BRPI0314118B1 - composição antimicrobiana como agente para a supressão do desenvolvimento de agentes patogênicos entéricos no intestino de animais de criação e/ou para a prevenção e tratamento de infecções gastrointestinais em animais de criação - Google Patents

Abstract

"composição antimicrobiana e método para uso". a presente invenção refere-se a uma composição antimicrobiana e a um método para administração da composição antimicrobiana através da água de beber ou ração à animais de criação, em que a composição antimicrobiana é composta de lisozima e vários outros agentes que atuam sinergisticamente com a lisozima, tais como pó de ovo seco, albume, um agente de captura e/ou um lantibiótico. a composição é usada para inibir o desenvolvimento de e doenças e efeitos epidemiológicos significativos causados por clostridium perfringens, e. coli e salmonella, no intestino dos animais de criação. mais particularmente, a composição antimicrobiana e o método se referem a um aditivo para ração que pode ser administrado a aves e/ou suínos através de sua ração. o uso de tal aditivo para ração também pode inibir outros agentes patogênicos entéricos que podem estar presentes no intestino dos animais de criação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para '“COMPOSIÇÃO ANTIMICROBIANA COMO AGENTE PARA A SUPRESSÃO DO DESENVOLVIMENTO DE AGENTES PATOGÊNICOS ENTÉRICOS NO INTESTINO DE ANIMAIS DE CRIAÇÃO E/OU PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE INFECÇÕES GASTROINTESTINAIS EM ANIMAIS DE CRIAÇÃO".

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a uma composição e método para supressão do desenvolvimento de microorganismos no intestino de animais de criação e mais particularmente a uma composição antimicrobiana que pode ser administrada a animais de criação como um aditivo ã água ou ração para suprimir o desenvolvimento de microorganismos patogênicos no intestino. Antecedentes da Invenção Bactérias causam numerosas doenças intestinais em animais de criação. Esses tipos de bactérias caem na classe geral de bactérias entéricas patogênicas. Uma de tais bactérias que causa doença intestinal é Ctostri-dium perfringens, a qual causa enterite necrótíca ("NE'1) em aves e enterite por Clostridium perfringens ("CPE") em suínos. Escherichia coli, outro agente patogênico entérico comum, causa doença em muitos tipos de animais, tal como a doença diarréica em filhotes de porcos. A cada cano, a NE, CPE e doenças diarréicas impõem perdas financeiras significativas às indústrias de criação de aves e porcos. Além da CA perfringens e E. coli, vários sorotipos de Salmoneila causam doenças em animais as quais podem ser transmitidas para seres humanos através do consumo de produtos alimentícios animais.

Casos de NE e CPE foram reportados em quase todas as áreas do mundo e exercem um papel econômico significativo na viabilidade das indústrias de aves e suínos. Por exemplo, estima-se que a perda mundial anual devido a infecções por NE seja mais de dois bilhões de dólares. A NE foi descrita primeiro como uma doença de aves domésticas em 1961. O Clostridium perfringens é encontrado ocorrendo naturalmente no intestino das aves. Sob condições favoráveis, contudo, o Clostridium perfringens pode se multiplicar rapidamente e liberar toxinas, as quais causam grandes lesões consistindo em áreas largas de recrose no revestimento do intestino delgado inferior. Em alguns casos, as bactérias também A,·- rvi» podem afetar o ceco e o fígado. Condições favoráveis que levam à proliferação de Clostridium perfringens podem ser induzidas por estresses intestinais causados por fatores de risco dietéticos e outros fatores tais como coccidio-se, etc., atuando como fatores que predispõem à doença. A forma clássica de NE tende a ocorrer como um surto, afetando principalmente aves entre a faixa de idade de duas a cinco semanas e é caracterizada por um curso agudo de perda de apetite, depressão, penas eriçadas, diarréia e ganho de peso diminuído, o qual também pode ser seguido por morte súbita. A taxa de mortalidade na criação não tratada pode atingir 10% ou mais. Similarmente, em suínos, o Clostridium perfringens do tipo A e do tipo C causa diarréia, ganho de peso diminuído e, algumas vezes, morte em formas agudas. A diarréia bacteriana, de outro modo conhecida como doença diarréica, se tornou uma doença economicamente importante na indústria de animais de criação e mais particularmente em suínos, como um resultado de intensificação aumentada de gerenciamento da ninhada de porcos - uma tendência com grandes rebanhos e desmame precoce. A doença diarréica causada por Escherichia coli enterotoxigênica é a doença entérica mais comum encontrada em porcos neonatais. No início da doença, a Escherichia coli coloniza o intestino através de adesão ao epitélio do intestino delgado. Uma vez que a E. coli coloniza, as bactérias, então, produzem toxinas que causam distúrbios gastrointestinais. O processo de infestação pode ocorrer em porcos neonatais e pós-desmame. A infecção pós-desmame de Escherichia coli, contudo, é a principal causa de perda econômica na indústria de suínos devido às taxas reduzidas de crescimento e taxas aumentadas de mortalidade. Uma das causas mais comuns de mortalidade pós-desmame em fazendas de porcos, matando 1,5-2% dos porcos desmamados, é a doença diarréica.

Uma variedade de antibióticos, tais como virginiamicina e baci-tracina, tem sido usada para controlar e prevenir Clostridium perfringens e outras doenças relacionadas. Esses antibióticos são administrados a várias populações de aves e suínos através de adição dos mesmos à sua ração. O desenvolvimento continuado de resistência e contra antibióticos com grau de ração, contudo, tem causado um retrocesso na prevenção e controle das doenças acima mencionadas. Ainda, em Julho de 1999, a comunidade Européia baniu o uso de antibióticos com grau de ração, incluindo virginiamici-na e bacitracina. Uma ação similar pode ser tomada brevemente no resto do mundo devido à consciência pública crescente quanto aos impactos negativos do uso de antibiótico e seus efeitos sobre o ambiente e a saúde humana. Um dos problemas mais significativos associados à redução e eliminação de antibióticos para uso em aves e suínos será o aumento da incidência de NE, junto com um aumento potencial na incidência de CPE e doença di-arréica. Além disso, outros setores da indústria de animais serão imediatamente ameaçados devido à prevalência de várias doenças após retirada dos antibióticos. Uma retirada também resultará em uma diminuição na segurança do alimento que é consumido por seres humanos como produtos alimentícios animais. Pelas razões precedentes, existe uma necessidade por uma alternativa de custo eficaz para reduzir a incidência de ou prevenir doenças gastrointestinais tais como NE, CPE e doença diarréica em animais e mais particularmente em populações de aves e suínos.

Sumário da Invenção Portanto, é um objetivo da presente invenção proporcionar uma composição antimicrobiana aperfeiçoada e um método para administração da mesma para auxiliar no controle de infecção patogênica entérica em criações e mais particularmente em populações de aves e suínos.

Assim, de acordo com uma concretização da invenção, é proporcionada uma nova composição antimicrobiana e um novo método para administração da composição antimicrobiana para suprimir o desenvolvimento de agentes patogênicos entéricos em criações. Em particular, a composição antimicrobiana inclui lisozima em combinação com uma substância antimicrobiana e um agente de captura para reduzir o desenvolvimento de e doenças ou efeitos epidemiológicos significativos causados por Cfostrídium perfringens, E. coli e Safmonella e para se dirigir a pelo menos alguns dos problemas identificados acima. A composição antimicrobiana e o método de acordo com as concretizações da invenção suprime vários tipos de bactérias que podem estar presentes in vivo no intestino de aves e suínos as quais pode afetar a saúde dos animais e podem levar a complicações tais como ganho de peso diminuído e morte. Mais particularmente, a composição antimicrobiana e o método se referem a um aditivo para água ou ração que pode ser administrado à criação para inibir o desenvolvimento de Clostridium perfringens, a qual causa NE em aves e CPE em suínos. O uso de tal aditivo para água ou ração também pode inibir o desenvolvimento de E. coli, a qual causa doença diarréica em suínos e também pode inibir o desenvolvimento de Salmonefla Typhimurium e Salmonella Mbandaka, incluindo outros agentes patogênicos entéricos presentes no intestino de aves e porcos.

De acordo com uma concretização da invenção, é proporcionado um método para supressão do desenvolvimento de agentes patogênicos entéricos no intestino de criações de animais e a incidência de doenças relacionadas aos mesmos, o método incluindo administração de uma composição antimicrobiana a animais de criação, a composição antimicrobiana incluindo: (a) uma substância que causa lise da parede celular ou seu sal; (b) uma substância antimicrobiana; e (c) um agente de captura.

Em um caso particular, a proporção da substância que causa lise da parede celular ou seu sal, da substância antimicrobiana e do agente de captura é de 2:5:3 em peso.

Em populações de aves e suínos, agentes patogênicos entéricos particulares objetivados incluem membros das seguintes famílias de bactérias: Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium e Salmonella Mbandaka.

Em outro caso em particular, a substância que causa lise da parede celular ou seu sal pode ser uma lisozima.

Em outro caso em particular, a substância antimicrobiana pode ser pó de ovo seco e/ou albume.

Em outro caso em particular, o agente de captura pode ser um ácido orgânico e/ou um quelante de metal e pode ser selecionado de etile-nodiaminatetraacetato de dissódio (EDTA), ácido cítrico ou quitosana.

Em outro caso em particular, a composição ainda compreende um lantiobiótico o qual pode ser nisina.

Em outro caso em particular, a composição antimicrobiana está na forma em pó ou de solução aquosa.

Em outro caso em particular, a composição antimicrobiana é administrada como um aditivo para ração. A administração da composição antimicrobiana é para suprimir a incidência de ou tratar enterite necrótica, enterite por Clostridium perfringens e doença diarréica.

Em outro caso em particular, o pó de ovo seco pode suprimir o desenvolvimento de micróbios adicionais, tais como mofos e vírus no intestino dos animais de criação. Ainda, o pó de ovo seco pode também suprimir enzimas adicionais, tais como proteases e lipases, no intestino dos animais de criação.

Em um outro caso em particular, a composição antimicrobiana pode ser administrada na forma aquosa através de mistura da composição antimicrobiana com água de beber para os animais de criação, onde a composição antimicrobiana pode ter uma concentração final de aproximadamente 100 a 200 partes por milhão.

Em ainda outro caso em particular, a composição antimicrobiana pode ser administrada como um aditivo para a ração, onde a composição antimicrobiana pode ter uma concentração final de aproximadamente 100 a 200 partes por milhão.

De acordo com outra concretização da invenção, é proporcionado um método para supressão do desenvolvimento de agentes patogênicos entéricos no intestino de animais de criação e da incidência de doenças relacionadas aos mesmos, o método incluindo administração de uma composição antimicrobiana aos animais de criação, a composição antimicrobiana compreendendo: (a) uma substância que causa lise da parede celular ou seu sal; (b) uma substância antimicrobiana; (c) um agente de captura; e (d) um lantibiótico.

Em uma caso em particular, a proporção da substância que causa lise da parede celular ou seu sal, da substância antimicrobiana, do agente de captura e do lantibiótico é de aproximadamente 50:150:50:20 em peso.

De acordo com outra concretização da invenção, é proporcionada uma composição antimicrobiana para supressão do desenvolvimento de agentes patogênicos entéricos no intestino de animais de criação e da incidência de doenças relacionadas aos mesmos, a composição antimicrobiana compreendendo: (a) uma substância que causa lise da parede celular ou seu sal; (b) uma substância antimicrobiana; (c) um agente de captura; e (d) um lantibiótico.

Em um caso em particular, os agentes patogênicos entéricos particulares objetivados incluem membros das seguintes famílias de bactérias: Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella Typhimurium e Salmonella Mbandaka.

Em outro caso em particular, a substância que causa lise da parede celular ou seu sal pode ser uma lisozima.

Em outro caso em particular, a substância antimicrobiana pode ser pó de ovo seco e/ou albumina.

Em outro caso em particular, o agente de captura pode ser um ácido orgânico e/ou um quelante de metal e pode ser selecionado de etile-nodiaminatetraacetato de dissódio (EDTA), ácido cítrico ou quitosana.

Em outro caso em particular, o lantibiótico o qual pode ser nisi-na.

Em outro caso em particular, a composição antimicrobiana pode estar na forma em pó ou de solução aquosa.

Em outro caso em particular, a composição antimicrobiana pode ser um aditivo para ração.

Outros aspectos e características da presente invenção se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica quando de revisão da descrição a seguir das concretizações da invenção junto com as figuras em anexo.

Breve Descrição dos Desenhos As concretizações da presente invenção serão mais claramente compreendidas com referência à descrição a seguir das concretizações preferidas e às figuras em anexo, nas quais: A Fig. 1 ilustra a concentração inibitória mínima (MIC) de lisozi-ma contra Cl. perfringens; A Fig. 2 ilustra a MIC de uma mistura contendo lisozima, albume e ácido cítrico em uma proporção de 50:100:50 contra Cl. perfringens-, A Fig. 3 ilustra a inibição de Cl. perfringens pela lisozima, EDTA dissódico e pó de ovo seco em uma proporção de 2:3:5 (Inovapure® Plus 532 da Canadian Inovatech Inc., Abbotsford, B.C., Canadá) em concentrações de 100 e 200 ppm; A Fig. 4 ilustra a MIC de Inovapure® Plus 532 contra E. coli; A Fig. 5 ilustra a MIC de Inovapure® Plus 532 contra Salmonella Typhimurium; A Fig. 6 ilustra a MIC de Inovapure® Plus 532 contra Salmonella Mbandaka; A Fig. 7 ilustra a concentração inibitória fracional (FIC) de lisozima e nisina contra Cl. Perfringens; e A Fig. 8 ilustra o efeito da lisozima, nisina, ácido cítrico e albume contra Cl. perfringens.

Descrição da Invenção No controle ou supressão de bactérias em produtos alimentícios para seres humanos, o uso de substâncias que causam lise da célula para decompor as paredes celulares das bactérias é conhecido. Por exemplo, a enzima comumente conhecida como lisozima (também conhecida como EC 3.2.1.17 ou muramidase) ocorre naturalmente em várias secreções de mamíferos, tais como leite, saliva e lágrimas. Na indústria, a lisozima é extraída de claras de ovos de galinha devido à sua abundância natural, incluindo aproximadamente 3% da proteína. A lisozima é uma proteína peptídica simples de 14,6 kDa que pode realizar a lise de células bactérias através de divagem a ligação glicosídica β(1 -4) entre o ácido A/-acetilmurâmico e a /V-acetilgluco-samina na camada de peptidogiicana. A lisozima tem um ponto isoelétrico extremamente alto (> 10) e, conseqüentemente, é altamente catiônica em um pH neutro ou ácido. Em solução, a lisozima é relativamente estável em um baixo pH. Ela também é ativa sobre a faixa de temperatura de 1°C a próximo da ebulição, aproximadamente 100°C. A lisozima é eficaz contra determinadas bactérias Gram positivas, incluindo espécies Clostrídium. À guisa de exemplo, a lisozima tem sido usada na indústria de queijo como um bioprotetor há mais de 20 anos para prevenir degradação butírica, o que causa a ventilação tardia de queijos se-miduros, pela Clostrídium tyrobutyricum. Para uma discussão desse tópico veja Identification of Clostrídium tyrobutyricum as the causative agent of late blowing in cheese by species-specific PCT amplification, N. Klijn, F.F. Ni-euwenhof, J.D. Hoolwerf, C.B. van der Waals e A.H. Weerkamp, Appl. Envi-ron. Microbiol., Agosto de 1995; 61 (8): 2919-2924.

Em uma concretização da invenção, uma composição antimicro-biana contendo lisozima também pode atuar mais particularmente como um a nti bactéria no para controlar e prevenir doenças relacionadas a bactérias patogênicas entéricas em animais de criação através de administração da composição antimicrobiana aos animais através de sua ração. Em um estudo piloto, foi mostrado que a lisozima é eficaz na inibição da bactéria patogênica Clostrídium perfringens. A Figura 1 ilustra os dados obtidos para placas de concentração inibitória mínima ("MIC") para lisozima contra Clostri-díum perfringens. Aqui, a lisozima mostra eficácia com relação à inibição de Clostrídium perfringens em uma dose de entre 100 e 200 ppm. A lisozima pode ser adicionada à ração dos animais e, mais particularmente, ração de aves e suínos, nessa concentração, de forma a controlar e prevenir os efeitos patogênicos entéricos do Clostrídium perfringens, junto com o desenvolvimento de outras bactérias.

Atualmente, o uso de antibiótico custa aproximadamente $3 dólares americanos a $5 dólares americanos por tonelada métrica de ração (MTF) de forma a manter a eficácia. Para manter a mesma eficácia equivalente usando-se lisozima a 200 ppm custaria aproximadamente $20 dólares americanos/MTF. Embora o custo da lisozima possa aumentar o custo global de tratamento dos animais, o uso de lisozima tem a vantagem de redução ou eliminação da necessidade de antibióticos convencionais, de modo que quaisquer questões com relação à resistência a antibióticos, as quais podem surgir em uma determinada população, conforme descrito acima, podem ser superadas.

Em uma concretização da invenção, uma composição antimicro-biana contendo uma substância de lise da parede celular, tal como lisozima, uma substância antimicrobiana, de preferência pó de ovo seco/albumina e um agente de captura ou agente de quelação de metal, é administrada a animais de criação para reduzir a incidência das doenças relacionadas às bactérias acima mencionadas. Em um estudo piloto, foi mostrado que através da adição de pó de ovo seco e um agente de captura/quelação de metal, tal como ácido etileno diamina tetraacético dissódico (EDTA dissódico), ácido cítrico ou quitosana, à lisozima, existe uma eficácia aumentada com relação à inibição de Clostrídium perfringens. É antecipado que isso se deve aos efeitos sinergísticos entre a lisozima, pó de ovo seco e o agente de captura/quelação de metal. Dados experimentais com relação às sinergias entre a lisozima, ácido cítrico e albume são mostrados na Figura 2. a Figura 2 ilustra as placas de MIC de Clostrídium perfringens inoculado com uma diluição a 100 vezes de uma cultura durante a noite. Nesse estudo piloto, a mistura (Mistura 1) contém lisozima, albume e ácido cítrico em uma proporção de 1:3:1. A Figura 2 ilustra que existe uma eficácia com relação à inibição de Clostrídium perfringens a aproximadamente 50 ppm quando usando a Mistura 1 acima descrita em placas de MIC. Deve ser observado que, embora a quantidade relativa de lisozima usada no presente estudo piloto tenha diminuído comparado à concentração usada no estudo piloto da Figura 1, a eficácia da composição aumentou. Também é importante observar que a lisozima representa apenas uma fração da Mistura 1 usada no estudo piloto presentemente descrito (50 ppm) que levou à geração dos dados ilustrados na Figura 2.

Uma vantagem dessa concretização da invenção é os baixos custos relativos do albume e ácido cítrico quando comparado à lisozima. Dados os preços atuais, a Mistura 1 custaria aproximadamente $3 dólares americanos/MTF a 50 ppm de forma a ser eficaz no controle de Clostrídium perfríngens.

Existe também alguma indicação de que o agente de captu-ra/agente de quelação de metal, isto é, ácido cítrico, pode também ajudar a prevenir o desenvolvimento de agentes patogênicos gram negativos, tais como Escherichia coli e Salmonella. Em um outro estudo piloto usando-se Mistura 1, descobriu-se que houve um aumento na atividade antimicrobiana contra agentes patogênicos gram negativos. Foi sugerido que a razão para isso é que o agente de captura/quelação de metal funciona como um antio-xidante e é sinergístico com a lisozima nessas situações. Mantendo-se o intestino de animais de criação, tais como aves e porcos, mais ácido, a eficácia global de inibição de Clostrídium perfríngens e outros agentes patogênicos pode ser aumentada.

Em outra concretização da invenção, uma composição antimicrobiana contendo lisozima, EDTA dissódico e pó de ovo seco pode ser adicionada à ração dos animais de criação e, mais particularmente, aves e/ou suínos de forma a controlar e suprimir as bactérias e doenças relacionadas às bactérias. Em um outro estudo piloto, foi mostrado que uma mistura de Inovapure® Plus® 532 da Canadian Inovatech Inc., Abbotsford, B.C., Canadá, é sinergística e tem sucesso no controle de Clostrídium perfríngens. Os resultados do estudo piloto são ilustrados na Figura 3.

Nesse estudo piloto, Clostrídium perfríngens foi inoculado a 105 CFU/ml em meio LB suplementado com NaCI a 0,15%. 100 ppm e 200 ppm de Inovapure® Plus 532 inibiram com sucesso o desenvolvimento do Clos-tridium perfríngens. Além disso, uma resposta à dose foi evidenciada pelo fato de que a solução a 200 ppm obteve mais sucesso.

Um dos benefícios do uso de EDTA dissódico como o quelante de metal é que ele é um ingrediente aprovado para uso em ração para animais no Canadá e nos Estados Unidos. Além disso, o EDTA em si tem propriedades antimicrobianas porque ele limita a disponibilidade de cátions em uma solução. Ao limitar os cátions em uma solução, o EDTA forma complexos com os cátions que atuam como pontes de sal entre as macromoléculas da membrana, tais como lipopolissacarídeos, fazendo com que as membranas das células bacterianas se tornam instáveis e sofram lise.

Em ainda outra concretização da invenção, efeitos sinergísticos da lisozima e EDTA foram observados sobre outros tipos de microorganismos, tais como bactérias gram positivas, mais particularmente Staphylo-coccus aureus e várias bactérias gram negativas. Também foi observado que a lisozima e EDTA são eficazes contra determinados tipos de fungos. As Figuras 4, 5 e 6 ilustram a MIC de Inovapure® Plus 532 contra isolados clínicos de Salmonella Typhimurium, Salmonella Mbandaka e Escherichia coli.

No estudo piloto que levou à geração das Figuras 4, 5 e 6, as placas de MIC de E. coli, Salmonella Typhimurium e Salmonella Mbandaka foram inoculadas com uma diluição a 100 vezes de uma cultura durante a noite. A Figura 4 ilustra que a eficácia com relação à inibição de Escherichia coli com Inovapure® Plus 532 era de aproximadamente 1250 ppm, enquanto que as culturas de Salmonella foram inibidas a aproximadamente 2500 ppm.

Um outro benefício obtido através do uso de lisozima e EDTA é que sabe-se que a lisozima e o EDTA têm um efeito inibitório direto sobre a atividade enzimática da fosfolipase C (ou a alfa toxina produzida pelo Clos-tridium perfringens), a qual causa lesões intestinais, um outro benefício da concretização da invenção. O uso de pó de ovo seco, o qual inclui vários componentes do ovo, proporciona o benefício adicional de que outros componentes nativos das claras de ovos de galinhas tenham sido mostrados. Foi mostrado que componentes nativos das claras de ovos funcionam bem na inibição de numerosas bactérias, levedos, mofos e vírus, bem como proteases e lipases.

Para uma discussão de vários ovos-antimicrobianos veja, por exemplo, Natural Food Antlmicrobial Systems, ed. A.S. Naidu, páginas 221-226, New York: CRC Press, Inc. e Lineweaver, H. e C.W. Murray, 1947, Identification of the trypsin inhibitor of egg white with ovomucoid. J. Biol. Chem. 171, 565-581. Além disso, as sinergias das proteínas do ovo seco também servem para inibir as toxinas que são produzidas pelo Clostridium perfringens. Para uma discussão desses vários efeitos incluindo o efeito de imunoglobulina Y (IqY) derivado de proteínas de ovo seco veja, por exemplo, Erhard, M.H., Gobel, E., Lewan, B., Losch, U., Stangassinger, M., 1997. Systemic availabi-lity of bovine immunoglobulin G and chiken immunoglobulin Y after feeding colostrum and egg powder to newborn calves. Archives of Animal Nutrition, 50 (4), 369-380; Jin, I.Z., Baidoo, S.K., Marquardt, R.R. Frohlich, A.A., 1998. In vitro inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88 to piglet intestinal mucus by egg-yolk antibodies. Immunology and Medicai Microbio-logy, 21, 313-321; Marquardt, R.R., 2000. Control of intestinal diseases in pigs by feeding specific chicken egg antibodies. Em: Egg nutrition and biote-chnology, Sim, J.S., Nakai, S., Guenter, W. (editors). CABI Publishing, 289-299; 0'Farrelly, C., Branton, D., Wanke, C.A. 1992. Oral ingestion of egg yolk immunoglobulin from hens immunized with an enterotoxigenic Escherichia coli strain prevents diarrhea in rabbits challenged with the same strain. lnfec-tion and Immunity, 60 (7), 2593-2597.

Em outra concretização da invenção, uma composição ainda contendo um lantibiótico pode ser formada para suprimir também o desenvolvimento de bactérias gram positivas e doenças relacionadas em animais de criação e, mais particularmente, em populações de aves e suínos. Em um outro estudo piloto, foi mostrado que através da adição de um lantibiótico, tal como nisina, à lisozima, há uma eficácia aumentada com relação à inibição de Clostridium perfringens devido aos efeitos sinergísticos entre a lisozima e o lantibiótico. A Figura 7 ilustra dados experimentais com relação às sinergias entre a nisina e lisozima obtidos durante esse estudo piloto. Placas de concentração inibitória fracional ("FIC") de Clostridium perfringens foram inocu- ladas com uma diluição a 100 vezes de uma cultura durante a noite. Deve ser observado que a lisozima era eficaz nesse estudo piloto apenas a aproximadamente 120 ppm. Através de aumento da quantidade de nisina no estudo piloto para 3 ppm, apenas 8 ppm de lisozima eram requeridos para se obter um efeito bactericida sobre o Clostridium perfringens.

Em outra concretização da invenção, uma composição antimi-crobiana contendo lisozima, ovo em pó e/ou albume, um agente de captu-ra/quelação de metal e um lantibiótico pode ser administrada a animais de criação para suprimir o desenvolvimento bacteriano e doenças relacionadas à bactérias nos animais de criação e, mais particularmente, em populações de aves e suínos. De preferência, a composição é adicionada à água ou ração de uma população de aves e/ou suínos para prevenir doenças relacionadas à bactérias entéricas. Em um outro estudo piloto, descobriu-se que uma composição contendo um lantibiótico, tal como nisina, lisozima, albume e um agente de captura/quelação de metal, tal como ácido cítrico, tem uma alta eficácia para a inibição de Clostridium perfringens devido às sinergias entre a lisozima, nisina, albume e ácido cítrico. A Figura 8 ilustra os dados experimentais com relação às sinergias entre a nisina, lisozima, ácido cítrico e albume, conforme determinado a partir do estudo piloto. A Figura 8 mostra placas de MIC de Clostridium perfringens inoculado com uma diluição de 100 vezes de uma cultura durante a noite. No estudo piloto, duas misturas da composição antimicrobiana foram usadas (Mistura 2 e Mistura 3). A Mistura 2 e a Mistura 3 continham lisozima, nisina, ácido cítrico e albume nas proporções de 33:17:50:150 e 50:20:50:150 (lnovapure® Plus), respectivamente. A Figura 8 mostra que a dosagem eficaz da combinação de Mistura 3, contra Clostridium perfringens, é de aproximadamente 20 ppm. Assim, através da adição de nisina, a dosagem eficaz diminuiu de aproximadamente 50 ppm (conforme pode ser visto na Mistura 1, Figura 2) para 20 ppm. Novamente, a quantidade de lisozima na mistura representa apenas uma parte da composição antimicrobiana total.

Uma vantagem adicional dessa concretização da invenção é que uma mistura de lisozima, nisina, ácido cítrico e albume para manutenção da eficácia através de inibição de Clostridium perfringens a 20 ppm atualmente custa aproximadamente menos de $1 dólar americano/MTF.

Em um estudo em gaiolas mais recente, aves destinadas ao consumo humano de um rebanho homogêneo foram usadas. Quatrocentas aves foram usadas no estudo e ele foi conduzido durante 27 dias. Todas as aves usadas no estudo receberam uma vacinação de rotina administrada inovo, na eclosão. Nenhuma terapia com droga concomitante foi usada durante o estudo piloto. O estudo piloto foi baseado em um modelo em bloco aleatório completo. Oito gaiolas por tratamento foram usadas e cinco tratamentos em cada bloco foram administrados.

Os tratamentos foram como segue: 1 não medicado, não estimulado 2 não medicado, estimulado 3 50 mg/kg de Inovapure® Plus 4 100 mg/kg de Inovapure® Plus 5 50 g/t de BMD (dissalicilato de metileno - bacitracina) A mistura da composição antimicrobiana nos tratamentos 3 e 4 era inovapure® Plus, conforme descrito acima.

No quinto dia de testagem, as aves foram colocadas em grupos. O peso por gaiola para cada grupo foi mantido tão uniforme quanto possível. Pesagem adicional de cada ave de cada grupo ocorreu nos dias 14 e 27 do estudo piloto.

As carcaças das aves que morreram durante o experimento foram tomadas para classificação de lesão, por meio de necrópsia por um investigador. A finalidade da necrópsia era determinar a causa mais provável de morte ou morbidez. NE era diagnosticada com a causa de mortalidade se lesões intestinais fossem observadas. A ração que foi administrada às aves durante o estudo era uma ração de base para crescimento e inicial não medicada. As dietas foram apresentadas como inicial (Dias 0 a 18) e de crescimento (Dias 18 a 27). Essas linhas de tempo foram consideradas como representando as dietas da indústria local. Além disso, o consumo de ração das aves foi monitorado.

No dia 14, todas as aves exceto aquelas no tratamento 1 foram oralmente inoculadas com um inóculo misturado de oócitos de E. acervulina e E. maxima. Os oócitos proporcionaram um estímulo coccidiano leve para estimular a proliferação de Clostridium no intestino das aves. Começando no Dia 18, todas as aves, exceto no tratamento 1, foram forçadas a tomar oralmente uma cultura de caldo de C. perfringens a aproximadamente 108 cfu/ml. Às aves foi, então, administrada uma cultura de caldo fresca diariamente durante três dias nos Dias 18, 19 e 20.

No Dia 22, duas aves de cada gaiola foram aleatoriamente selecionadas, sacrificadas e examinadas com relação à presença de lesões de NE. Se houvessem lesões presentes, eram classificadas. O escore foi baseado em uma escala de 0 a 3, com 0 sendo normal e 3 sendo a mais grave. No Dia 27, as aves restantes foram sacrificadas e a lesão classificada. A tabela a seguir apresenta os resultados do estudo em gaiolas: Consumo Conversão ganho de peso (Kg) Escore de Lesão (0 a 3) Tratamento de ração de ração D5 a D14 D5 a D27 D14a D27 NEMort. dia 22 dia 27 1 Não medicado, sem estímulo 15,769 1,633 0,247 1,048 0,800 0 0,0 0,0 2 Não medicado, sem estímulo 13,670 1,775 0,254 0,882 0,629 10 0,2 0,7 3 Inovapure® Plus 532 13,667 1,656 0,252 0,941 0,689 5 0,1 0,4 50 mg/kg) 4 Inovapure® Plus 532 13,765 1,636 0,251 0,965 0,714 4 0,1 0,2 100 mg/kg) 5 BMD 50 g/t 14,000 1,659 0,252 0,946 0,694 2 0,0 0,3 Várias descobertas significativas podem ser deduzidas do estudo em gaiolas. Primeiramente, houve uma redução significativa na taxa de mortalidade das aves onde a composição antimicrobiana foi administrada. Além disso, houve uma redução significativa no desenvolvimento de lesão intestinal nas aves em ambos os tratamentos 3 e 4. Houve também uma resposta à dose estimulada nos indivíduos de teste, conforme pode ser observado em ambos os tratamentos onde a composição antimicrobiana foi administrada. Além do ganho de peso experimentado pelas aves, houve uma diminuição significativa na proporção de conversão de ração (FCR) [a captação média de ração/o peso médio da ave]. Dado o acima, a composição antimicrobiana tinha uma eficácia de promoção do crescimento/aminoácido similar àquela do antibiótico BMD.

Um outro estudo com as aves no solo foi conduzido, no qual uma composição antimicrobiana foi administrada, incluindo Inovapure® Plus 532. O Requerente realizou o estudo piloto de forma a avaliar o efeito do Inovapure® Plus 532 na dieta a 100 e 200 ppm sobre o desempenho de aves destinadas ao consumo humano em um ambiente com as aves no solo, estimuladas com Clostridium perfringens do tipo A.

Os parâmetros do experimento eram substancialmente similares àqueles descritos para o estudo em gaiolas. Esse estudo com as aves no solo foi conduzido em um modelo em bloco completo aleatório, usando-se um tipo único de rebanho, as vacinações padrão foram administradas in-ovo na eclosão e as dietas das aves não continham outros anticoccidianos ou antibióticos do que aqueles prescritos no modelo experimental. O estudo foi realizado durante 41 dias. A composição antimicrobiana, conforme descrita acima, foi alimentada às aves continuamente durante todo o período de crescimento. A composição antimicrobiana foi misturada com uma dieta completa em uma taxa de inclusão de 0, 100 ou 200 ppm. A composição antimicrobiana foi feita em uma pré-mistura intermediária através da adição da quantidade toda requerida para cada tonelada com 5 Kg de um ingrediente principal, tal como trigo, e totalmente misturada com a mão. A pré-mistura intermediária foi, então, adicionada à mistura toda e misturada.

Um estímulo coccidial foi administrado aos frangos para estimular a proliferação de Clostridium no intestino das aves.

Os seguintes são resultados obtidos a partir do estudo piloto. Tabela 1 Efeito da composição antimicrobiana sobre a mortalidade total Tabela 2 Efeito da composição antimicrobiana sobre a mortalidade por ente-rite necrótica Tabela 3 Efeitos principais do tratamento sobre o crescimento e desempenho de utilização de ração Conforme pode ser observado da Tabela 1 acima, a taxa média de mortalidade total diminuiu onde a composição antimicrobiana foi administrada aos indivíduos de teste. Houve também uma resposta à dose estimu- lada com relação à composição baseada na mortalidade total. No estudo piloto também houve uma quantidade significativa de NE que se somou como um componente da mortalidade total. A Tabela 2 ilustra que através de administração da composição antimicrobiana, a mortalidade causada pela NE foi significativamente reduzida. Novamente, uma resposta à dose foi observada.

Além do acima, o consumo de ração e o peso das aves foram cuidadosamente monitorados no estudo piloto, o que resultou nos dados esboçados na Tabela 3. A Tabela 3 ilustra que houve uma diminuição na FCR, onde a composição antimicrobiana foi administrada. Nas ciasses de aves em crescimento e finais, também houve um aumento no ganho de peso. O método de administração de composição antimicrobiana a animais de criação, incluindo populações de aves e suínos, é, de preferência, através da via oral pela água de beber ou ração. Para administrar a composição antimicrobiana na forma aquosa, por exemplo, na água de beber, a composição pode ser produzida na forma em pó e, então, dissolvida na água de beber para proporcionar uma concentração final de aproximadamente 100 a 200 ppm. Para adquirir a dissolução ótima, os ingredientes ativos deverão ser selecionados para serem prontamente solúveis. Para administração através da ração, a composição antimicrobiana é, de preferência, adicionada a um subconjunto da dieta de base de um animal para formar uma pré-mistura em uma concentração de aproximadamente 1 a 2%. A pré-mistura pode, então, ser misturada na ração final em aproximadamente 100 a 200 ppm. A mistura deverá ser usada nas rações de início, desenvolvimento e finais.

Deverá ser ainda compreendido que as concretizações da invenção não estão limitadas às concretizações descritas aqui as quais são meramente ilustrativas das concretizações preferidas de realização da invenção e as quais são suscetíveis à modificação de forma, disposição de partes, etapas, detalhes e ordem de operação. A invenção, ao contrário, se destina a abranger todas de tais modificações dentro de seu escopo, conforme definido pelas reivindicações.

Claims (22)

1. Composição antimicrobiana como agente para a supressão do desenvolvimento de agentes patogênicos entéricos no intestino de animais de criação e para a prevenção e tratamento de infecções gastrointestinais em animais de criação, caracterizada pelo fato de que inclui: (a) uma substância que causa lise da parede celular ou seu sal; (b) pelo menos um dentre ovo em pó seco e albume; e (c) um agente de captura; em que a substância que causa lise da parede celular é uma enzima.

2. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os agentes patogênicos entéricos incluem membros das seguintes famílias de bactérias: Clostridium perfringens, Es-cherichia coli, Salmonella typhimurium e Salmonella mbandaka.

3. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a substância que causa lise da parede celular ou seu sal é uma lisozima.

4. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a substância antimicrobiana compreende ambos o ovo em pó seco e albume.

5. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o agente de captura é um ácido orgânico.

6. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o agente de captura é um quelante de metal.

7. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o agente de captura é selecionado do grupo consistindo em: (a) etilenodiaminatetraacetato de dissódio (EDTA); (b) ácido cítrico; (c) quitosana.

8. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um lantibiótico.

9. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o lantibiótico é nisina.

10. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proporção da substância que causa lise da parede celular ou seu sal, do pelo menos um ovo em pó seco e albume, do agente de captura e do lantibiótico é de 50:150:50:20 em peso.

11. Composição antimicrobiana como defiida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição antimicrobiana está na forma em pó.

12. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição antimicrobiana está na forma de solução aquosa.

13. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a composição antimicrobiana é solúvel em água para permitir que a composição antimicrobiana seja misturada com a água de beber para administração a animais de criação.

14. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição antimicrobiana é administrada como um aditivo para ração.

15. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a infecção gastrointestinal inclui enterite necrótica, enterite por Clostridium perfringens e doença diarréica.

16. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proporção de substância que causa lise da parede celular ou seu sal, do pelo menos um ovo em pó seco e albume e do agente de captura é de 2:5:3 em peso.

17. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição antimicrobiana inclui ovo em pó seco e o ovo em pó seco é capaz de suprimir micróbios adicionais no intestino da animais de criação.

18. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que os micróbios adicionais incluem mofos e vírus.

19. Composição antimicrobiana como definida na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição antimicrobiana inclui ovo em pó seco e o ovo em pó seco é capaz de suprimir enzimas adicionais no intestino dos animais de criação.

20. Composição antimicrobiana de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que as enzimas adicionais incluem proteases e lipases.

21. Composição antimicrobiana para uso na prevenção e tratamento de infecções gastrointestinais em animais de criação, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma substância que causa lise da parede celular ou seu sal; (b) pelo menos um dentre ovo em pó seco e albume; e (c) um agente de captura; e (d) um lantibiótico; em que a substância que causa lise da parede celular é uma enzima.

22. Composição antimicrobiana para supressão do desenvolvimento de agentes patogênicos entéricos no intestino de animais de criação, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma substância que causa lise da parede celular ou seu sal; (b) pelo menos um dentre ovo em pó seco e albume; e (c) um agente de captura; em que a proporção de substância que causa lise da parede celular ou seu sal, do pelo menos um ovo em pó seco e albume e do agente de captura é de 2:5:3 em peso, em que a substância que causa lise da parede celular é uma enzima.