiene un punto isoeléctrico extremadamente elevado (>10) y por lo tanto es sumamente catiónica a pH neutro o ácido. En disolución, lisozima es relativamente estable a pH bajo. También es activa en el intervalo de temperaturas de 1ºC hasta casi la ebullición, aproximadamente 100ºC.
Lisozima es eficaz contra ciertas bacterias grampositivas que incluyen la especie Clostridium. A modo de ejemplo, se ha usado lisozima en la industria quesera como un bioprotector durante más de 20 años para evitar el deterioro por fermentación butírica, que provoca la hinchazón tardía de los quesos semicurados, por Clostridium tyrobutyricum. Para una discusión sobre este tema véase "Identification of Clostridium tyrobutyricum as the causative agent of late blowing in cheese by species-specific PCR amplification", N Klijn, F F Nieuwenhof, J D Hoolwerf, C B van der Waals, y A H Weerkamp, Appl Environ Microbiol., agosto de 1995; 61 (8): 2919-2924.
En una realización de la invención, una composición antimicrobiana que contiene lisozima puede actuar también más en particular como un agente antibacteriano para controlar y prevenir las enfermedades relacionadas con bacterias patógenas entéricas en el ganado, mediante la administración de la composición antimicrobiana al ganado por medio del pienso. En un estudio experimental, se ha demostrado que lisozima es eficaz en la inhibición de la bacteria patógena Clostridium perfringens. La Figura 1 ilustra los datos obtenidos de las placas de concentración inhibitoria mínima ("CIM") para lisozima contra Clostridium perfringens. En ellas, lisozima muestra eficacia para inhibir Clostridium perfringens a una dosis entre 100 y 200 ppm. Se puede añadir lisozima al pienso para consumo animal, y más en particular al pienso para aves y cerdos, a esta concentración para controlar y prevenir los efectos patógenos entéricos de Clostridium perfringens, junto con otros crecimientos bacterianos.
Actualmente, el uso de antibióticos cuesta aproximadamente de 3 a 5 dólares estadounidenses por tonelada métrica de pienso (MTF) para mantener la eficacia. El mantenimiento de la misma eficacia equivalente mediante el uso de lisozima a 200 ppm costaría aproximadamente 20 dólares estadounidenses/MTF. Aunque el coste de lisozima puede incrementar el coste global del tratamiento de los animales, el uso de lisozima tiene la ventaja de reducir o eliminar la necesidad de antibióticos convencionales, de forma que se puede solventar cualquier problema relacionado con la resistencia a antibióticos, que puede surgir en una población dada como se describió anteriormente.
En una realización de la invención, una composición antimicrobiana que contiene una sustancia de lisis de la pared celular, tal como lisozima, una sustancia antimicrobiana, preferiblemente huevo en polvo deshidratado/albúmina y un agente secuestrante o agente quelante de metal se administran al ganado para reducir la incidencia de las enfermedades relacionadas con bacterias anteriormente mencionadas. En un estudio experimental, se ha demostrado que mediante la adición de huevo en polvo deshidratado y de un agente secuestrante/quelante de metal, tal como ácido etilendiamintetraacético disódico (EDTA disódico), ácido cítrico o quitosano, a la lisozima, hay una eficacia incrementada en la inhibición de Clostridium perfringens. Se prevé que esto es debido a los efectos sinérgicos entre lisozima, huevo en polvo deshidratado y el agente secuestrante/quelante de metal. Los datos experimentales referentes a la sinergia entre lisozima, ácido cítrico y albúmina se muestran en la Figura 2. La Figura 2 ilustra las placas de CIM de Clostridium perfringens inoculadas con una dilución de 100 veces de un cultivo nocturno. En este estudio experimental, la mezcla (Mezcla 1) contiene lisozima, albúmina y ácido cítrico en una proporción 1:3:1.
La Figura 2 ilustra que existe eficacia en la inhibición de Clostridium perfringens a aproximadamente 50 ppm cuando se usa la Mezcla 1 anteriormente descrita en las placas de CIM. Se debería indicar que, aunque la cantidad relativa de lisozima usada en el estudio experimental presente disminuyó en comparación con la concentración usada en el estudio experimental de la Figura 1, la eficacia de la composición se incrementó. También es importante indicar que lisozima representa solamente una fracción de la Mezcla 1 usada en el estudio experimental descrito en este momento (50 ppm), que condujo a la generación de los datos ilustrados en la Figura 2.
Una ventaja de esta realización de la invención es el coste relativamente bajo tanto de albúmina como de ácido cítrico en comparación con lisozima. Dados los precios actuales, la Mezcla 1 costaría aproximadamente 3 dólares estadounidenses/MTF a 50 ppm para que sea eficaz en el control de Clostridium perfringens.
También existen ciertos indicios de que el agente secuestrante/agente quelante de metal, es decir, ácido cítrico, puede ayudar también a prevenir el crecimiento de patógenos gramnegativos tales como Escherichia coli y Salmonella. En un estudio experimental adicional mediante el uso de la Mezcla 1, se descubrió que había un incremento de la actividad antimicrobiana contra patógenos gramnegativos. Se ha propuesto que la razón de esto es que el agente secuestrante/quelante de metal funciona como un antioxidante y es sinérgico con lisozima en estas situaciones. Al mantener más ácido el intestino individual del ganado, tal como el de aves y cerdos, se puede incrementar la eficacia global de la inhibición de Clostridium perfringens y de otros patógenos.
En otra realización de la invención, se puede añadir una composición antimicrobiana que contiene lisozima, EDTA disódico y huevo en polvo deshidratado al pienso del ganado y más en particular, aves de corral y/o cerdos para controlar e inhibir las bacterias y las enfermedades relacionadas con bacterias. En un estudio experimental adicional, se ha demostrado que una mezcla Inovapure® Plus^{TM} 532 de Canadian Inovatech Inc., Abbotsford, B.C., Canadá, es sinérgica y eficaz para el control de Clostridium perfringens. Los resultados del estudio experimental se ilustran en la Figura 3.
En este estudio experimental, se inoculó Clostridium perfringens a 10^{5} UFC/ml en medio LB complementado con un 0,15% de NaCl. Tanto 100 ppm como 200 ppm de Inovapure® Plus 532 inhibieron de forma eficaz el crecimiento de Clostridium perfringens. Además, se puso de manifiesto una respuesta a dosis por el hecho de que la disolución de 200 ppm fue más eficaz.
Uno de los beneficios de usar EDTA disódico como quelador de metal es que es un ingrediente aprobado para el uso en piensos para consumo animal tanto en Canadá como en Estados Unidos. Además, el propio EDTA tiene propiedades antimicrobianas, debido a que limita la disponibilidad de cationes en disolución. Al limitar los cationes en disolución, el EDTA compleja los cationes que actúan como puentes salinos entre macromoléculas de la membrana, tales como lipopolisacáridos, lo que provoca que las membranas de las células bacterianas se hagan inestables y se lisen.
En aún otra realización de la invención, los efectos sinérgicos de lisozima y EDTA se han observado en otros tipos de microorganismos, tales como bacterias grampositivas, más en particular, Staphylococcus aureus y diversas bacterias gramnegativas. También se ha observado que lisozima y EDTA son eficaces en ciertos tipos de hongos. Las Figuras 4, 5 y 6 ilustran la CIM de Inovapure® Plus 532 contra aislamientos clínicos de Salmonella typhimurium, Salmonella mbandaka y Escherichia coli.
En el estudio experimental que condujo a la generación de las Figuras 4, 5 y 6, las placas de CIM de E. coli, Salmonella typhimurium y Salmonella mbandaka se inocularon con una dilución de 10.000 veces de un cultivo nocturno. La Figura 4 ilustra que la eficacia de la inhibición de Escherichia coli con Inovapure® Plus 532 fue de aproximadamente 1250 ppm, mientras los cultivos de Salmonella se inhibieron ambos a aproximadamente 2500 ppm.
Un beneficio adicional obtenido a partir del uso de lisozima y EDTA es que se sabe que tanto lisozima como EDTA tienen un efecto inhibidor directo sobre la actividad enzimática de fosfolipasa C (o la \alpha-toxina producida por Clostridium perfringens) que provoca lesiones intestinales, lo cual es un beneficio adicional de la realización de la invención.
El uso de huevo en polvo deshidratado, que incluye diversos componentes del huevo, proporciona un beneficio añadido que se ha demostrado que tienen otros componentes nativos de las claras de huevos de gallinas. Se ha demostrado que los componentes nativos de las claras de huevos de gallinas funcionan bien en la inhibición de numerosas bacterias, levaduras, mohos y virus, así como proteasas y lipasas. Para una discusión de diversos ovo-antimicrobianos véase, por ejemplo, Natural Food Antimicrobial Systems, ed. A. S. Naidu, págs. 211-226, Nueva York: CRC Press, Inc, y Lineweaver, H., y C. W. Murray, 1947. "Identification of the trypsin inhibitor of egg white with ovomucoid". J. Biol. Chem. 171, 565-581. Además, la sinergia de las proteínas de huevo deshidratado sirve también para inhibir las toxinas producidas por Clostridium perfringens. Para una discusión de estos diversos efectos, que incluyen el efecto de la inmunoglobulina Y (IgY), derivados de las proteínas de huevo deshidratado véase, por ejemplo, Erhard, M.H., Gobel, E., Lewan, B., Losch, U., Stangassinger, M., 1997. "Systemic availability of bovine immunoglobulin G and chicken immunoglobulin Y after feeding colostrum and egg powder to newborn calves". Archives of Animal Nutrition, 50(4), 369-380; Jin, I.Z., Baidoo, S.K., Marquardt, R.R. Frohlich, A.A., 1998. "In vitro inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88 to piglet intestinal mucus by egg-yolk antibodies". Immunology and Medical Microbiology, 21, 313-321; Marquardt, R.R., 2000. "Control of Intestinal diseases in pigs by feeding specific chicken egg antibodies". En: Egg nutrition and biotechnology, Sim, J.S., Nakai, S., Guenter, W., (eds). CABI Publishing, 289-299; O'Farrelly, C., Branton, D., Wanke, C.A., 1992. "Oral ingestion of egg yolk immunoglobulin from hens immunized with an enterotoxigenic Escherichia coli strain prevents diarrhea in rabbits challenged with the same strain". Infection and Immunity, 60(7), 2593-2597.
En otra realización de la invención, se puede formar una composición que contiene además un lantibiótico para inhibir también el crecimiento de bacterias grampositivas y las enfermedades relacionadas en ganado y, más en particular, en poblaciones aviarias y porcinas. En un estudio experimental adicional, se ha demostrado que mediante la adición de un lantibiótico, tal como nisina, a lisozima se produce una eficacia incrementada en la inhibición de Clostridium perfringens, debida al efecto sinérgico entre la lisozima y el lantibiótico.
La Figura 7 ilustra los datos experimentales referentes a la sinergia entre nisina y lisozima obtenida durante el estudio experimental. Se inocularon las placas de concentración inhibitoria fraccional ("CIF") de Clostridium perfringens con una dilución de 100 veces de un cultivo nocturno. Se debería indicar que lisozima fue eficaz por sí sola en este estudio experimental a aproximadamente 120 ppm. Al incrementar la cantidad de nisina en el estudio experimental a 3 ppm, solamente se necesitaron 8 ppm de lisozima para conseguir un efecto bactericida sobre Clostridium perfringens.
\newpage
En otra realización de la invención, se puede administrar una composición antimicrobiana que contiene lisozima, huevo en polvo y/o albúmina, un agente secuestrante/quelante de metal, y un lantibiótico al ganado para inhibir el crecimiento bacteriano y las enfermedades relacionadas con bacterias en el ganado, y más en particular en poblaciones aviarias y porcinas. Preferiblemente, la composición se añade al agua o al pienso de una población aviaria y/o porcina para prevenir las enfermedades relacionadas con las bacterias entéricas. En un estudio experimental adicional, se descubrió que una composición que contenía un lantibiótico, tal como nisina, lisozima, albúmina y un agente secuestrante/quelante de metal, tal como ácido cítrico, tiene una eficacia elevada en la inhibición de Clostridium perfringens debido a la sinergia entre lisozima, nisina, albúmina y ácido cítrico.
La Figura 8 ilustra los datos experimentales referentes a la sinergia entre nisina, lisozima, ácido cítrico y albúmina determinados a partir del estudio experimental. La Figura 8 muestra placas de CIM de Clostridium perfringens inoculadas con una dilución de 100 veces de un cultivo nocturno. En el estudio experimental se usaron dos mezclas de la composición antimicrobiana (Mezcla 2 y Mezcla 3). La Mezcla 2 y la Mezcla 3 contuvieron lisozima, nisina, ácido cítrico y albúmina en las proporciones 33:17:50:150 y 50:20:50:150 (Inovapure® Plus), respectivamente. La Figura 8 demuestra que la dosis eficaz de la combinación de la Mezcla 3 contra Clostridium perfringens es aproximadamente 20 ppm. Así, mediante la adición de nisina, la dosis eficaz disminuyó desde aproximadamente 50 ppm (como se observó en la Mezcla 1 de la Figura 2) hasta 20 ppm. De nuevo, la cantidad de lisozima de la mezcla representa solamente una porción de la composición antimicrobiana total.
Una ventaja adicional de esta realización de la invención es que una mezcla de lisozima, nisina, ácido cítrico y albúmina para mantener la eficacia de la inhibición de Clostridium perfringens a 20 ppm cuesta actualmente aproximadamente menos de 1 dólar estadounidense/MTF.
En un estudio en jaulas más reciente, se usaron pollos para asar de un grupo de aves homogéneo. Se usaron cuatrocientas aves en el estudio, y se llevó a cabo durante 27 días. Todas las aves usadas en el estudio recibieron una vacuna rutinaria administrada in-ovo, en el criadero. No se usó una terapia farmacológica concomitante durante el estudio experimental. El estudio experimental se basó en un diseño de bloques completos aleatorizados. Se usaron ocho jaulas por tratamiento, y se administraron cinco tratamientos por bloque.
Los tratamientos fueron los siguientes:
1.
Sin medicar, sin exposición
2.
Sin medicar, con exposición
3.
Inovapure^{TM} Plus 50 mg/kg
4.
Inovapure^{TM} Plus 100 mg/kg
5.
MDB (metilendisalicilato de bacitracina) 50 g/t
La mezcla de la composición antimicrobiana de los tratamientos 3 y 4 fue Inovapure® Plus como se describió anteriormente.
En el quinto día del ensayo las aves se colocaron en grupos. El peso por jaula para cada grupo se mantuvo tan uniforme como fue posible. Se realizó una medida de peso adicional de cada ave de cada grupo en el día 14 y 27 del estudio experimental.
Los cadáveres de las aves que murieron durante el ensayo se recogieron para realizar una puntuación de las lesiones por medio de una necropsia llevada a cabo por un investigador. El propósito de la necropsia fue determinar la causa más probable de muerte o morbilidad. Se diagnosticó EN como la causa de mortalidad si se observaron lesiones intestinales.
El pienso que se administró a las aves durante el estudio fue un pienso basal de inicio y de crecimiento sin medicar. Las dietas se expusieron como dietas de inicio (día 0 a 18) y de crecimiento (día 18 a 27). Se consideró que estos calendarios representan las dietas de la industria local. Además, se monitorizó el consumo de pienso de las aves.
En el día 14 se inoculó oralmente a todas las aves excepto a las del tratamiento 1 con un inóculo mixto de ovoquistes de E. acervulina y E. maxima. Los ovoquistes proporcionaron una exposición coccidial ligera para estimular la proliferación de Clostridium en el intestino de las aves. Inicialmente en el día 18 todas las aves excepto las del tratamiento 1 se alimentaron mediante sonda oral con un cultivo en caldo de C. perfringens de aproximadamente 10^{8} ufc/ml. Después se administró a las aves un cultivo de caldo nuevo diariamente durante tres días en los días 18, 19 y 20.
En el día 22 se seleccionaron aleatoriamente dos aves de cada jaula, se sacrificaron y se examinó la presencia de lesiones de EN. Si hubo lesiones presentes, se les asignó una puntuación. La puntuación se basó en una escala de 0 a 3, siendo 0 normal y 3 la más grave. En el día 27 se sacrificó el resto de las aves y se realizó la puntuación de las lesiones.
La siguiente tabla presenta los resultados del estudio en jaulas:
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100 
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden deducir varios hallazgos significativos del anterior estudio en jaulas. En primer lugar, hubo una reducción significativa de la tasa de mortalidad de las aves a las que se administró la composición antimicrobiana. Además, hubo una reducción significativa del desarrollo de lesiones intestinales en las aves de los tratamientos 3 y 4. También hubo una respuesta a dosis provocada en los sujetos de ensayo, como se puede observar entre los tratamientos 3 y 4. También hubo una ganancia de peso perceptible observada en los tratamientos en los que se administró la composición antimicrobiana. Además de la ganancia de peso experimentada por las aves, hubo una disminución significativa del índice de conversión de pienso (FCR) (la ingesta media de pienso/peso medio de las aves). Dado lo anterior, la composición antimicrobiana tiene una eficacia antimicrobiana/promotora del crecimiento similar a la del antibiótico MDB.
Se llevó a cabo un estudio adicional en corral en el que se administró una composición antimicrobiana que incluía Inovapure® Plus 532. El solicitante emprendió el estudio experimental para analizar el efecto de Inovapure® Plus 532 alimentario a 100 y 200 ppm sobre el rendimiento de pollos para asar criados en un medio de corral, expuestos a Clostridium perfringens de tipo A.
Los parámetros del experimento fueron sustancialmente similares a los del estudio en jaulas anteriormente descrito. Este estudio en corral se llevó a cabo con un diseño de bloques completos aleatorizados mediante el uso de un único tipo de grupo de aves, las vacunas convencionales se administraron in-ovo en el criadero, y las dietas de las aves no contuvieron agentes anticoccídicos o antibióticos distintos de los prescritos en el diseño experimental. El estudio se llevó a cabo durante 41 días.
La composición antimicrobiana, como se describió anteriormente, se administró a las aves continuamente durante todo el crecimiento. La composición antimicrobiana se mezcló con una dieta completa en una proporción de inclusión de 0, 100 ó 200 ppm. La composición antimicrobiana se incorporó en una premezcla intermedia añadiendo toda la cantidad necesaria para cada tonelada con 5 kg de un ingrediente principal, tal como trigo, y se mezcló a fondo manualmente. La premezcla intermedia se añadió después a la mezcla completa y se mezcló.
Se administró una exposición coccidial a los pollos para estimular la proliferación de Clostridium en el intestino de las aves.
A continuación se proporcionan los resultados obtenidos a partir del estudio experimental:
TABLA 1 Efecto de la composición antimicrobiana sobre la mortalidad total
1 
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TABLA 2 Efecto de la composición antimicrobiana sobre la mortalidad por enteritis necrótica
2 
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TABLA 3 Efecto medio del tratamiento sobre el crecimiento y el rendimiento de la utilización del pienso
3
Como se puede observar a partir de la Tabla 1 anterior, la tasa de mortalidad media total disminuyó cuando se administró la composición antimicrobiana a los sujetos de ensayo. También se provocó una respuesta a dosis relacionada con la composición basándose en la mortalidad total. En el estudio experimental hubo también una cantidad significativa de EN que dio cuenta de un componente de la mortalidad total. La Tabla 2 ilustra que mediante la administración de la composición antimicrobiana la mortalidad provocada por EN se redujo significativamente. De nuevo se observó una respuesta a dosis.
Además de lo anterior, se monitorizó cuidadosamente el consumo de pienso y el peso de las aves en el estudio experimental, lo que dio como resultado los datos resumidos en la Tabla 3. La Tabla 3 ilustra que hubo una disminución de FCR cuando se administró la composición antimicrobiana. Tanto en las clases en fase de crecimiento como en fase de acabado de las aves hubo también un incremento de la ganancia de peso.
El método de administración de la composición antimicrobiana al ganado, que incluye tanto poblaciones aviarias como porcinas, es preferiblemente a través de la vía oral por medio del agua de bebida o del pienso. Para administrar la composición antimicrobiana en forma acuosa, por ejemplo en el agua de bebida, la composición se puede producir en forma de polvo y después disolverla en el agua de bebida para producir una concentración final de aproximadamente 100 a 200 ppm. Para obtener la disolución óptima, se deberían seleccionar los ingredientes activos para que sean fácilmente solubles. Para la administración por medio del pienso, la composición antimicrobiana se añade preferiblemente a un subgrupo de la dieta basal de un animal para formar una premezcla de aproximadamente una concentración del 1 al 2%. La premezcla se puede mezclar después hasta proporcionar el pienso final a aproximadamente 100 a 200 ppm. La mezcla se debería usar en piensos para las fases de inicio, crecimiento y acabado.

Claims (23)

1. Un agente para inhibir el crecimiento de patógenos entéricos en el intestino del ganado, y dicho agente se proporciona como una composición antimicrobiana que comprende:
(a)
una sustancia de lisis de la pared celular o su sal;
(b)
al menos uno de huevo en polvo deshidratado y albúmina; y
(c)
un agente secuestrante.
2. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que el agente es también para prevenir y tratar la infección gastrointestinal en el ganado.
3. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1 ó 2, en la que los patógenos entéricos incluyen los miembros de las siguientes familias de bacterias: Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella typhimurium y Salmonella mbandaka.
4. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que la sustancia de lisis de la pared celular o su sal es lisozima.
5. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que la composición antimicrobiana incluye tanto huevo en polvo deshidratado como albúmina.
6. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que el agente secuestrante es un ácido orgánico.
7. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que el agente secuestrante es un quelador de metal.
8. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que el agente secuestrante se selecciona del grupo que consiste en: (a) etilendiamintetra-acetato (EDTA) disódico; (b) ácido cítrico; (c) quitosano.
9. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, que incluye además un lantibiótico.
10. La composición antimicrobiana según la reivindicación 9, en la que el lantibiótico es nisina.
11. La composición antimicrobiana según la reivindicación 9, en la que la proporción de la sustancia de lisis de la pared celular o su sal, al menos uno de huevo en polvo deshidratado y albúmina, el agente secuestrante y el lantibiótico es 50:150:50:20 en peso.
12. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que la composición antimicrobiana está en forma de polvo.
13. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que la composición antimicrobiana está en forma de disolución acuosa.
14. La composición antimicrobiana según la reivindicación 13, en la que la composición antimicrobiana es hidrosoluble para permitir que la composición antimicrobiana se mezcle con el agua de bebida para la administración al ganado.
15. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que la composición antimicrobiana es un aditivo para el pienso.
16. La composición antimicrobiana según la reivindicación 2, en la que las infecciones gastrointestinales incluyen enteritis necrótica, enteritis por Clostridium perfringens y enfermedad diarreica.
17. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que la proporción de la sustancia de lisis de la pared celular o su sal, al menos uno de huevo en polvo deshidratado y albúmina, y el agente secuestrante es 2:5:3 en peso.
18. La composición antimicrobiana según la reivindicación 1, en la que la composición antimicrobiana incluye huevo en polvo deshidratado, y el huevo en polvo deshidratado es capaz de inhibir microbios adicionales en el intestino del ganado.
19. La composición antimicrobiana según la reivindicación 18, en la que los microbios adicionales incluyen mohos y virus.
20. La composición antimicrobiana según la reivindicación 18, en la que la composición antimicrobiana es huevo en polvo deshidratado, y el huevo en polvo deshidratado es capaz de inhibir enzimas adicionales en el intestino del ganado.
21. La composición antimicrobiana según la reivindicación 20, en la que las enzimas adicionales incluyen proteasas y lipasas.
22. La composición antimicrobiana según cualquier reivindicación precedente, en la que la composición contiene además un lantibiótico.
23. La composición antimicrobiana según cualquier reivindicación precedente, en la que la proporción de la sustancia de lisis de la pared celular o su sal, al menos uno de huevo en polvo deshidratado y albúmina, y el agente secuestrante es 2:5:3 en peso.
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