BR112020018548A2 - Composição de aditivo de ração de tipo revestido, ração, e, método para melhorar um ganho de peso corporal de gado - Google Patents

Composição de aditivo de ração de tipo revestido, ração, e, método para melhorar um ganho de peso corporal de gado Download PDF

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Abstract

composição de aditivo de ração de tipo revestido,ração, e, método para melhorar um ganho de peso. corporal de gado. a presente invenção provê um agente revestido de ganho de peso de gado ou de melhoramento de eficiência de ração constituído por: um núcleo que contém uma substância fisiologicamente ativa tendo propriedades de reforço de membrana de célula epitelial gastrointestinal; e um agente de revestimento de núcleo.

Description

1 / 38 COMPOSIÇÃO DE ADITIVO DE RAÇÃO DE TIPO REVESTIDO, RAÇÃO, E, MÉTODO PARA MELHORAR UM GANHO DE PESO
CORPORAL DE GADO CAMPO DA TÉCNICA
[001] A presente invenção se refere a um aditivo de ração adequado para gado, particularmente, animais monogástricos, e uma ração contendo o aditivo.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
[002] De acordo com o relatório das Nações Unidas “The State of World Population”, estima-se que a população mundial tenha atingido 7 bilhões em 2011, e espera-se que aumente para 9,8 bilhões em 2050. Juntamente com isso, o problema da crise alimentar se agravou, e a demanda pela produção de carne vem aumentando rapidamente, principalmente nos BRICS. Portanto, uma técnica para melhorar a produtividade da carne de gado é essencial.
[003] Uma das técnicas para melhorar a produtividade de animais de gado é o antibiótico promotor de crescimento (AGP). Os antibióticos foram originalmente desenvolvidos para uso terapêutico centrados na inibição do crescimento de bactérias patogênicas como, por exemplo, a penicilina, e são amplamente usados como produtos farmacêuticos. Desde então, o uso de antibióticos foi ampliado e, a partir da segunda metade da década de 1950, passou a ser difundido o uso com o objetivo de promover o crescimento de animais de gado. Por outro lado, em vista do problema de bactérias resistentes a antibiótico e poluição ambiental, o seu uso como um promotor de crescimento na Europa foi proibido em 2006, e o endurecimento das regulamentações foi confirmado nos EUA em 2015. Em 2016, foi verificado que um gene resistente à colistina estava presente no plasmídeo móvel (Literatura de Não Patente 1). Além disso, em 2050, bactérias resistentes a antibiótico apresentarão um risco maior do que o câncer, e se esse problema
2 / 38 não for tratado, a taxa de mortalidade anual pode superar a de câncer e atingir 10 milhões, resultando em uma ameaça internacional (Literatura de Não Patente 2). Juntamente com isso, AGP e fármacos terapêuticos para seres humanos e animais, que também são usados para tratamento em vários países, são considerados de risco para serem uma tarefa urgente para fortalecer as regulamentações. Além disso, nos Estados Unidos, o mercado de refeição rápida também planeja oferecer carne livre de antibiótico.
[004] As bacteriocinas são um dos candidatos alternativos para AGP. Bacteriocinas são um termo genérico para proteínas e peptídeos produzidos por bactérias que têm atividade antibacteriana, principalmente contra as mesmas espécies e espécies relacionadas, e nisina e plantaricina são amplamente usadas como conservantes alimentares. No entanto, são facilmente decompostas por enzimas digestivas, e, assim, não são usadas em aplicações de ração. A Literatura de Patente 1 relata uma técnica de uso de um lantibiótico, como, por exemplo, a nisina, em combinação com uma substância dissolvente da parede celular, como, por exemplo, a lisozima, um agente sequestrante, como, por exemplo, um agente quelante, e uma substância antibacteriana, como, por exemplo, ovo em pó, para, desse modo, suprimir o crescimento de bactérias patogênicas entéricas e doenças em animais de gado. A Literatura de Não Patente 3 descreve uma técnica em que uma solução concentrada obtida pela separação de bactérias de bactérias produtoras de nisina é adicionada como uma ração.
[005] Além das bacteriocinas, a Literatura de Não Patente 4 relata que, como um resultado da adição de 500 a 1.000 ppm de quercetina (composto flavonoide) à ração, o efeito de ganho de peso corporal (também chamado de eficiência de ganho de peso corporal) e o consumo de ração não aumentaram, e a razão de conversão de ração se manteve quase inalterada ou diminuiu ligeiramente. A Literatura de Patente 2 é uma técnica em que uma pectina esterificada ou uma mistura da mesma é contida em uma ração, e trata
3 / 38 de doenças inflamatórias.
[006] Por outro lado, o mecanismo de ação do AGP, que mostra um efeito promotor de crescimento mesmo em pequena quantidade, não é claro. Existem várias opiniões sobre o motivo pelo qual os antibióticos levam a um melhoramento na razão de conversão de ração (Literatura de Não Patente 5).
[007] - Hipótese 1) O AGP previne infecções potenciais e reduz os custos metabólicos exigidos pelo sistema imunológico.
[008] - Hipótese 2) O AGP controla a microbiota intestinal, e as bactérias intestinais suprimem metabólitos, como, por exemplo, a amônia, para promover o crescimento de animais hospedeiros.
[009] - Hipótese 3) O AGP suprime o crescimento das bactérias intestinais e reduz os nutrientes usados pelos micro-organismos.
[0010] - Hipótese 4) O AGP enfraquece a parede do trato digestivo de animais de gado e intensifica a absorção de nutriente.
[0011] T. A. Niewold et al. argumentam o seguinte contra essas hipóteses: 1) O AGP exibe um efeito antibacteriano independentemente das espécies de gado do animal. 2) AGPs com diferentes espectros antibacterianos também exibem o mesmo efeito promotor de crescimento. 3) Alguns antibióticos terapêuticos não exibem efeito promotor de crescimento. 4) A concentração de AGP usada é menor que a concentração inibitória mínima MIC, e o uso a longo prazo em baixo volume deve gerar facilmente bactérias resistentes. 5) O efeito de uma substância antibacteriana alternativa, que exibe um efeito antibacteriano, não é estável em seu efeito, apesar de seu alto efeito antibacteriano (Literatura de Não Patente 5).
LISTA DE CITAÇÃO
LITERATURAS DE PATENTE Literatura de Patente 1: Publicação Internacional no WO2004/026334 Literatura de Patente 2: Publicação Internacional no
4 / 38 WO2017/009257
LITERATURAS DE NÃO PATENTE Literatura de Não Patente 1: Yi-Yun Liu et al, Lancet Infect Dis (2016) vol. 16 161 a 165 Literatura Não Patente 2: Jim O'Neill, Resenha em Antimicrobial Resistance, Maio de 2016 Literatura de Não Patente 3: Damian Jozefiak et al, PLoS ONE (2013) vol. 8(12): e85347 Literatura de Não Patente 4: M. Goliomytis et al, Poult Sci (2014) vol. 93(8): 1957 a 1962. Literatura de Não Patente 5: T. A. Niewold, Poultry Science (2007) vol. 86: 605 a 609.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO
[0012] Dos pontos acima, uma vez que o mecanismo de ação de AGP não está claro, não existe uma substância promotora de crescimento eficaz para substituir o AGP atualmente. Portanto, um objeto da presente invenção é prover um aditivo de ração que também pode exibir um efeito de ganho de peso corporal em gado saudável e econômico, e uma ração contendo o aditivo.
MEIOS PARA SOLUÇÃO DOS PROBLEMAS
[0013] Como um resultado de estudos diligentes pelos presentes inventores, verificou-se que um dos efeitos do uso de AGP em baixa concentração é o fortalecimento da membrana das células epiteliais intestinais. Além disso, verificou-se, a partir do exposto acima, que, ao prover uma galinha saudável com uma ração revestida com uma substância fisiologicamente ativa tendo a propriedade de fortalecer a membrana das células epiteliais intestinais, é possível melhorar o efeito de ganho de peso corporal e a razão de conversão de ração. Essa revelação foi usada de base
5 / 38 para completar a invenção de um aditivo de ração que pode, quando revestido, intensificar o efeito de ganho de peso corporal de gado. Especificamente, a descrição provê as seguintes invenções.
[0014] 1. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado que compreende: um núcleo contendo uma substância fisiologicamente ativa tendo uma propriedade de fortalecer uma membrana de células epiteliais intestinais; e um agente de revestimento de núcleo.
[0015] 2. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com o 1 descrito acima, em que a substância fisiologicamente ativa contém, pelo menos, um selecionado a partir do grupo que consiste em bacteriocinas, polifenóis, aminoácidos ou derivados do mesmo, ácidos orgânicos ou derivados do mesmo, indutores de HSP, antioxidantes e polissacarídeos.
[0016] 3. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado, de acordo com 1 ou 2 descrito acima, em que a substância fisiologicamente ativa é, pelo menos, uma bacteriocina selecionada a partir do grupo que consiste em nisina, subtilina, plantaricina e gassericina.
[0017] 4. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer um de 1 a 3 descritos acima, em que a substância fisiologicamente ativa está contida em uma cultura de um micro- organismo que produz a substância.
[0018] 5. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer um de 1 a 4 descritos acima, em que a substância fisiologicamente ativa está contida em uma cultura de, pelo menos,
6 / 38 um micro-organismo selecionado a partir do grupo que consiste em Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus.
[0019] 6. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com o 5 descrito acima, em que o micro-organismo é Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, ou Lactobacillus plantarum.
[0020] 7. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com o 2 descrito acima, em que o polifenol é quercetina ou tanino.
[0021] 8. A composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com o 2 descrito acima, em que o aminoácido é, pelo menos, um selecionado a partir do grupo que consiste em glutamina, fenilalanina, triptofano, valina e tirosina.
[0022] 9. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com o 2 descrito acima, em que o indutor de HSP é ácido polifosfórico ou um fator de competência e esporulação.
[0023] 10. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer um de 1 a 9 descritos acima, em que o agente de revestimento contém, pelo menos, um selecionado a partir do grupo que consiste em óleo vegetal hidrogenado, goma-laca, zeína, hidroxipropilmetilcelulose e maltitol.
[0024] 11. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer um de 1 a 10 descritos acima, em que a substância fisiologicamente ativa é, pelo menos, uma bacteriocina selecionada
7 / 38 a partir do grupo que consiste em nisina, subtilina, plantaricina, e gassericina, e o agente de revestimento é óleo de colza hidrogenado e/ou goma-laca.
[0025] 12. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com o 11 descrito acima, em que uma camada de revestimento formada pelo agente de revestimento apresenta uma estrutura de duas camadas que incluem uma camada formada de óleo de colza hidrogenado e uma camada formada de goma-laca.
[0026] 13. Uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com o 12 descrito acima, em que a camada formada de goma-laca está em contato com o núcleo, e a camada formada de óleo de colza hidrogenado é formada no mesmo.
[0027] 14. Uma ração que compreende: uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer um dos 1 a 13 descritos acima.
[0028] 15. Um método de melhorar um efeito de ganho de peso corporal e razão de conversão de ração de gado que compreende: administrar uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer um dos 1 a 13 descritos acima, ou a ração de acordo com o 14 descrito acima.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[0029] O aditivo de ração de tipo revestido e a ração da presente invenção tornam possível prover um aditivo de ração e uma ração que também podem exibir um efeito de ganho de peso corporal em gado saudável e econômico. O aditivo de ração e a ração da presente invenção também exibem um efeito de ganho de peso corporal, mesmo em uma pequena
8 / 38 quantidade.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0030] A Figura 1A ilustra a razão de recuperação da função de barreira em várias concentrações de várias substâncias fisiologicamente ativas (AGPs) (Exemplo Experimental A).
[0031] A Figura 1B ilustra a razão de recuperação da função de barreira em várias concentrações de várias substâncias fisiologicamente ativas (bacteriocinas) (Exemplo Experimental A).
[0032] A Figura 1C ilustra a razão de recuperação da função de barreira em várias concentrações de várias substâncias fisiologicamente ativas (polifenóis) (Exemplo Experimental A).
[0033] A Figura 1D ilustra a razão de recuperação da função de barreira em várias concentrações de várias substâncias fisiologicamente ativas (aminoácidos) (Exemplo Experimental A).
[0034] A Figura 1E ilustra a razão de recuperação da função de barreira em várias concentrações de várias substâncias fisiologicamente ativas (ácidos orgânicos) (Exemplo Experimental A).
[0035] A Figura 1F ilustra a razão de recuperação da função de barreira em várias concentrações de várias substâncias fisiologicamente ativas (indutores de HSP) (Exemplo Experimental A).
[0036] A Figura 1G ilustra a razão de recuperação da função de barreira em várias concentrações de várias substâncias fisiologicamente ativas (antioxidantes) (Exemplo Experimental A).
[0037] A Figura 1H ilustra a razão de recuperação da função de barreira em várias concentrações de várias substâncias fisiologicamente ativas (polissacarídeos) (Exemplo Experimental A).
[0038] A Figura 2 ilustra a mudança ao longo do tempo da taxa de dissolução de quercetina do aditivo de ração de tipo revestido de duas camadas sob condições de suco gástrico e suco intestinal (1 a 2 dos Exemplos
9 / 38 1).
[0039] A Figura 3 ilustra a mudança ao longo do tempo da taxa de dissolução de tirosina do aditivo de ração de tipo revestido de duas camadas sob condições de suco gástrico e suco intestinal (2 a 2 do Exemplo 2).
[0040] A Figura 4 ilustra a mudança ao longo do tempo da taxa de dissolução de nisina A do aditivo de ração de tipo revestido de duas camadas sob condições de suco gástrico e suco intestinal (3 a 2 do Exemplo 3).
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES [NÚCLEO]
[0041] Quando os presentes inventores investigaram exaustivamente substâncias fisiologicamente ativas, verificou-se que, pelo menos, um selecionado a partir do grupo que consiste em bacteriocinas, polifenóis, aminoácidos ou derivados do mesmo, ácidos líquidos ou derivados do mesmo, indutores de proteína de choque térmico (HSP), antioxidantes, e observou-se que os polissacarídeos apresentam uma excelente capacidade de fortalecimento de membrana.
[0042] As bacteriocinas são classificadas em duas classes, Classe I e Classe II, de acordo com a classificação de Paul D. Cotter (Nat. Rev. Microbiol. 2005 Volume 3 (10), pp 777 a 788).
[0043] As bacteriocinas pertencentes à Classe I também são chamadas de lantibióticos, e sua estrutura apresenta um aminoácido anormal gerado por modificação pós-traducional. Exemplos específicos incluem nisina A, nisina Z, nisina Q, subtilina, duramicina, mersacidina e lactisina-481.
[0044] Classe II são peptídeos que não contêm aminoácidos anormais em sua estrutura. Classe II é adicionalmente classificada em três subclasses de a c. Exemplos específicos de bacteriocinas pertencentes à Classe IIa incluem pediocina PA-1 e enterocina A. Sabe-se que bacteriocinas pertencentes à Classe IIb são dois peptídeos produzidos ao mesmo tempo, e intensificam sinergicamente os efeitos um do outro. Exemplos específicos incluem
10 / 38 plantaricina (PlnE, PlnF), enterocina X (Xalpha, Xbeta), e lactococcina Q (Qalfa, Qbeta). As bacteriocinas pertencentes à Classe IIc apresentam uma estrutura cíclica na qual o N-terminal e o C-terminal estão ligados por meio de uma ligação peptídica. Os exemplos específicos incluem gassericina A, circularina A, e lactociclicina Q.
[0045] A bacteriocina usada na presente invenção é preferencialmente a bacteriocina pertencente à Classe I, Classe IIb, e Classe IIc. A bacteriocina usada na presente invenção é mais preferencialmente nisina, gassericina, plantaricina e subtilina.
[0046] Observe que, quando nenhuma letra alfabética é fixa após o nome de cada bacteriocina, isso significa o nome genérico dessa bacteriocina (por exemplo, o termo “nisina” é um conceito que inclui nisina A, nisina Z e semelhantes).
[0047] Os experimentos dos presentes inventores observaram uma capacidade de fortalecimento de membrana em nisina, de modo que o índice para a triagem de bacteriocina, tendo uma capacidade de fortalecimento de membrana, foi examinado, e verificou-se que a capacidade de fortalecimento de membrana não estava necessariamente correlacionada com a atividade antibacteriana ou espectro antibacteriano (consultar Exemplo Experimental B descrito mais tarde).
[0048] Sabe-se que os antibióticos usados como AGP não são decompostos por enzimas digestivas, de modo que a atividade continue até no corpo e que eles não apresentem atividade antibacteriana mesmo após serem excretados nas fezes. Por outro lado, a bacteriocina, que é uma proteína ou peptídeo, é facilmente decomposta por enzimas digestivas, de modo que sua atividade seja perdida no trato digestivo. Quando usada em aplicações de ração, é desejável protegê-la (revestí-la), de modo que ela não seja inativada por enzimas digestivas. Se protegida, 10 a 100 ppm no intestino delgado exibirá capacidade de fortalecimento de membrana suficiente. Após isso, a
11 / 38 bacteriocina transferida para as fezes é segura em virtude de a mesma ser inativada pelas enzimas nas fezes. Portanto, mesmo quando um aditivo de ração ou ração contendo bacteriocina em vez de AGP é administrada ao gado, existe uma vantagem de não ocorrer o problema de bactérias resistentes a antibiótico. Observe que, no presente relatório descritivo, “ppm” significa “ppm em massa”.
[0049] O polifenol usado na presente invenção é quercetina, curcumina, e semelhantes, sendo a quercetina preferível.
[0050] O aminoácido usado na presente invenção é glutamina (Gln), triptofano (Trp), valina (Val), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe) e semelhantes. O derivado de aminoácido é ácido fenil-lático (PLA) e semelhantes.
[0051] O ácido orgânico usado na presente invenção é ácido butírico e semelhantes. O ácido orgânico apresenta um total de cerca de 2 a 5 átomos de carbono. O derivado de ácido orgânico é, por exemplo, um éster com um álcool tendo 1 a 5 átomos de carbono.
[0052] O indutor de HSP (indutor de proteína de choque térmico (HSP)) usado na presente invenção é polifosfato e um fator de esporulação (fator de competência e esporulação (CSF)) derivado de Bacillus subtilis.
[0053] O antioxidante usado na presente invenção é astaxantina e semelhantes.
[0054] O polissacarídeo usado na presente invenção é goma-arábica, pululano, galactoglucomanano (GGM), goma xantana (XG), e semelhantes.
[0055] Na presente invenção, as substâncias fisiologicamente ativas podem ser usadas sozinhas ou em combinação de dois ou mais tipos. A substância fisiologicamente ativa usada na presente invenção é preferencialmente uma bacteriocina, um polissacarídeo, um aminoácido, ou uma combinação dos mesmos, e, mais preferencialmente, nisina, Tyr, ou uma combinação dos mesmos.
[0056] Observe aqui que se sabe que ácido polifosfórico fortalece a
12 / 38 função de barreira ao aumentar a produtividade de proteína de choque térmico (indutor de HSP) (Shuichi Segawa et. al., PLoS ONE, 2011, 6(8): e23278). Acredita-se que a indução de proteínas de resposta ao estresse tipificadas pelas proteínas de choque térmico fortaleça a função de barreira intercelular.
[0057] Entretanto, a junção apertada é uma camada formada pelas membranas celulares de células adjacentes que aderem umas às outras com sua membrana externa fundida entre si, e está localizada na fronteira entre a membrana basolateral e a membrana apical das células epiteliais, e é considerada para evitar que as proteínas e lipídios de membrana se misturem entre eles (Iwanami “Seibutugaku Jiten,” Quarta Edição, Versão CD-ROM, 1998).
[0058] Sem o intuito de se limitar a qualquer teoria, presume-se que a substância fisiologicamente ativa usada na presente invenção apresenta uma capacidade de fortalecimento de membrana devido a uma ou ambas da função de evitar a difusão de substância pela junção apertada e a função de barreira intercelular pela proteína de resposta ao estresse. Considerou-se que fortalecer a junção apertada levaria à saúde, porém não havia ração que permitisse uma substância capaz de fortalecer a junção apertada para chegar ao intestino. Além disso, não se sabia que um agente antibacteriano capaz de fortalecer a junção apertada in vitro exibisse um efeito de ganho de peso corporal quando administrado para gado.
[0059] A pureza da substância fisiologicamente ativa usada na presente invenção não é limitada desde que o efeito desejado seja obtido. Por exemplo, uma substância fisiologicamente ativa obtida por ser produzida por um micro-organismo pode ser usada em conjunto com a cultura. O teor de sólido no caldo de fermentação pode ser obtido por liofilização, ou o caldo de fermentação pode ser obtido como um teor de sólido por granulação por aspersão.
[0060] Alternativamente, como a substância fisiologicamente ativa
13 / 38 usada na presente invenção, pode ser usado um produto secretado ou produto extraído de plantas, algas, crustáceos ou peixes. Como a substância fisiologicamente ativa usada na presente invenção, pode ser usado um produto disponível comercialmente.
[0061] Dentre as substâncias fisiologicamente ativas, as plantas contendo polifenóis incluem uvas, vinho, chá, maçãs, mirtilos, caquis, bananas, açafrão, canela, grãos de café, frutas cítricas, cebolas e semelhantes.
[0062] Como um micro-organismo que produz polissacarídeos dentre as substâncias fisiologicamente ativas, por exemplo, o galactoglucomanano (GGM) produzido por Lipomyces starkeyi pode ser obtido pelos métodos descritos na Publicação de Pedido de Patente Japonesa Nº Hei 7-298873 e Publicação de Pedido de Patente Japonesa Nº Hei 9-131199. Micro- organismos que produzem polissacarídeos dentre as substâncias fisiologicamente ativas incluem Xanthomonas campestris, Aureobasidium pullulans, Lipomyces Starkeyi, Phaeophyta como algas marrons, e Eucheuma como algas. Além disso, os casos de plantas incluem goma-arábica (Acacia senegal), feijões guar (Cyamopsis tetragonoloba), ibaranori (Hypnea musciformis), cod (Tara spinosa), alfarroba (Ceratonia siliqua), e semelhantes.
[0063] Dentre as substâncias fisiologicamente ativas, os micro- organismos que produzem aminoácidos, ou derivados do mesmo, incluem Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Escherichia coli, e semelhantes.
[0064] Dentre as substâncias fisiologicamente ativas, os microorganismos que produzem ácidos orgânicos, ou derivados do mesmo, incluem Lactobacillus, Bifidobacterium, Clostridium e semelhantes.
[0065] Dentre as substâncias fisiologicamente ativas, os microorganismos que produzem indutores de HSP incluem Bacillus, Lactococcus lactis, Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus.
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[0066] Dentre as substâncias fisiologicamente ativas, os microorganismos que produzem antioxidantes incluem Phaffia rhodozyma e Pseudomonas thiazolinophilum e Haematococcus pluvialis como algas.
[0067] Ademais, a bacteriocina, que é uma das substâncias fisiologicamente ativas usadas na presente invenção, é preferencialmente um produto de cultura de pelo menos um micro-organismo selecionado a partir do grupo que consiste em Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus.
[0068] Em particular, o micro-organismo que produz bacteriocina é preferencialmente um produto de cultura de Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus aviaries, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri (gado), Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis (suíno), Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus lactis, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus panis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus zeae, Lactococcus lactis, Leuconostoc citreum, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Pediococcus cerevisiae/damnosus, Pediococcus dextrinicus, e Pediococcus pentosaceus, que são registrados com a Associação de Funcionários Americanos de Controle Alimentar (AAFCO) ou a Autoridade Europeia para Segurança de Alimentar (EFSA).
[0069] Em particular, os produtos de cultura de Lactococcus lactis,
15 / 38 Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus gasseri, e Clostridium beijerinckii são preferíveis. Dentre esses, um produto de cultura de Lactococcus lactis é preferível.
[0070] Particularmente, os produtos de cultura de Lactococcus lactis FERM BP-8552 (bactéria produtora de nisina Z), Bacillus subtilis ATCC 6633 (bactéria produtora de subtilina), Lactococcus lactis NCIMB 702054 (bactéria produtora de nisina Z), Lactobacillus plantarum JCM 1057 (bactéria produtora de plantaricina), Lactobacillus gasseri LA39 JCM 11657 (bactéria produtora de gassericina A), Clostridium beijerinckii JCM 1390 (bactéria produtora de circularina A) são preferíveis. Lactococcus lactis FERM BP- 8552 (bactéria produtora de nisina Z) e Lactococcus lactis NCIMB 702054 (bactéria produtora de nisina Z) são mais preferíveis.
[0071] Observe que Lactococcus lactis FERM BP-8552 foi depositado em 19 de novembro de 2003 com o Depositário de Organismo Internacional de Patentes, o Instituto Nacional de Ciência Industrial Avançada e Tecnologia (código postal 305-8566, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Prefeitura de Ibaraki, Japão, atualmente Instituto Nacional de Tecnologia e Avaliação, código postal 292-0818, 2-5-8 (Kazusakamatari, Kisarazu, Prefeitura de Chiba, Japão). No presente relatório descritivo, essa cepa pode ser denominada AJ110212.
[0072] Bacillus subtilis ATCC 6633 foi depositada com a Coleção de Tipo de Cultura Americana, Manassas, VA, USA.
[0073] Lactococcus lactis NCIMB 702054 foi depositada com a Coleção Nacional de Bactérias Industriais, Alimentares e Marinhas, NCIMB Ltd., Aberdeen, Scotland, UK.
[0074] Lactobacillus plantarum JCM 1057, Lactobacillus gasseri LA39 JCM 11657, e Clostridium beijerinckii JCM 1390 foram depositadas com a Coleção Japonesa de Microorganismos, RIKEN BioResource Research Center (código postal 305-0074, 3-1-1 Koyadai, Cidade de Tsukuba,
16 / 38 Prefeitura de Ibaraki).
[0075] O núcleo pode conter um agente protetor. O agente protetor inclui leite desnatado, sais de aminoácido, como, por exemplo, glutamato de sódio, álcoois de açúcar, como, por exemplo, sorbitol, e dissacarídeos, como, por exemplo, trealose e sacarose.
[0076] O núcleo pode conter um excipiente. O excipiente não é particularmente limitado, contanto que seja um comumente usado para melhorar a formação de formato, e exemplos do mesmo incluem carbonato de cálcio, dióxido de silício, silicato de cálcio, zeólito, sorbitol, amido de milho, talco, bentonita de fermento, casca de arroz, parafina líquida, polissacarídeos diferentes de polissacarídeos tendo uma propriedade de agregação de bactérias gram-negativas, monossacarídeos e dissacarídeos. Quando o núcleo contém um excipiente, a quantidade do excipiente é, no geral, preferencialmente de 0,1 a 100 partes em massa com base em 100 partes em massa do núcleo.
[0077] O núcleo também pode conter quaisquer aditivos que possam ser incluídos na ração convencional. Quando o núcleo contém um aditivo opcional, a quantidade do aditivo opcional é, no geral, preferencialmente de 0,1 a 100 partes em massa com base em 100 partes em massa do núcleo. [AGENTE DE REVESTIMENTO]
[0078] O agente de revestimento é uma substância capaz de formar um revestimento entérico e pode ser usado sem limitação especial, contanto que seja uma substância segura para o gado ingerir. O agente de revestimento pode ser usado sozinho ou em combinação de dois ou mais tipos. Do ponto de vista de fácil manuseio e eficiência econômica, o agente de revestimento é preferencialmente óleo vegetal hidrogenado, ou gomas-laca, zeína, hidroxipropilmetilcelulose, maltitol, e semelhantes que são substâncias comumente usadas como agentes de revestimento de comprimido. O óleo vegetal hidrogenado inclui óleos hidrogenados de óleo de colza, óleo de
17 / 38 linhaça, óleo de cártamo, óleo de girassol, óleo de soja, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de algodão, óleo de gergelim, óleo de arroz, azeite, óleo de palma, óleo de palmiste, ou óleo de coco. O agente de revestimento é preferencialmente óleo de colza hidrogenado e goma-laca. A camada de óleo de colza hidrogenado é preferível em virtude de a mesma poder dissolver o núcleo em um curto período de tempo. A camada de goma-laca é preferível em virtude de o mesmo poder dissolver o núcleo com neutro em alcalino (após passar pelo estômago).
[0079] Alternativamente, o agente de revestimento pode ser um próprio micro-organismo que produz tal substância fisiologicamente ativa.
[0080] O agente de revestimento está em uma quantidade preferencialmente de 5 a 90% em massa, e, mais preferencialmente, de 20 a 30% em massa, com base na massa total do aditivo de ração de tipo revestido da presente invenção. O agente de revestimento também pode conter quaisquer aditivos que possam ser incluídos na ração convencional.
[0081] O revestimento pode ser uma única camada ou múltiplas camadas de duas ou mais camadas. O revestimento de múltiplas camadas é preferível em virtude de ser mais fácil controlar a taxa de dissolução no corpo. Em particular, é preferível que a camada mais externa seja uma camada de óleo de colza hidrogenado e que a camada mais interna em contato com o núcleo seja uma camada de goma-laca, em virtude de o agente de revestimento se dissolver no intestino e não no estômago.
[0082] A taxa de dissolução do aditivo de ração de tipo revestido da presente invenção no suco gástrico é desejavelmente menor que 50%, e a diferença entre a taxa de dissolução no suco intestinal e a taxa de dissolução no suco gástrico artificial é desejavelmente de 10% ou mais. Para o propósito de alcançar tal taxa de dissolução, pode ser ajustada formando uma membrana de duas camadas ou membrana de múltiplas camadas, ou controlando o tipo de agente de revestimento e a espessura de membrana para cada camada.
18 / 38 [MÉTODO DE REVESTIMENTO]
[0083] O método de revestimento do núcleo não é particularmente limitado, e, por exemplo, é possível obter um aditivo de ração de tipo revestido por aspersão de um agente de revestimento em um estado líquido, aquecido a uma temperatura superior ao ponto de fusão, embora que permita que o núcleo em pó ou granular escoe com um granulador de aspersão de leito fluidizado disponível comercialmente. O aditivo de ração de tipo revestido obtido a partir de polissacarídeos em pó ou granular apresenta um tamanho preferencialmente de cerca de 0,05 a 5 mm em virtude de fácil manuseio. Além disso, a temperatura de aquecimento do agente de revestimento não é particularmente limitada contanto que seja igual ou superior ao ponto de fusão do agente de revestimento, porém é preferencialmente superior ao ponto de fusão do agente de revestimento em cerca de 5°C a 15°C. [RAÇÃO]
[0084] O aditivo de ração de tipo revestido da presente invenção pode ser dado ao gado, ou pode ser usado como uma ração em conjunto com um excipiente ou diluente como, por exemplo, milho, farinha de soja, farelo de arroz, farinha de peixe ou levedura de cerveja. A ração da presente invenção também pode conter quaisquer aditivos que possam ser incluídos na ração. A ração da presente invenção é adequada para ingestão diária contínua. A ingestão de ração varia a depender do tamanho de gado. Por exemplo, no caso de galinhas, é desejável que as mesmas sejam alimentadas com a substância fisiologicamente ativa com uma ingestão diária de cerca de 1 a 200 ppm e, preferencialmente, de 10 a 100 ppm, com base na ração diferente do aditivo de ração de tipo revestido.
[0085] No presente relatório descritivo, o termo “gado” se refere a criaturas criadas por seres humanos. Exemplos específicos incluem ruminantes, como, por exemplo, vacas, ovelha, cabras, e animais monogástricos, como, por exemplo, cavalos, porcos, galinhas, cães e peixe. É
19 / 38 particularmente preferível dar a ração da presente invenção a animais monogástricos.
[0086] O método de alimentação do aditivo de ração de tipo revestido da presente invenção não é particularmente limitado.
EXEMPLOS EXEMPLO EXPERIMENTAL A: EXPERIMENTO DE FORTALECIMENTO DE MEMBRANA
[0087] A capacidade de fortalecimento de membrana da substância de teste foi avaliada de acordo com a descrição em J. Nutr. (2009) volume 139(5), pp 965 a 974.
[0088] Células Caco-2 (células epiteliais intestinais de ser humano (ECACC, Código 86010202)) foram semeadas em um sistema Transwell de camada dupla e cultivadas em meio DMEM a 37°C. No 12º dia de cultura, TNF-α foi adicionado para reduzir a função de barreira da Junção Apertada. No 14º dia de cultura, foi adicionada a substância de teste, a mistura foi cultivada a mesma temperatura por 24 horas, e, então, Millicell ERS-2 (fabricado por Millipore) foi usado para medir o valor de resistência elétrica transepitelial TER (Ω*cm2), desse modo, avaliando a restauração (% de razão de recuperação) da função de barreira. A Figura 1A a Figura 1H apresentam os resultados.
[0089] Conforme ilustrado na Figura 1A, foi confirmado que AGP, como, por exemplo, avilamicina e colistina, apresentava uma função de fortalecer a função de barreira mesmo em baixa concentração. Com o grupo adicionado com o TNF-α usado sozinho como controle, determinou-se uma razão de recuperação/controle de 1,1 ou mais para apresentar a capacidade de fortalecimento de membrana. A Tabela 1 apresenta a concentração do próprio material quando a razão de recuperação/controle de cada substância fisiologicamente ativa se encontra cerca de 1,1. Quercetina, extrato de semente de uva (fabricados por Ajinomoto Co., Inc.), nisina A, tirosina
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(fabricados por Ajinomoto Co., Inc.), astaxantina (fabricado por DSM), e semelhantes também foram observados como apresentando a função de fortalecer a função de barreira.
[TABELA 1] Material Material conc.
Razão de recuperação/ctr*1 Razão de recuperação (%) Avilamicina 10 uM 1,10 127 Tilosina 10 uM 1,17 135 Colistina 1 uM 1,13 130 Antibiótico Promotor de Crescimento Bacitracina de Zinco 10 uM 1,10 124 (AGP) Salinomicina 1 uM 1,10 124 Monensina 1 uM 1,13 126 Enramicina 100 uM 1,28 144 Nisina (Classe I) 10 uM 1,20 139 Duramicina (Classe I) 1 uM 1,04 120 Bacteriocina Gassericina (sup)*2 (Classe IIc) 1 unidade 1,44 162 Plantaricina (sup)*3 (Classe IIb) 1 unidade 1,52 171 Quercetina 100 uM 1,23 138 Polifenol Curcumina 200 uM 1,14 128 Extrato de Semente de Uva*4 200 uM 1,19 157
21 / 38 Glutamina 20 mM 1,18 136 Triptofano 4 mM 1,11 128 Aminoácido Valina 0,2 mM 1,13 130 Fenil-lactato 0,2 mM 1,12 129 Tirosina 20 uM 1,19 138 Ácido orgânico Butilato 2,0 mM 1,13 131 quelato/indutor de HSP Polifosfato (750) 10 ppm 1,12 129 Antioxidante Astaxantina 10 mg/l 1,14 132 Goma-arábica 1 ppm 1,20 139 Pululano 100 ppm 1,11 124 Polissacarídeo GGM 1 ppm 1,08 122 XG 1 ppm 1,06 119 *1: Valor de comparação com Ctr (grupo adicionado com TNFα sozinho) *2: Gassericina (sup): O sobrenadante de cultura das bactérias produtoras (Lactobacillus gasseri LA39 JCM 11657) concentrado três vezes com uma membrana de ultrafiltração (MW: 3.000 *3: Plantaricina (sup): O sobrenadante de cultura das bactérias produtoras (Lactobacillus plantarum JCM 1057) concentrado três vezes com uma membrana de ultrafiltração (MW: 3.000 *4: “OmniVinTM 10R” fabricado por Ajinomoto
22 / 38 EXEMPLO 1: QUERCETINA REVESTIDA 1 a 1. PREPARAÇÃO DE QUERCETINA REVESTIDA
[0090] Quercetina (reagente fabricado por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (95% de pureza)) foi usada como o núcleo, e óleo de colza hidrogenado (ponto de fusão 67°C) e goma-laca de resina natural foram usados como os agentes de revestimento. O núcleo em pó ou granular foi aspergido com uma quantidade predeterminada de agente de revestimento, liquefeito por aquecimento a uma temperatura superior ao ponto de fusão, para obtenção de um aditivo de ração de tipo revestido. O revestimento foi realizado aspergindo 5 partes em massa de goma-laca como a primeira camada (camada interna) e 17 partes em massa de óleo de colza hidrogenado como a segunda camada (camada externa), com base em 77 partes em massa do núcleo. 1 a 2. TESTE DE RESISTÊNCIA A ÁCIDO E ENTÉRICO
[0091] (Tratamento de Suco Gástrico Artificial) A água pura produzida usando um dispositivo de produção de água pura fabricado por Merck Millipore, sendo que 0,2% em massa de NaCl e 0,2% em massa de pepsina (de Mucosa de estômago de porco, 1:5.000, 2.500 unidades/mg) foram adicionados para ajustar o pH para 2, e, então, o aditivo de ração de tipo revestido preparado em 1 a 1 acima foi carregado no mesmo, seguido por tratamento enzimático a 37°C por 2 horas. A taxa de dissolução foi medida medindo automaticamente e continuamente a densidade óptica durante esse período. Observe que as “2 horas” assumem o tempo desde o momento em que a ração chegue ao estômago da galinha até que a mesma passe.
[0092] (Tratamento de Suco Intestinal Artificial) Após o tratamento de suco gástrico artificial, foi adicionado 0,2% de tripsina (do Pâncreas Porcino, 1:5.000; 4.500 unidades/mg) para ajustar o pH para 6, seguido por tratamento enzimático a 37°C por 2 horas. A taxa de dissolução foi medida medindo automaticamente e continuamente a densidade óptica durante esse
23 / 38 período. Observe que as “2 horas” assumem o tempo desde o momento em que a ração atinge o intestino da galinha até que a mesma passe.
[0093] Para ajuste do pH, foram usados ácido clorídrico e hidróxido de sódio. A densidade óptica foi medida em OD 660 nm usando um gravador de Biophoto TVS062CA fabricado por ADVANTEC.
[0094] A Figura 2 apresenta os resultados. Da Figura 2, no revestimento de duas camadas, a taxa de dissolução dentro de 2 horas a partir do início do tratamento de suco gástrico foi suprimida para 25%, enquanto, no tratamento de suco intestinal, 65% foi dissolvida. A partir desses resultados, verificou-se que o aditivo de ração tendo uma camada de óleo de colza hidrogenado como a camada externa, e uma camada de goma-laca como a camada interna apresentava resistência a ácido e propriedades entéricas, e que era excelente no controle de liberação. 1 a 3. TESTE DE CRESCIMENTO DE GALINHA
[0095] A quercetina revestida preparada pelo método de revestimento de duas camadas de 1 a 1 acima foi adicionada à matriz de ração tendo a composição apresentada na Tabela 2, de modo que a quantidade do agente de núcleo fosse de 20 ppm e de 200 ppm para obter uma composição de ração. Em aviário plano, foram usados 25 frangos de corte neonatos em 1 seção, alimentados com a composição de ração, e criados por 22 dias de 0 a 21 dias de idade em triplicado para avaliação do ganho de peso corporal da galinha (BWG) e da razão de conversão de ração (FCR = Ração/BWG). Observe que um promotor de crescimento antimicrobiano convencional (AGP), avilamicina, foi usado como um controle positivo. Como avilamicina, um produto disponível comercialmente (Surmax 200 (marca registrada) fabricado por ELANCO, sem revestimento) foi usado como era.
[0096] Os resultados são apresentados com um controle negativo de
100. A Tabela 3 apresenta os resultados. Embora seja conhecido que a quercetina não revestida apresenta um efeito negativo na microbiota intestinal
24 / 38 (J. Nutr. 139 965-974, 2009.), a quercetina revestida exibiu um efeito de ganho de peso corporal e um efeito de melhoramento de razão de conversão de ração. Observe que, uma vez que a quercetina não revestida apresenta um efeito negativo na microbiota intestinal, o teste de crescimento de galinha usando quercetina não revestida não foi realizado. [TABELA 2] *Composição de Ração Matéria-prima % de Razão de Mistura, Massa Milho 45,4 Grão de Sorgo 10,0 Farinha de Soja 30,0 Farinha de Glúten de Milho 4,00 Farinha de peixe (65% de CP) 3,00 Cloridrato de L-Lisina 0,31 DL-Metionina 0,35 L-Treonina 0,12 L-Arginina 0,16 Óleo Animal e/ou Gordura 3,49 Fosfato de Cálcio Dibásico 1,45 Carbonato de Cálcio 1,06 Sal 0,30 Premix Vitamínico e Mineral 0,25 Cloreto de Colina 0,02 L-Valina 0,07 Total 100 [TABELA 3] Categoria Adição 0 a 3 semanas ppm BWG FCR AGP PC1/Avilamicina 10 110% 96% Fortalecimento de Quercetina Revestida 20 106% 98% Membrana Quercetina Revestida 200 104% 98% EXEMPLO 2: PHE REVESTIDA E TYR REVESTIDA 2 a 1: PREPARAÇÃO DE PHE REVESTIDA E DE TYR REVESTIDA
[0097] A Phe revestida e a Tyr revestida foram preparadas de acordo com a descrição em 1 a 1 do Exemplo 1. 2 a 2: TESTE DE RESISTÊNCIA A ÁCIDO E ENTÉRICO
[0098] A Tyr revestida obtida acima foi usada para realizar o teste de resistência a ácido e entérico da mesma maneira que em 1 a 2 do Exemplo 1. A Figura 3 apresenta os resultados. 2 a 3: TESTE DE CRESCIMENTO DE GALINHA
[0099] A Phe revestida e a Tyr revestida obtidas acima foram
25 / 38 adicionadas à matriz de ração tendo a composição apresentada na Tabela 2, de modo que a quantidade do material de núcleo fosse de 200 ppm, para, desse modo, avaliar o efeito de ganho de peso corporal e razão de conversão de ração de galinhas de acordo com o método descrito em 1 a 3 do Exemplo 1. A Tabela 4 apresenta os resultados.
[00100] Um certo grau de efeito de ganho de peso corporal foi confirmado mesmo quando Phe e Tyr não eram revestidas, porém Phe ou Tyr não foi detectada no conteúdo do trato intestinal ou sangue como resultado da análise do metaboloma. Considera-se, assim, que a Phe revestida e Tyr revestida são assimiladas pelas bactérias intestinais nas fezes e, rapidamente, metabolizadas no sangue. Portanto, considera-se que os aminoácidos revestidos mais estáveis exibem o efeito do que os aminoácidos não revestidos. [TABELA 4] Adição 0 a 3 semanas Categoria ppm BWG FCR PC1/Avilamicina 10 107% 95% Phe 200 106% 98% Phe Revestida 200 103% 97% Tyr 200 104% 98% Tyr Revestida 200 105% 99% 2 a 4: AVALIAÇÃO DE L-TYR E DE L-TYR REVESTIDA POR TESTE
DE INFECÇÃO DE SALMONELLA EM GALINHAS
[00101] A Tyr revestida e a Tyr preparada da mesma maneira que no Exemplo 2 a 1 foram adicionadas à matriz de ração tendo a composição apresentada na Tabela 2, de modo que a quantidade do material de núcleo fosse de 200 ppm, para, desse modo, preparar uma ração. Frangos de corte com 1 dia de idade foram introduzidos em um criadouro para teste de infecção (6 frangos de corte/repetição e 2 repetições/grupo de teste), então Salmonella enterica (SE) foi administrada por via oral aos frangos de corte com 2 dias de idade, que foram alimentados com a ração de teste por 21 dias para avaliar o efeito de ganho de peso corporal e razão de conversão de ração de galinhas. Observe que um promotor de crescimento antimicrobiano
26 / 38 convencional, enramicina, foi usado como um controle positivo. Como enramicina, um produto disponível comercialmente (“Enramicina F-80” fabricado por Scientific Feed Laboratory Co., Ltd., não revestido) foi usado como era.
[00102] Os resultados são apresentados com um controle negativo de
100. A Tabela 5 apresenta os resultados. [TABELA 5] 0 a 3 semana Grupo de Teste Adição, ppm
BWG FCR Grupo de Controle - 100% 100% Enramicina (AGP) 10 107% 98% L-Tyr 200 96% 100% L-Tyr Revestida 200 109% 97%
[00103] Como um resultado, não houve efeito na tirosina não revestida (“L-Tyr”), porém a Tyr revestida exibiu os mesmos efeito de ganho de peso corporal e efeito de melhoramento de razão de conversão de ração que as da enramicina. EXEMPLO 3: NISINA A REVESTIDA 3 a 1: PREPARAÇÃO DE NISINA A REVESTIDA
[00104] A Nisina A (reagente fabricado por Sigma-Aldrich (teor de nisina 2,5% em massa, equilíbrio de cloreto de sódio e sólidos de leite desnaturado) foi usada como o núcleo, e óleo de colza hidrogenado (ponto de fusão a 67°C) e goma-laca de resina natural foram usados como agentes de revestimento. Um aditivo de ração de tipo revestido com um revestimento de duas camadas foi obtido de acordo com a descrição em 1 a 1 do Exemplo 1. 3 a 2: TESTE DE RESISTÊNCIA A ÁCIDO E ENTÉRICO
[00105] A nisina A revestida preparada acima foi usada para realizar o teste de resistência a ácido e entérico da mesma maneira que em 1 a 2 do Exemplo 1. A Figura 4 apresenta os resultados. 3 a 3: TESTE DE CRESCIMENTO DE GALINHA
[00106] A nisina A revestida preparada em 3 a 1 foi adicionado à matriz de ração tendo a composição apresentada na Tabela 2, de modo que a
27 / 38 quantidade do material de núcleo fosse de 1 ppm e 10 ppm, para, desse modo, avaliar o efeito de ganho de peso corporal e razão de conversão de ração de galinhas. Em um aviário plano, foram usados 25 frangos de corte neonatos em 1 seção, e criados de 0 a 21 dias de idade em triplicado. A Tabela 6 apresenta os resultados. Embora nisina tenha diminuído em atividade pelo ácido gástrico e tenha sido completamente inativada pela enzima digestiva tripsina, a nisina A revestida foi observada para apresentar um efeito de ganho de peso corporal e um efeito de melhoramento de razão de conversão de ração. [TABELA 6] Adição 0 a 3 semanas Categoria (ppm) BWG FCR NC 100% 100% PC1 (W/Avilamicina) 10 104% 97% PC2 (W/Avilamicina) 10 107% 94% Nisina A Revestida 10 103% 97% Nisina A Revestida 1 101% 98% 3 a 4: AVALIAÇÃO DE NISINA A REVESTIDA E DE PULULANO
REVESTIDO POR TESTE DE INFECÇÃO DE SALMONELLA EM GALINHAS
[00107] A nisina A revestida preparada em 3 a 1 foi usada sozinha ou em combinação com pululano revestido, e adicionada à matriz de ração tendo a composição apresentada na Tabela 2, de modo que a quantidade de cada agente de núcleo adicionado fosse de 10 ppm, para, desse modo, preparar uma ração. Frangos de corte com 0 dias de idade foram introduzidos em um criadouro para teste de infecção (2 repetições/grupo teste e 6 frangos de corte/repetição), e, então, Salmonella enterica (SE) foi administrada em 107 contagens/frango de corte com uma sonda na cultura dos frangos de corte com 2 dias de idade, que foram alimentados com a ração de teste por 21 dias para avaliar o efeito de ganho de peso corporal e a razão de conversão de ração. A Tabela 7 apresenta os resultados. [TABELA 7] Quantidade Adicionada 0 a 3w Grupo de Teste [ppm] BWG FCR Grupo de Controle - 100% 199% Grupo de Nisina A Revestida 10 102% 92% Grupo de Nisina A Revestida + Pululano Revestido 10, 10 105% 98%
28 / 38
[00108] Como um resultado, tanto o grupo de nisina revestida como o grupo de nisina revestida + pululano revestido exibiram um efeito de ganho de peso corporal e um efeito de melhoramento de razão de conversão de ração. 3 a 5: AVALIAÇÃO DE NISINA A E DE NISINA A REVESTIDA POR
TESTE DE INFECÇÃO DE SALMONELLA EM GALINHAS
[00109] A nisina A revestida e a nisina A preparada da mesma maneira que no Exemplo 3 a 1 foram adicionadas à ração como apresentado na Tabela 2 para preparar uma ração. Frangos de corte com 0 dias de idade foram introduzidos em um criadouro para teste de infecção (6 frangos de corte/repetição e 2 repetições/grupo de teste), então Salmonella enterica (SE) foi administrada por via oral aos frangos de corte com 2 dias de idade, que foram alimentados com a ração de teste por 21 dias para avaliar o efeito de ganho de peso corporal e razão de conversão de ração. Observe que um promotor de crescimento antimicrobiano convencional, enramicina, foi usado como um controle positivo. Como enramicina, um produto disponível comercialmente (“Enramicina F-80” fabricado por Scientific Feed Laboratory Co., Ltd., não revestido) foi usado como era.
[00110] A Tabela 8 apresenta os resultados. [TABELA 8] 0 a 3 semanas Grupo de Teste Volume, ppm
BWG FCR Grupo de Controle - 100% 100% Enramicina (AGP) 10 107% 98% Nisina A 10 101% 100% Nisina A Revestida 10 107% 97%
[00111] Como um resultado, não houve efeito na nisina A não revestida, porém a nisina A revestida exibiu os mesmos efeito de ganho de peso corporal e efeito de melhoramento de razão de conversão de ração que as da enramicina. EXEMPLO EXPERIMENTAL B: AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE
ANTIBACTERIANA E AVALIAÇÃO DE ESPECTRO
29 / 38
ANTIBACTERIANO PARA BACTERIOCINA B-1: MEDIÇÃO DE CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
[00112] As concentrações inibitórias mínimas de AGP e nisina foram medidas e comparadas.
[00113] Lactococcus lactis AJ110212 (FERM BP-8552) foi usado como a bactéria produtora de nisina Z. As bactérias produtoras de nisina Z foram cultivadas a 100 rpm a 30°C em um meio (1 L de Caldo de Lactobacilli MRS fabricado por BD Difco) em frasco Sakaguchi de 5 l. A cultura foi realizada por 20 horas como um padrão, e a solução de cultura foi preparada medindo a densidade óptica em um comprimento de onda de 610 nm com um espectrofotômetro (gravador Biophoto TVS062CA fabricado por ADVANTEC) para ser 0,1 ou mais quando diluído 26 vezes . A solução de cultura obtida foi centrifugada (6.000 G x 10 min, 4°C) para separar uma fração celular (células molhadas).
[00114] As seguintes cepas foram usadas como bactérias de teste. A temperatura do meio e da cultura está escrita entre parênteses no final da cepa. O meio MRS usado foi Caldo de Lactobacilli MRS fabricado por Difco, o meio GAM e o meio LB usados foram fabricados por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., e o meio NB usado foi fabricado por Difco. BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS · Lactobacillus acidophilus AJ13778 (MRS, 37°C, correspondente ao depositado no número de acesso JCM 1132) · Lactobacillus salivarius AJ110152 (MRS, 37°C, correspondente ao depositado no número de acesso JCM 1231) · Bifidobacterium thermophilum AJ110569 (GAM, 37°C, correspondente ao depositado no número de acesso JCM 1207) · Bacteroides fragilis JCM 11019 (GAM, 37°C) · Escherichia coli MG1655 (LB, 37°C, correspondente ao depositado no número de acesso ATCC 700926)
30 / 38 · Clostridium perfringens AJ3350 (GAM, 37°C, correspondente ao depositado no número de acesso ATCC 10873) BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS · Enterococcus faecalis AJ110149 (MRS, 30°C, correspondente ao depositado no número de acesso JCM 5803) · Salmonella enterica AJ2785 (NB, 37°C, correspondente ao depositado no número de acesso IAM 1648)
[00115] Observe que a instituição depositária para bactérias identificadas por um número de acesso que começa com JCM é Coleção de Microorganismos Japonesa, RIKEN BioResource Research Center (código postal 305-0074, 3-1-1 Koyadai, Cidade de Tsukuba, Prefeitura de Ibaraki). A instituição depositária para bactérias identificadas por um número de acesso que começa com ATCC é Coleção de Tipo de Cultura Americana, Manassas, VA, EUA. A instituição depositária para bactérias identificadas por um número de acesso que começa com IAM é Coleção de Cultura de IAM, Centro de Pesquisa Celular e Molecular, Instituto de Biociências Moleculares e Celulares, Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão (coleção transferida para JCM).
[00116] A concentração inibitória mínima foi calculada medindo a atividade antibacteriana pelo método spot-on-lawn descrito em Mayr-Harting, A. et al., Methods Microbiol. 1972, 7A, pp 315 a 422. No caso de utilização de uma solução de cultura, foi feito um julgamento qualitativo com base no tamanho do círculo de inibição. A Tabela 9 apresenta os resultados.
[TABELA 9]
DADOS COMPARATIVOS SOBRE AS CONCENTRAÇÕES INIBITÓRIAS MÍNIMAS DE AGP E NISINA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (MG/ML) Promotor de Crescimento de Antibiótico (AGP) Classe I Classe III Classe IV Alternativa ao Cepa indicadora Com Base em Poliéter, Com base em Com Base em AGP Com Base em Polipeptídeo Outros Ionóforo Macrólido Polipeptídeo Salinomicina Monensina Bacitracina Enramicina Tilosina Clorotetraciclina Avilamicina Colistina Nisina Lactobacillus acidophilus 2 2 32 0,5 1 4 16 > 100 3,1 AJ13778 Lactobacillus salivarius 1 1 32 0,5 1 3 8 > 100 1,6 AJ110152 31 / 38 Clostridium perfringens 1 1 150 1 4 0,062 1 > 100 1,6 AJ3350 Enterococcus faecalis 0,5 2 128 4 4 ND 2 > 100 3,1 AJ110149 Escherichia coli > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 50 > 100 4 > 25 MG1665 Bacteroides fragilis 64 128 > 100 64 4 4 8 > 100 3,1 JCM11019 Bifidobacterium thermophilum 2 2 4 0,5 0,01 16 16 128 1,6 AJ110569 Salmonella enterica > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 50 > 100 > 100 > 25 AJ2785 “ND”: indica que nenhum efeito foi detectado (não detectado).
32 / 38 B-2: MEDIÇÃO DO ESPECTRO ANTIBACTERIANO
[00117] Para compostos difíceis de obter com reagentes, as seguintes bactérias produtoras foram cultivadas em meio de Caldo de Lactobacilli MRS fabricado por Difco a 30°C para preparar uma solução de cultura contendo bacteriocina.
[00118] · Como bacteriocina/classe I: nisina, nisina A usada em 3 a 1 do Exemplo 3 e nisina Z (bactérias produtoras foram Lactococcus lactis NCIMB 702054). Como as bactérias produtoras de subtilina, foi usado Bacillus subtilis ATCC 6633. Como duramicina, foi usado um reagente fabricado por Sigma-Aldrich (1 mg/ml).
[00119] · Como bacteriocina/classe IIb: bactérias produtoras de plantaricina, foi usado Lactobacillus plantarum JCM 1057.
[00120] · Como bacteriocina/classe IIc: gassericina A, foi usado Lactobacillus gasseri LA39 JCM 11657, e as bactérias produtoras de circularina A usadas foram Clostridium beijerinckii JCM 1390.
[00121] O espectro antibacteriano foi avaliado pelo método spot-on- lawn usando um sobrenadante de solução de cultura concentrado 10 vezes. A Tabela 10 apresenta os resultados da investigação.
[TABELA 10] Espectro Antibacteriano de Bacteriocina Classe I Classe IIb Classe IIc Cepa Indicadora Nisina A* Nisina Z Subtilina Duramicina* Ricina de planta Gassericina A Circularina A Clostridium perfringens +++++ +++ + +++++ ++ ND ND Lactobacillus acidophilus ++++ +++ + + +++ + + Lactobacillus salivarius +++++ ++++ + ND + ND ND AJ110152 Bifidobacterium thermophilum +++++ ++++ + ++ + + + AJ110569 Bacteroides fragilis ++++ + ND + + + + JCM11019 Escherichia coli ++ ND ND ND ND ND ND MG1655 Enterococcus faecalis +++++ +++ + ND ++ ND ND AJ110149
33 / 38 Nisina A (1 mg/ml), Duramicina (1 mg/ml), Outros: Produtores de Bacteriocina “+” a “+++++”: indica a força do efeito antibacteriano.
Quanto mais “+”, mais forte é o efeito. “ND”: indica que nenhum efeito foi detectado (não detectado).
34 / 38
[00122] A partir da comparação entre a Tabela 9 e a Tabela 10 e a Tabela 1, verificou-se que a função de fortalecimento de membrana não estava relacionada com a presença ou ausência de atividade antibacteriana e sua força. EXEMPLO 4: PROBIÓTICOS DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE
BACTERIOCINA REVESTIDA 4 a 1: CULTURA DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE BACTERIOCINA
[00123] Enquanto o Exemplo 3 usou o reagente nisina A, o Exemplo 4 usou Lactococcus lactis FERM BP-8552 como as bactérias produtoras de nisina Z. As bactérias produtoras de nisina Z foram cultivadas a 100 rpm a 30°C em um meio (1 L de Caldo de Lactobacilli MRS fabricado por BD Difco) em frasco Sakaguchi de 5 l. A cultura foi realizada por 20 horas como um padrão, e a solução de cultura foi preparada medindo a densidade óptica em um comprimento de onda de 610 nm com um espectrofotômetro (gravador Biophoto TVS062CA fabricado por ADVANTEC) para ser 0,1 ou mais quando diluído 26 vezes.
[00124] Da mesma maneira, foram obtidas frações celulares de subtilina e plantaricina. Observe que Bacillus subtilis ATCC 6633 foi usado como a bactéria produtora de subtilina. Lactobacillus plantarum JCM 1057 foi usado como a bactéria produtora de plantaricina. 4 a 2: PREPARAÇÃO DO PÓ DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE
BACTERIOCINA
[00125] A fração celular de nisina Z obtida em 4 a 1 foi adicionada à 120 ml do agente protetor, e seca por um secador por aspersão (temperatura de entrada de 80°C e temperatura de saída de 50°C) ou liofilização despressurizada. O agente protetor é como segue. (A) 10% de leite desnatado em massa (fabricado por BD) + 3% de glutamato de sódio em massa (MSG, AJICO) (B) 3% de MSG em massa, 10% de sorbitol em massa, 10% de
35 / 38 trealose em massa e 10% de sacarose em massa ((MSG foi fabricado por AJICO, e os outros, exceto MSG, foram fabricados por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
[00126] A contagem de células viáveis no pó de bactérias produtoras de nisina Z obtidas foi medida. A contagem de células viáveis foi medida como segue. A amostra em pó em uma quantidade de 0,01 g foi suspensa em 1 ml de soro fisiológico, e o soro fisiológico foi diluído 10 vezes em sequência, sendo 0,1 ml espalhado em placa de ágar MRS, e cultivado a 30°C por 24 horas, e o número de colônias formadas foi usado para medir a unidade formada de colônia (cfu)/g.
[00127] Da mesma maneira, foi obtido pó de bactérias produtoras de subtilina e plantaricina, e as bactérias produtoras foram medidas. 4 a 3: PREPARAÇÃO DE PÓ DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE NISINA Z REVESTIDA, PÓ DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE SUBTILINA REVESTIDA, E PÓ DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE
PLANTARICINA REVESTIDA
[00128] O pó de bactérias produtoras de nisina Z preparada em 4 a 2 foi revestido da mesma maneira que descrito em 1 a 1 do Exemplo 1 para obter pó de bactérias produtoras de nisina Z revestida.
[00129] Da mesma maneira, foram preparados pó de bactérias produtoras de subtilina revestida e pó de bactérias produtoras de plantaricina revestida. 4 a 4: TESTE DE RESISTÊNCIA A ÁCIDO E ENTÉRICO
[00130] O pó de bactérias produtoras de bacteriocina revestida obtido em 4 a 3 foi submetido ao tratamento de suco gástrico artificial e ao tratamento de suco de intestino artificial descritos em 1 a 2 dos Exemplos 1.
[00131] A resistência a ácido foi avaliada através da medição da contagem de células viáveis e atividade antibacteriana de cada bacteriocina após tratamento de suco gástrico artificial e tratamento de suco intestinal
36 / 38 artificial.
A contagem de células viáveis foi medida de acordo com a descrição em 4 a 2. A atividade antibacteriana foi medida de acordo com a descrição em B-2 do Exemplo Experimental B.
A Tabela 11 apresenta os resultados.
Observe que os significados de “+” e “ND” na Tabela são os mesmos que os descritos na Tabela 10.
[TABELA 11] 0 Ctr (h) Tratamentos de Suco Gástrico 2 (h) Tratamento de Suco Intestinal 4 (h) Bacteriocina Crescimento, cfu Atividade Antibacteriana Crescimento, cfu Atividade Antibacteriana Crescimento, cfu Atividade Antibacteriana Nisina Z 2,1*10^10 ++++ 1,4*10^2 ND 1,0*10^2 ND Subtilina 2,1*10^8 ++++ 1,1*10^8 ++ 1,0*10^8 ++ Plantaricina 7,1*10^10 ++ 2,0*10^5 ND 2,0*10^5 ND
37 / 38
38 / 38 4 a 5: TESTE DE CRESCIMENTO DE GALINHA USANDO PÓ DE
BACTÉRIAS PRODUTORAS DE NISINA Z REVESTIDA
[00132] O pó de bactérias produtoras de nisina Z revestida preparado em 4 a 3 foi adicionado à matriz de ração apresentada na Tabela 2, de modo que a contagem de células viáveis fosse como na Tabela abaixo, e o método descrito em 1 a 3 do Exemplo 1 foi seguido para avaliar o efeito de ganho de peso corporal e razão de conversão de ração de galinhas. [TABELA 12] 0 a 3 semanas Categoria Quantidade Adicionada (cfu)
BWG FCR Sem Tratamento - 100 100 Produtor de Nisina 1010 103 100 EXEMPLO 5: TESTE DE CRESCIMENTO DE GALINHA
[00133] Três condições foram preparadas, uma ração contendo AGP (PC) obtido pela adição de antibióticos (0,05% de lasalocida em massa e 0,01% de avilamicina em massa) a uma ração padrão, uma ração suplementada com PRB (nisina (Lc)) suplementada com 2% de solução de cultura de nisina A obtida por cultura de Lactococcus lactis NCIMB 8780 da mesma maneira que no Exemplo 4 a 1, e uma ração livre de AGP (somente ração padrão) (NC), e foram administradas a pintos recém-nascidos. Observe que, para uma condição, foram usados dez pintos recém-nascidos machos de Frangos de Corte Cobb, e o experimento foi repetido três vezes para avaliar o efeito de ganho de peso corporal e razão de conversão de ração de galinhas. Para o grupo livre de fármaco (NC), foi usado uma ração padrão (ME 3160 kcal e 22% de CP em massa sem antibióticos usados). Para o grupo de adição de PC e nisina, foi adicionado 2% em massa dos antibióticos (lasalocida e avilamicina) ou líquido contendo nisina Z à ração padrão (ME 3160 kcal e 22% de CP em massa), respectivamente. [TABELA 13]
BWG FCR Categoria 1w 2w 1W 2W. NC 106,2 ± 3,0 330,3 ± 7,8 1,19 ± 1 1,34 ± 0,02 PC* 110,4 ± 4,7 379,9 ± 10,0 1,08 ± 0 1,23 ± 0,02 Nisina (Lc)** 111,1 ± 5,4 352,4 ± 27,9 1,23 ± 2 1,35 ± 0,03 *: Antibióticos: 0,05% de lasalocida e 0,01% de avilamicina adicionados. **: Para nisina, foi adicionado 2% de solução de cultura de Lactococcus lactis.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado, caracterizada pelo fato de que compreende: um núcleo contendo uma substância fisiologicamente ativa tendo uma propriedade de fortalecer uma membrana de células epiteliais intestinais; e um agente de revestimento de núcleo.
2. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: a substância fisiologicamente ativa contém pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em bacteriocinas, polifenóis, aminoácidos ou derivados do mesmo, ácidos orgânicos ou derivados do mesmo, indutores de HSP, antioxidantes e polissacarídeos.
3. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que: a substância fisiologicamente ativa é pelo menos uma bacteriocina selecionada a partir do grupo que consiste em nisina, subtilina, plantaricina e gassericina.
4. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que: a substância fisiologicamente ativa está contida em uma cultura de um micro-organismo que produz a substância.
5. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que: a substância fisiologicamente ativa está contida em uma cultura de pelo menos um micro-organismo selecionado a partir do grupo que consiste em Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus.
6. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que: o micro-organismo é Bacillus subtilis, Lactococcus lactis, ou Lactobacillus plantarum.
7. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que: o polifenol é quercetina ou tanino.
8. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que: o aminoácido é, pelo menos, um selecionado a partir do grupo que consiste em glutamina, fenilalanina, triptofano, valina e tirosina.
9. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que: o indutor de HSP é ácido polifosfórico ou um fator de competência e esporulação.
10. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que: o agente de revestimento contém pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em óleo vegetal hidrogenado, goma-laca, zeína, hidroxipropilmetilcelulose e maltitol.
11. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que: a substância fisiologicamente ativa é pelo menos uma bacteriocina selecionada a partir do grupo que consiste em nisina, subtilina, plantaricina, e gassericina, e o agente de revestimento é óleo de colza hidrogenado e/ou goma-laca.
12. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que: uma camada de revestimento formada pelo agente de revestimento apresenta uma estrutura de duas camadas que incluem uma camada formada de óleo de colza hidrogenado e uma camada formada de goma-laca.
13. Composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que: a camada formada de goma-laca está em contato com o núcleo, e a camada formada de óleo de colza hidrogenado é formada no mesmo.
14. Ração, caracterizada pelo fato de que compreende: uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
15. Método para melhorar um ganho de peso corporal de gado e razão de conversão de ração para gado, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma composição de aditivo de ração de tipo revestido para melhorar o ganho de peso corporal de gado ou a razão de conversão de ração para gado como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou a ração como definida na reivindicação 14.
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