JP3553128B2 - リポマイセス属に属する菌体外多糖高生産株の育種法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、土壌改良剤等として有用な多糖の生産性の高いリポマイセス属に属する微生物とその選択法、並びにこの微生物を用いた多糖の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌粒子の団粒形成は、植物の生育にとって重要な因子であり、土壌の団粒化を促進するために土壌改良剤が使用されている。このような土壌改良剤として、堆肥や厩肥が古くから用いられており、近年ではポリアクリル酸塩、ポリアクリルニトリル、ポリアクリルアミド及びポリビニルアルコール等の合成高分子化合物や、アルギン酸、酸化デンプン、キトサン等の天然物由来の多糖類、さらにはこれらの誘導体が用いられるようになっている。
【０００３】
しかし、堆肥や厩肥は単位面積当たりの使用量が多く、必要量を確保することが困難であり、また、上記のような合成高分子化合物は、微生物によって分解されにくいために土壌中に長時間残留し、安全性の面から問題が残る。さらに、天然物由来の多糖類は、これらのものに比べて団粒形成作用が弱く、原料となる天然物の入手が天候などによって左右されるという問題があった。
【０００４】
これに対し、本発明者らは、子嚢菌に属する土壌酵母の一種であるリポマイセス スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）の生産する菌体外多糖が、土壌の団粒形成に著効を示し、しかも土壌中に長期間残留したりするなど安全性の問題もなく、有効な土壌改良剤として使用できることを見出している（特開平５−３１１１６９号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、リポマイセス属に属する微生物の産生する菌体外多糖を用いた土壌改良剤をさらに実用化するために、この菌体外多糖の生産性の高いリポマイセス属に属する微生物株を育種選択し、その株を用いて菌体外多糖を効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、リポマイセススタルキーの菌体外多糖の産生と子嚢形成率との間に相関があることを見出し、リポマイセス スタルキー菌体外多糖高生産株を育種することに成功し、本発明に至った。
【０００７】
すなわち本願発明は、リポマイセス属に属する微生物から子嚢形成率の低い株を選択することを特徴とする菌体外多糖高生産株の育種法である。本発明の育種法の好ましい態様として、
（ａ）リポマイセス属に属する微生物の子嚢から単胞子を分離し、
（ｂ）分離した単胞子を発芽生育させて子嚢を形成させ、
（ｃ）子嚢形成率の低い株を選択してその株から単胞子を分離し、
上記（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことによって子嚢形成率の低い株を選択する方法が挙げられる。ここで、リポマイセス属に属する微生物としては、リポマイセス スタルキー等が挙げられる。
【０００８】
また本願発明は、実質的に子嚢を形成しないリポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２７６）株を提供する。
さらに本願発明は、前記菌体外多糖高生産株を培養し、培養液中に菌体外多糖を生成蓄積させ、この培養液から多糖を回収することによってリポマイセス属に属する微生物の産生する菌体外多糖を製造する方法を提供する。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
＜１＞菌体外多糖高生産株の育種
菌体外多糖を高効率で生産するリポマイセス属に属する微生物は、子嚢形成率を指標とし、子嚢形成率の低い株を選択することにより得られる。菌体外多糖高生産株の選択に用いるリポマイセス属に属する微生物としては、リポマイセス スタルキーが好ましいが、リポマイセス属に属し菌体外多糖を産生するものであれば特に制限されない。このような微生物としては、例えばリポマイセス リポフェラス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）（現在はワルトマイセス リポファー（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｐｏｆｅｒ）として分類されている）、リポマイセス コノネンコアーエ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ）、リポマイセス テトラスポルス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｔｅｔｒａｓｐｏｒｕｓ）等が挙げられる。これらの微生物は、多くの菌株保存機関に保存されており、また土壌から容易に分離することができるので、容易に入手することができる。以下に、これらの寄託菌株を例示する。
【００１１】
リポマイセス スタルキー ＣＢＳ １８０７
リポマイセス スタルキー ＣＢＳ １８０９
リポマイセス スタルキー ＣＢＳ ２５１６
リポマイセス スタルキー ＩＦＯ １０３８１
リポマイセス コノネンコアーエ ＣＢＳ ２５１４
リポマイセス コノネンコアーエ ＣＢＳ ５６０８
リポマイセス テトラスポルス ＣＢＳ １８１０
リポマイセス テトラスポルス ＣＢＳ ２５１１
リポマイセス テトラスポルス ＣＢＳ ５９１０
リポマイセス リポフェラス ＣＢＳ ９４４
リポマイセス リポフェラス ＣＢＳ ５８４１
リポマイセス リポフェラス ＣＢＳ ５８４２
【００１２】
リポマイセス スタルキーの産生する菌体外多糖は、マンノース、グルクロン酸、ガラクトース、及びマンノースとグルクロン酸を１：２のモル比で含むトリサッカライドを含み、一方リポマイセス リポフェラスの産生する菌体外多糖は、マンノースとグルクロン酸を含むことが報告されている（Ｍ．Ｅ．Ｓｌｏｄｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９６６，４２，３８１−３８５））。尚、本発明者らの分析では、リポマイセス スタルキーの産生する菌体外多糖は、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、及び少量のグルコースであり、その構成比は２：２：１：微量となっている（特開平５−３１１１６９号公報）。
【００１３】
このように、リポマイセス属に属する微生物でも種によって産生する菌体外多糖が異なり、一種の分類法として提唱されている（Ｍ．Ｅ．Ｓｌｏｄｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９６６，４２，３８１−３８５））が、リポマイセス スタルキー以外のリポマイセス属酵母の産生する菌体外多糖を土壌改良剤として有効に利用できることを否定する積極的な根拠はない。また、菌体外多糖を生産する理由として、土壌中という生育にとって厳しい環境の中で、多糖により土壌を団粒化させ、水分、ｐＨ、空気量などを維持、調節し、自らが住み易い環境を作り出すためであるという仮説もあり（特開平５−３１１１６９号公報）、リポマイセス スタルキー以外のリポマイセス属酵母の産生する菌体外多糖を土壌改良剤として利用できることを支持している。
【００１４】
以下に、子嚢形成率を指標として菌体外多糖高生産株を育種する方法の１例を説明する。先ず、リポマイセス属微生物の土壌分離菌あるいは保存菌株等を親株とし、これを培養して子嚢を形成させる。この子嚢から単胞子を分離し、得られた単胞子を平板培地に接種し発芽生育させてコロニーを形成させ、さらに子嚢を形成させて子嚢形成率を調べ、子嚢形成率（全栄養細胞数に対する胞子嚢を形成した栄養細胞数の比）の低い株を選択する。選択された株の子嚢から再び単胞子を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、子嚢を殆どあるいは全く形成しなくなった株が得られる。この際、単胞子からコロニーを形成させるには生育のよい培地（例えば後述のＹＭ培地等）を用い、子嚢を形成させるには前記コロニーから子嚢形成性のよい培地（例えば後述のコーン・ミール培地等）に菌体を移して培養するとよい。
【００１５】
単胞子の分離は、例えば以下のようにして行うことができる。リポマイセス属に属する微生物をＹＭ培地等の平板培地で前培養（２２℃、５日）し、これをコーンミール培地（ＣＭ培地）等の平板培地に接種して胞子を形成させる。菌体を、平板培地上に滴下した殺菌水に懸濁し、平板上に懸濁液を広げる。胞子懸濁液が乾いた後に、ミクロマニピュレータシステムを用いて、ガラス針で胞子を単離する。
【００１６】
上記のようにして得られる子嚢形成率の低下した株は、実際に菌体外多糖を効率よく生産することを確認しておくことが好ましい。菌体外多糖の生産性は次のようにして調べることができる。単胞子分離を繰り返して得られた株を適当な培地で培養する。培養液を遠心分離し、上清を０．０１Ｍ酢酸で洗浄し短冊状に切断した濾紙（例えば東洋濾紙 Ｎｏ．５０）にスポットし、エチル酢酸：酢酸：ピリジン：水（５：１：５：３ Ｖ／Ｖ）混合液で３〜５時間展開させる。この濾紙を風乾し、多糖部分（出発点の前後約１ｃｍ）を切り取って試験管に入れ、蒸留水１ｍＬを添加する。試験管をタワーミキサーを用いて４〜６時間撹拌し、フィルター（０．４５μｍ）を通して繊維を除去する。濾液１００μＬを試験管に取り、２．５％フェノール液２ｍＬを添加し、ビューレットで一定の高さから濃硫酸５ｍＬを加える。１０分間放置した後、よく混合し、更に３０℃で１５分冷却し、撹拌せずに４９０ｎｍで吸光度を測定する。
【００１７】
菌体外多糖を高効率で生産するリポマイセス属に属する微生物は、上記のように、子嚢形成率の低い株を継代的に選択する方法の他、リポマイセス属に属する微生物を突然変異処理し、子嚢形成率の低い株を選択することによっても得られる。
【００１８】
なお、本発明において菌体外多糖高生産株を育種する際に、子嚢形成率が親株に比べて低下していれば特に低下の程度に制限はないが、後述の算出方法（数１式）により子嚢形成率は５％以下であることが好ましく、実質的に子嚢を形成しなくなったものがさらに好ましい。
【００１９】
後記実施例１に示すように、上記のようにして得られたリポマイセス スタルキーの実質的に子嚢を形成しない株、すなわち菌体外多糖高生産株は、リポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４２７６の受託番号で寄託されている。
【００２０】
＜２＞菌体外多糖の製造法
上記のようにして得られる菌体外多糖高生産株を培養し、培養液中に菌体外多糖を生成蓄積させ、この培養液から多糖を回収することによって、従来の方法よりも効率よく菌体外多糖を製造することができる。本発明の方法においては、リポマイセス属に属する微生物として菌体外多糖高生産株を用いる以外は、従来知られている方法（特開平５−３１１１６９号公報等）と同様にして菌体外多糖を製造すればよい。すなわち、菌体外多糖高生産株を適当な培地（例えば後述のＣＧ−Ｔ培地等）で培養し、培養液を遠心分離して菌体を除去し、培養上清を濃縮した後イソプロパロールを２倍量加えて多糖の沈殿を生じさせ、遠心分離により沈殿を集めて乾燥させる。
【００２１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。尚、本実施例で使用した培地に組成を以下に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
尚、コーンミール培地（以後、ＣＭ培地という）は、コーンミールを水と混合し、６０℃で１時間加熱撹拌し、濾紙で濾過後、寒天及び水を最終量まで加え、１１５℃で１５分オートクレーブした後、脱脂綿で濾過し、さらに１１５℃で１５分オートクレーブすることにより調製される（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ， Ｊ． Ｐ．， ａｎｄ Ｙａｒｒｏｗ， Ｄ． ”Ｔｈｅ ｙｅａｓｔｓ， ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ” ｅｄ． ｂｙ Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ−Ｒｉｊ， Ｎ． Ｊ． Ｗ． Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｐ．７１ （１９８４）：）。あるいは、コーンミールを水と混合し、クリーム状にして沸騰直前の状態で１時間加熱し、チーズクロスで濾過後、寒天を溶解し、水を最終量まで加え、１１５℃で３０分オートクレーブしてもよい（「微生物学実験法」講談社 ４３６頁）。また、市販の培地を使用してもよい。
【００２４】
【実施例１】菌体外多糖高生産株の育種
（１）単胞子分離株の取得
リポマイセス スタルキーＣＢＳ １８０７株あるいはＩＦＯ １０３８１株から単胞子分離を行った。
【００２５】
ＹＭ寒天培地に保存しておいたリポマイセス スタルキーＣＢＳ １８０７株あるいはＩＦＯ １０３８１株をＹＭ寒天培地で前培養（２２℃ ５日）し、これをＣＭ培地に接種して胞子形成（２２℃ ２１日）させた。尚、ＩＦＯ １０３８１株はＣＢＳ １８０７株から移管された株でありカタログ上は同一株であるが、以下に示すように子嚢形成率は異なっている。
【００２６】
ＹＭ寒天プレート上に殺菌水を１〜２滴滴下し、ここに胞子形成させたリポマイセス スタルキーＣＢＳ １８０７株あるいはＩＦＯ １０３８１株の菌体を懸濁した。次に培地を斜めにして懸濁液を帯状に流動させた。以上の操作は無菌的に行った。
【００２７】
次に、予めミクロマニピュレータシステム（顕微鏡：ＯＬＹＭＰＵＳ製 ＩＭＴ−２、ジョイスティクマニピュレータ：ナリシゲ製 ＭＮ−１５１）を設置したアクリルフード内をＳＳ−ＭＡＣフィルターユニット（ＭＡＣ−１０Ｆ型 日本エアテック製）で１５分以上通気して無菌的にし、上記の胞子懸濁液が乾いた後に通気しながら同プレートで複数の胞子を、ガラス針を用いて単離した。このガラス針は、硝子管（ナリシゲ製Ｇ−１）を火炎上で赤熱、伸長して作成した。
【００２８】
（２）継代的単胞子分離
上記のようにして得られたリポマイセス スタルキーＣＢＳ１８０７株及びＩＦＯ １０３８１株の単胞子分離株から胞子を形成させ、再び単胞子分離株を得る手段を繰り返し（以後この操作を「継代的単胞子分離」と呼ぶ）、その結果として子嚢形成能に変化が現れるかを調べた。
【００２９】
継代的単胞子分離は次のようにして行った（図１参照）。ＹＭ寒天培地を用いて２２℃で４日培養した単胞子分離株をＣＭ寒天培地に接種し、２２℃で２１日培養して胞子形成させた。ここで前記と同様にしてＹＭ寒天培地上で単胞子分離を行い、分離された胞子１０個をＹＭ寒天プレート上に接種した。２２℃で１０日培養して得られたコロニーから３コロニーを無作為に選択し、これらのコロニーから菌体を一白金耳づつ取り、直径約２ｃｍの円状となるように１枚のＣＭ寒天培地に接種し、２２℃で２１日培養した後、子嚢形成率を下記式により算出した。ここで、栄養細胞と分離した子嚢は、母体となった栄養細胞が存在していたと考えて計数した。
【００３０】
尚、子嚢と母細胞の分離を極力避けるために、菌体の懸濁は慎重に行った。
【００３１】
【数１】
子嚢形成率 ＝ （ 子嚢を形成した栄養細胞数 ／ 全栄養細胞数 ）×１００
【００３２】
上記操作を繰り返すことにより、継代的単胞子分離を行った。この際、子嚢形成率のさらに低い菌株（低率株）を作為的に選抜して継代を行う系と、その反対に子嚢形成率のさらに高い菌株（高率株）を作為的に選抜して継代を行う系とに分けて行った。ＣＢＳ １８０７株及びＩＦＯ １０３８１株を親株とした子嚢形成率の変化を図２に示した。
【００３３】
継代を繰り返して得られた低率株と高率株および親株を接種菌として、「エタノール培地」（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ， Ｊ． Ｐ．， ａｎｄ Ｙａｒｒｏｗ， Ｄ． ”Ｔｈｅ ｙｅａｓｔｓ， ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ” ｅｄ． ｂｙ Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ−Ｒｉｊ， Ｎ． Ｊ． Ｗ． Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｐ．７１（１９８４））、ＹＭ寒天培地、１／１０濃度のＹＭ寒天培地と比較対象としたＣＭ培地で、それぞれ２２℃で２１日培養して子嚢形成率を算出した結果を表２に示す。尚、表２中の系列は、図２中の系列を表す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
図２から明らかなように、ＣＢＳ １８０７株及びＩＦＯ １０３８１株のいずれにおいても低率株を選択的に取得し続けると、子嚢をほとんど作らない菌株が得られた。しかし、高率株を取得し続けた場合には、ある程度の向上はみられるものの、栄養細胞の大部分が子嚢を作る程度にまでは向上しなかった。ＩＦＯ １０３８１の由来はＣＢＳ １８０７であるが、それぞれを親株としてＣＭ培地で子嚢形成させると、両者の子嚢形成率に１０％内外の差が見られた。そしてそれぞれから高率株を求めたところ、Ｄ系列（ＣＢＳ １８０７）とＥ系列（ＩＦＯ １０３８１）に見られるようにさらに大きな差が生じた（図２）。
【００３６】
また、表２に示したように、継代化によって子嚢形成率が極端に低くなった菌株を、エタノール培地、ＹＭ培地、及び１／１０ＹＭ寒天培地に接種しても子嚢形成は認められなかった。一方ＣＭ培地で子嚢を良く作る菌株はＹＭ培地、１／１０ＹＭ培地等でも子嚢を作ることが分かった。しかし、エタノール培地ではどの菌株も子嚢は形成しなかった。
【００３７】
リポマイセス スタルキーＣＢＳ １８０７株を共通の親株とする低率株（Ａ系列１０代目）と高率株（Ｄ系列１４代目）をＹＭ寒天培地に２２℃で２１日培養した菌体を顕微鏡観察した。その結果、子嚢をほとんど作らない菌株は、高率株に比べて脂肪球は極めて小さく、菌体のサイズもやや小さかった。
【００３８】
（３）継代的単胞子分離株の子嚢形成率と菌体外多糖生産量との関連性
継代的単胞子分離に平行して各々の分離株について、菌体外多糖の生産性をプレート上での観察により評価した。ＹＭ寒天培地に２２℃で４日培養した親株と低率株および高率株の菌体を、３区画に分けた１枚のＹＭ寒天培地およびＣＭ寒天培地の各プレートにそれぞれ１白金耳ずつ接種した。ＹＭ寒天培地では接種後２２℃で７日培養したコロニーの状態、ＣＭ寒天培地では接種後２２℃で２１日培養したコロニーの状態を観察した結果、一般に、ＣＭ培地上で子嚢形成率が高い菌株（ＣＭ培地上では多くの栄養細胞が子嚢を形成した結果、コロニーが茶色く観察された）ほどドライなコロニーを形成することがわかり、見掛上菌体外多糖の生成量は少なかった。同様に、ＹＭ培地上でも子嚢形成率が低いほど菌体外多糖の生成量が多く観察された。
【００３９】
一方、親株（ＩＦＯ １０３８１）と低率株（Ｆ系列１０代目）及び高率株（Ｅ系列０代目）を液体培地中にて培養したときの菌体外多糖の生産量を測定した。培養は、５００ｍＬ容振盪フラスコに１００ｍＬのＣＧ−Ｔ培地を分注して加熱殺菌した後、ＹＭ寒天培地上に２８℃で４日間培養して得た菌体を一白金耳量接種し、２９．５℃にて２００時間、１２０ｒｐｍで振盪することにより行った。
【００４０】
培養液を遠心分離し、上清を０．０１Ｍ酢酸で洗浄し短冊状に切断した濾紙（例えば東洋濾紙 Ｎｏ．５０）にスポットし、エチル酢酸：酢酸：ピリジン：水（５：１：５：３ Ｖ／Ｖ）混合液で３〜５時間展開させた。この濾紙を風乾し、多糖部分（出発点の前後約１ｃｍ）を切り取って試験管に入れ、蒸留水１ｍＬを添加した。試験管をタワーミキサーを用いて４〜６時間撹拌し、フィルター（０．４５μｍ）を通して繊維を除去した。濾液１００μＬを試験管に取り、２．５％フェノール液２ｍＬを添加し、ビューレットで一定の高さから濃硫酸５ｍＬを加えた。１０分間放置した後、よく混合し、更に３０℃で１５分冷却し、撹拌せずに４９０ｎｍで吸光度を測定した。このようにして測定された菌体外多糖の生産量を表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】
表３に示すように、継代的単胞子分離株の子嚢形成率の低下に伴い、菌体外多糖生産量の向上が認められた。
こうして得られたリポマイセス スタルキーの低率株すなわち菌体外多糖高生産株はリポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４２７６の受託番号で寄託されている。
【００４３】
【実施例２】菌体外多糖高生産株を用いた菌体外多糖の製造
リポマイセス属酵母の培養液には、菌体外多糖の他に、培地の成分であるＭｇ２＋、ＮＨ４ ＋のようなイオン類、培養途中で死滅した菌体から出た中性脂肪やリン脂質などの脂質類、酵素などの可溶性蛋白質、不溶性の酵母細胞破片などが多く含まれている。本実施例では、遠心分離、透析、アルコール沈澱など多糖類の分離精製によく用いられる簡単な操作を利用して、これらの夾雑物を除去し、培養液から菌体外多糖を分離、精製した。
【００４４】
（１）菌体外多糖の分離精製
実施例１で得たリポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５株を、本発明者らが開発したＣＧ−Ｔ培地（表１）を用いて約１４０時間振盪培養した（２９．５℃、１２０ｒｐｍ）。
【００４５】
上記で得られた培養液から、次のようにして菌体外多糖を分離精製した。培養液を３０００×ｇで１０分遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ ２０ＰＲ−５２Ｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、上清を回収した。菌体を除いた培養液（菌体外多糖を１５．８ｇ／Ｌ含む）上清１Ｌに１０ｇのセライト（ｃｅｌｉｔｅ）を添加し、充分に撹拌した後、３０００×ｇで遠心分離を行い、得られた上清をさらに濾紙（東洋濾紙Ｎｏ．２）で吸引濾過した。濾液をフラッシュエバポレータ（ＴＯＫＹＯＲＩＫＡ Ｔｈｉｎ Ｆｉｌｍ Ｆｌａｓｈ Ｅｖｅｒｐｏｒａｔｅｒ ＭＦ−５）を用いておよそ１０倍に濃縮した。
【００４６】
濃縮液を、セロファンチューブ３０／３２（和光純薬工業株式会社）に入れ、流水に対して１２時間透析した後、更に脱イオン水と蒸留水に対して各々１２時間の透析を行った。透析液をイソプロパノールと１：２（Ｖ／Ｖ）の割合で混合し、Ｃａ２＋を０．０００６ｍｏｌ／Ｌとなるように添加して氷で冷却した後、３０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離し、沈澱を集めた。
【００４７】
沈殿を少量の蒸留水に溶解し、ナス型フラスコに分注し、約４０時間凍結乾燥機（ＹＡＭＡＴＯ ＦｒｅｅｚｅＤｒｙｅｒ Ｍ−ＤＣ３ ５）で凍結乾燥を行った。こうして分離、精製された菌体外多糖の収量は、１０．５ｇであった。
【００４８】
（２）菌体外多糖の分析
上記のようにして精製された多糖類を蒸留水に溶解して５０ｍＬとした後、この溶液と培養液のＫ＋、Ｍｇ２＋及びＮＨ３−Ｎの濃度を測定し、精製の程度を調べた。Ｋ＋及びＭｇ２＋の濃度の測定は、原子吸光・炎光分光光度計を用いて行った。ＮＨ３−Ｎの濃度の測定は、市販のキット（Ａｍｍｏｎｉａ−Ｔｅｓｔ（藤井・奥田法変法）キット：和光純薬株式会社製）を用いて行った。結果を表４に示す。さらに、精製された多糖類を濃硫酸で加水分解し、Ｓｅｍｉｍｉｃｒｏ Ｋｊｅｌｄａｈｌ法（「京都大学農学部農芸化学科農芸化学実験書」（１９６７）１３１〜１３５頁（産業図書））でタンパク質の含量を調べた結果、０．３％であった。
【００４９】
【表４】
【００５０】
この結果に示されるように、上記の分離、精製処理において、培養液へのセライトの添加と遠心分離により、培養液中の不溶物が除かれ、さらに透析することによって培地中の塩類、低分子の糖、アミノ酸、色素等を除くことができた。また、イソプロピルアルコールを用いた沈殿法により、残存する可溶性物質及び脂質を除去することができた。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、菌体外多糖を高効率で生産するリポマイセス属酵母が得られる。また、本発明により得られる菌体外多糖高生産株を用いることにより、土壌改良剤等として有用な多糖を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】継代的単胞子分離の概念図。
【図２】リポマイセス スタルキー ＣＢＳ １８０７株及びＩＦＯ １０３８１株の継代的単胞子分離における子嚢形成率の変化を示す図。
【産業上の利用分野】
本発明は、土壌改良剤等として有用な多糖の生産性の高いリポマイセス属に属する微生物とその選択法、並びにこの微生物を用いた多糖の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
土壌粒子の団粒形成は、植物の生育にとって重要な因子であり、土壌の団粒化を促進するために土壌改良剤が使用されている。このような土壌改良剤として、堆肥や厩肥が古くから用いられており、近年ではポリアクリル酸塩、ポリアクリルニトリル、ポリアクリルアミド及びポリビニルアルコール等の合成高分子化合物や、アルギン酸、酸化デンプン、キトサン等の天然物由来の多糖類、さらにはこれらの誘導体が用いられるようになっている。
【０００３】
しかし、堆肥や厩肥は単位面積当たりの使用量が多く、必要量を確保することが困難であり、また、上記のような合成高分子化合物は、微生物によって分解されにくいために土壌中に長時間残留し、安全性の面から問題が残る。さらに、天然物由来の多糖類は、これらのものに比べて団粒形成作用が弱く、原料となる天然物の入手が天候などによって左右されるという問題があった。
【０００４】
これに対し、本発明者らは、子嚢菌に属する土壌酵母の一種であるリポマイセス スタルキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）の生産する菌体外多糖が、土壌の団粒形成に著効を示し、しかも土壌中に長期間残留したりするなど安全性の問題もなく、有効な土壌改良剤として使用できることを見出している（特開平５−３１１１６９号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、リポマイセス属に属する微生物の産生する菌体外多糖を用いた土壌改良剤をさらに実用化するために、この菌体外多糖の生産性の高いリポマイセス属に属する微生物株を育種選択し、その株を用いて菌体外多糖を効率よく製造する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、リポマイセススタルキーの菌体外多糖の産生と子嚢形成率との間に相関があることを見出し、リポマイセス スタルキー菌体外多糖高生産株を育種することに成功し、本発明に至った。
【０００７】
すなわち本願発明は、リポマイセス属に属する微生物から子嚢形成率の低い株を選択することを特徴とする菌体外多糖高生産株の育種法である。本発明の育種法の好ましい態様として、
（ａ）リポマイセス属に属する微生物の子嚢から単胞子を分離し、
（ｂ）分離した単胞子を発芽生育させて子嚢を形成させ、
（ｃ）子嚢形成率の低い株を選択してその株から単胞子を分離し、
上記（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことによって子嚢形成率の低い株を選択する方法が挙げられる。ここで、リポマイセス属に属する微生物としては、リポマイセス スタルキー等が挙げられる。
【０００８】
また本願発明は、実質的に子嚢を形成しないリポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２７６）株を提供する。
さらに本願発明は、前記菌体外多糖高生産株を培養し、培養液中に菌体外多糖を生成蓄積させ、この培養液から多糖を回収することによってリポマイセス属に属する微生物の産生する菌体外多糖を製造する方法を提供する。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
＜１＞菌体外多糖高生産株の育種
菌体外多糖を高効率で生産するリポマイセス属に属する微生物は、子嚢形成率を指標とし、子嚢形成率の低い株を選択することにより得られる。菌体外多糖高生産株の選択に用いるリポマイセス属に属する微生物としては、リポマイセス スタルキーが好ましいが、リポマイセス属に属し菌体外多糖を産生するものであれば特に制限されない。このような微生物としては、例えばリポマイセス リポフェラス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）（現在はワルトマイセス リポファー（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｐｏｆｅｒ）として分類されている）、リポマイセス コノネンコアーエ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ）、リポマイセス テトラスポルス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｔｅｔｒａｓｐｏｒｕｓ）等が挙げられる。これらの微生物は、多くの菌株保存機関に保存されており、また土壌から容易に分離することができるので、容易に入手することができる。以下に、これらの寄託菌株を例示する。
【００１１】
リポマイセス スタルキー ＣＢＳ １８０７
リポマイセス スタルキー ＣＢＳ １８０９
リポマイセス スタルキー ＣＢＳ ２５１６
リポマイセス スタルキー ＩＦＯ １０３８１
リポマイセス コノネンコアーエ ＣＢＳ ２５１４
リポマイセス コノネンコアーエ ＣＢＳ ５６０８
リポマイセス テトラスポルス ＣＢＳ １８１０
リポマイセス テトラスポルス ＣＢＳ ２５１１
リポマイセス テトラスポルス ＣＢＳ ５９１０
リポマイセス リポフェラス ＣＢＳ ９４４
リポマイセス リポフェラス ＣＢＳ ５８４１
リポマイセス リポフェラス ＣＢＳ ５８４２
【００１２】
リポマイセス スタルキーの産生する菌体外多糖は、マンノース、グルクロン酸、ガラクトース、及びマンノースとグルクロン酸を１：２のモル比で含むトリサッカライドを含み、一方リポマイセス リポフェラスの産生する菌体外多糖は、マンノースとグルクロン酸を含むことが報告されている（Ｍ．Ｅ．Ｓｌｏｄｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９６６，４２，３８１−３８５））。尚、本発明者らの分析では、リポマイセス スタルキーの産生する菌体外多糖は、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、及び少量のグルコースであり、その構成比は２：２：１：微量となっている（特開平５−３１１１６９号公報）。
【００１３】
このように、リポマイセス属に属する微生物でも種によって産生する菌体外多糖が異なり、一種の分類法として提唱されている（Ｍ．Ｅ．Ｓｌｏｄｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９６６，４２，３８１−３８５））が、リポマイセス スタルキー以外のリポマイセス属酵母の産生する菌体外多糖を土壌改良剤として有効に利用できることを否定する積極的な根拠はない。また、菌体外多糖を生産する理由として、土壌中という生育にとって厳しい環境の中で、多糖により土壌を団粒化させ、水分、ｐＨ、空気量などを維持、調節し、自らが住み易い環境を作り出すためであるという仮説もあり（特開平５−３１１１６９号公報）、リポマイセス スタルキー以外のリポマイセス属酵母の産生する菌体外多糖を土壌改良剤として利用できることを支持している。
【００１４】
以下に、子嚢形成率を指標として菌体外多糖高生産株を育種する方法の１例を説明する。先ず、リポマイセス属微生物の土壌分離菌あるいは保存菌株等を親株とし、これを培養して子嚢を形成させる。この子嚢から単胞子を分離し、得られた単胞子を平板培地に接種し発芽生育させてコロニーを形成させ、さらに子嚢を形成させて子嚢形成率を調べ、子嚢形成率（全栄養細胞数に対する胞子嚢を形成した栄養細胞数の比）の低い株を選択する。選択された株の子嚢から再び単胞子を分離する。以上の操作を繰り返すことにより、子嚢を殆どあるいは全く形成しなくなった株が得られる。この際、単胞子からコロニーを形成させるには生育のよい培地（例えば後述のＹＭ培地等）を用い、子嚢を形成させるには前記コロニーから子嚢形成性のよい培地（例えば後述のコーン・ミール培地等）に菌体を移して培養するとよい。
【００１５】
単胞子の分離は、例えば以下のようにして行うことができる。リポマイセス属に属する微生物をＹＭ培地等の平板培地で前培養（２２℃、５日）し、これをコーンミール培地（ＣＭ培地）等の平板培地に接種して胞子を形成させる。菌体を、平板培地上に滴下した殺菌水に懸濁し、平板上に懸濁液を広げる。胞子懸濁液が乾いた後に、ミクロマニピュレータシステムを用いて、ガラス針で胞子を単離する。
【００１６】
上記のようにして得られる子嚢形成率の低下した株は、実際に菌体外多糖を効率よく生産することを確認しておくことが好ましい。菌体外多糖の生産性は次のようにして調べることができる。単胞子分離を繰り返して得られた株を適当な培地で培養する。培養液を遠心分離し、上清を０．０１Ｍ酢酸で洗浄し短冊状に切断した濾紙（例えば東洋濾紙 Ｎｏ．５０）にスポットし、エチル酢酸：酢酸：ピリジン：水（５：１：５：３ Ｖ／Ｖ）混合液で３〜５時間展開させる。この濾紙を風乾し、多糖部分（出発点の前後約１ｃｍ）を切り取って試験管に入れ、蒸留水１ｍＬを添加する。試験管をタワーミキサーを用いて４〜６時間撹拌し、フィルター（０．４５μｍ）を通して繊維を除去する。濾液１００μＬを試験管に取り、２．５％フェノール液２ｍＬを添加し、ビューレットで一定の高さから濃硫酸５ｍＬを加える。１０分間放置した後、よく混合し、更に３０℃で１５分冷却し、撹拌せずに４９０ｎｍで吸光度を測定する。
【００１７】
菌体外多糖を高効率で生産するリポマイセス属に属する微生物は、上記のように、子嚢形成率の低い株を継代的に選択する方法の他、リポマイセス属に属する微生物を突然変異処理し、子嚢形成率の低い株を選択することによっても得られる。
【００１８】
なお、本発明において菌体外多糖高生産株を育種する際に、子嚢形成率が親株に比べて低下していれば特に低下の程度に制限はないが、後述の算出方法（数１式）により子嚢形成率は５％以下であることが好ましく、実質的に子嚢を形成しなくなったものがさらに好ましい。
【００１９】
後記実施例１に示すように、上記のようにして得られたリポマイセス スタルキーの実質的に子嚢を形成しない株、すなわち菌体外多糖高生産株は、リポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４２７６の受託番号で寄託されている。
【００２０】
＜２＞菌体外多糖の製造法
上記のようにして得られる菌体外多糖高生産株を培養し、培養液中に菌体外多糖を生成蓄積させ、この培養液から多糖を回収することによって、従来の方法よりも効率よく菌体外多糖を製造することができる。本発明の方法においては、リポマイセス属に属する微生物として菌体外多糖高生産株を用いる以外は、従来知られている方法（特開平５−３１１１６９号公報等）と同様にして菌体外多糖を製造すればよい。すなわち、菌体外多糖高生産株を適当な培地（例えば後述のＣＧ−Ｔ培地等）で培養し、培養液を遠心分離して菌体を除去し、培養上清を濃縮した後イソプロパロールを２倍量加えて多糖の沈殿を生じさせ、遠心分離により沈殿を集めて乾燥させる。
【００２１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。尚、本実施例で使用した培地に組成を以下に示す。
【００２２】
【表１】
尚、コーンミール培地（以後、ＣＭ培地という）は、コーンミールを水と混合し、６０℃で１時間加熱撹拌し、濾紙で濾過後、寒天及び水を最終量まで加え、１１５℃で１５分オートクレーブした後、脱脂綿で濾過し、さらに１１５℃で１５分オートクレーブすることにより調製される（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ， Ｊ． Ｐ．， ａｎｄ Ｙａｒｒｏｗ， Ｄ． ”Ｔｈｅ ｙｅａｓｔｓ， ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ” ｅｄ． ｂｙ Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ−Ｒｉｊ， Ｎ． Ｊ． Ｗ． Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｐ．７１ （１９８４）：）。あるいは、コーンミールを水と混合し、クリーム状にして沸騰直前の状態で１時間加熱し、チーズクロスで濾過後、寒天を溶解し、水を最終量まで加え、１１５℃で３０分オートクレーブしてもよい（「微生物学実験法」講談社 ４３６頁）。また、市販の培地を使用してもよい。
【００２４】
【実施例１】菌体外多糖高生産株の育種
（１）単胞子分離株の取得
リポマイセス スタルキーＣＢＳ １８０７株あるいはＩＦＯ １０３８１株から単胞子分離を行った。
【００２５】
ＹＭ寒天培地に保存しておいたリポマイセス スタルキーＣＢＳ １８０７株あるいはＩＦＯ １０３８１株をＹＭ寒天培地で前培養（２２℃ ５日）し、これをＣＭ培地に接種して胞子形成（２２℃ ２１日）させた。尚、ＩＦＯ １０３８１株はＣＢＳ １８０７株から移管された株でありカタログ上は同一株であるが、以下に示すように子嚢形成率は異なっている。
【００２６】
ＹＭ寒天プレート上に殺菌水を１〜２滴滴下し、ここに胞子形成させたリポマイセス スタルキーＣＢＳ １８０７株あるいはＩＦＯ １０３８１株の菌体を懸濁した。次に培地を斜めにして懸濁液を帯状に流動させた。以上の操作は無菌的に行った。
【００２７】
次に、予めミクロマニピュレータシステム（顕微鏡：ＯＬＹＭＰＵＳ製 ＩＭＴ−２、ジョイスティクマニピュレータ：ナリシゲ製 ＭＮ−１５１）を設置したアクリルフード内をＳＳ−ＭＡＣフィルターユニット（ＭＡＣ−１０Ｆ型 日本エアテック製）で１５分以上通気して無菌的にし、上記の胞子懸濁液が乾いた後に通気しながら同プレートで複数の胞子を、ガラス針を用いて単離した。このガラス針は、硝子管（ナリシゲ製Ｇ−１）を火炎上で赤熱、伸長して作成した。
【００２８】
（２）継代的単胞子分離
上記のようにして得られたリポマイセス スタルキーＣＢＳ１８０７株及びＩＦＯ １０３８１株の単胞子分離株から胞子を形成させ、再び単胞子分離株を得る手段を繰り返し（以後この操作を「継代的単胞子分離」と呼ぶ）、その結果として子嚢形成能に変化が現れるかを調べた。
【００２９】
継代的単胞子分離は次のようにして行った（図１参照）。ＹＭ寒天培地を用いて２２℃で４日培養した単胞子分離株をＣＭ寒天培地に接種し、２２℃で２１日培養して胞子形成させた。ここで前記と同様にしてＹＭ寒天培地上で単胞子分離を行い、分離された胞子１０個をＹＭ寒天プレート上に接種した。２２℃で１０日培養して得られたコロニーから３コロニーを無作為に選択し、これらのコロニーから菌体を一白金耳づつ取り、直径約２ｃｍの円状となるように１枚のＣＭ寒天培地に接種し、２２℃で２１日培養した後、子嚢形成率を下記式により算出した。ここで、栄養細胞と分離した子嚢は、母体となった栄養細胞が存在していたと考えて計数した。
【００３０】
尚、子嚢と母細胞の分離を極力避けるために、菌体の懸濁は慎重に行った。
【００３１】
【数１】
子嚢形成率 ＝ （ 子嚢を形成した栄養細胞数 ／ 全栄養細胞数 ）×１００
【００３２】
上記操作を繰り返すことにより、継代的単胞子分離を行った。この際、子嚢形成率のさらに低い菌株（低率株）を作為的に選抜して継代を行う系と、その反対に子嚢形成率のさらに高い菌株（高率株）を作為的に選抜して継代を行う系とに分けて行った。ＣＢＳ １８０７株及びＩＦＯ １０３８１株を親株とした子嚢形成率の変化を図２に示した。
【００３３】
継代を繰り返して得られた低率株と高率株および親株を接種菌として、「エタノール培地」（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ， Ｊ． Ｐ．， ａｎｄ Ｙａｒｒｏｗ， Ｄ． ”Ｔｈｅ ｙｅａｓｔｓ， ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ” ｅｄ． ｂｙ Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ−Ｒｉｊ， Ｎ． Ｊ． Ｗ． Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｐ．７１（１９８４））、ＹＭ寒天培地、１／１０濃度のＹＭ寒天培地と比較対象としたＣＭ培地で、それぞれ２２℃で２１日培養して子嚢形成率を算出した結果を表２に示す。尚、表２中の系列は、図２中の系列を表す。
【００３４】
【表２】
図２から明らかなように、ＣＢＳ １８０７株及びＩＦＯ １０３８１株のいずれにおいても低率株を選択的に取得し続けると、子嚢をほとんど作らない菌株が得られた。しかし、高率株を取得し続けた場合には、ある程度の向上はみられるものの、栄養細胞の大部分が子嚢を作る程度にまでは向上しなかった。ＩＦＯ １０３８１の由来はＣＢＳ １８０７であるが、それぞれを親株としてＣＭ培地で子嚢形成させると、両者の子嚢形成率に１０％内外の差が見られた。そしてそれぞれから高率株を求めたところ、Ｄ系列（ＣＢＳ １８０７）とＥ系列（ＩＦＯ １０３８１）に見られるようにさらに大きな差が生じた（図２）。
【００３６】
また、表２に示したように、継代化によって子嚢形成率が極端に低くなった菌株を、エタノール培地、ＹＭ培地、及び１／１０ＹＭ寒天培地に接種しても子嚢形成は認められなかった。一方ＣＭ培地で子嚢を良く作る菌株はＹＭ培地、１／１０ＹＭ培地等でも子嚢を作ることが分かった。しかし、エタノール培地ではどの菌株も子嚢は形成しなかった。
【００３７】
リポマイセス スタルキーＣＢＳ １８０７株を共通の親株とする低率株（Ａ系列１０代目）と高率株（Ｄ系列１４代目）をＹＭ寒天培地に２２℃で２１日培養した菌体を顕微鏡観察した。その結果、子嚢をほとんど作らない菌株は、高率株に比べて脂肪球は極めて小さく、菌体のサイズもやや小さかった。
【００３８】
（３）継代的単胞子分離株の子嚢形成率と菌体外多糖生産量との関連性
継代的単胞子分離に平行して各々の分離株について、菌体外多糖の生産性をプレート上での観察により評価した。ＹＭ寒天培地に２２℃で４日培養した親株と低率株および高率株の菌体を、３区画に分けた１枚のＹＭ寒天培地およびＣＭ寒天培地の各プレートにそれぞれ１白金耳ずつ接種した。ＹＭ寒天培地では接種後２２℃で７日培養したコロニーの状態、ＣＭ寒天培地では接種後２２℃で２１日培養したコロニーの状態を観察した結果、一般に、ＣＭ培地上で子嚢形成率が高い菌株（ＣＭ培地上では多くの栄養細胞が子嚢を形成した結果、コロニーが茶色く観察された）ほどドライなコロニーを形成することがわかり、見掛上菌体外多糖の生成量は少なかった。同様に、ＹＭ培地上でも子嚢形成率が低いほど菌体外多糖の生成量が多く観察された。
【００３９】
一方、親株（ＩＦＯ １０３８１）と低率株（Ｆ系列１０代目）及び高率株（Ｅ系列０代目）を液体培地中にて培養したときの菌体外多糖の生産量を測定した。培養は、５００ｍＬ容振盪フラスコに１００ｍＬのＣＧ−Ｔ培地を分注して加熱殺菌した後、ＹＭ寒天培地上に２８℃で４日間培養して得た菌体を一白金耳量接種し、２９．５℃にて２００時間、１２０ｒｐｍで振盪することにより行った。
【００４０】
培養液を遠心分離し、上清を０．０１Ｍ酢酸で洗浄し短冊状に切断した濾紙（例えば東洋濾紙 Ｎｏ．５０）にスポットし、エチル酢酸：酢酸：ピリジン：水（５：１：５：３ Ｖ／Ｖ）混合液で３〜５時間展開させた。この濾紙を風乾し、多糖部分（出発点の前後約１ｃｍ）を切り取って試験管に入れ、蒸留水１ｍＬを添加した。試験管をタワーミキサーを用いて４〜６時間撹拌し、フィルター（０．４５μｍ）を通して繊維を除去した。濾液１００μＬを試験管に取り、２．５％フェノール液２ｍＬを添加し、ビューレットで一定の高さから濃硫酸５ｍＬを加えた。１０分間放置した後、よく混合し、更に３０℃で１５分冷却し、撹拌せずに４９０ｎｍで吸光度を測定した。このようにして測定された菌体外多糖の生産量を表３に示す。
【００４１】
【表３】
表３に示すように、継代的単胞子分離株の子嚢形成率の低下に伴い、菌体外多糖生産量の向上が認められた。
こうして得られたリポマイセス スタルキーの低率株すなわち菌体外多糖高生産株はリポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４２７６の受託番号で寄託されている。
【００４３】
【実施例２】菌体外多糖高生産株を用いた菌体外多糖の製造
リポマイセス属酵母の培養液には、菌体外多糖の他に、培地の成分であるＭｇ２＋、ＮＨ４ ＋のようなイオン類、培養途中で死滅した菌体から出た中性脂肪やリン脂質などの脂質類、酵素などの可溶性蛋白質、不溶性の酵母細胞破片などが多く含まれている。本実施例では、遠心分離、透析、アルコール沈澱など多糖類の分離精製によく用いられる簡単な操作を利用して、これらの夾雑物を除去し、培養液から菌体外多糖を分離、精製した。
【００４４】
（１）菌体外多糖の分離精製
実施例１で得たリポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５株を、本発明者らが開発したＣＧ−Ｔ培地（表１）を用いて約１４０時間振盪培養した（２９．５℃、１２０ｒｐｍ）。
【００４５】
上記で得られた培養液から、次のようにして菌体外多糖を分離精製した。培養液を３０００×ｇで１０分遠心分離（ＨＩＴＡＣＨＩ ２０ＰＲ−５２Ｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、上清を回収した。菌体を除いた培養液（菌体外多糖を１５．８ｇ／Ｌ含む）上清１Ｌに１０ｇのセライト（ｃｅｌｉｔｅ）を添加し、充分に撹拌した後、３０００×ｇで遠心分離を行い、得られた上清をさらに濾紙（東洋濾紙Ｎｏ．２）で吸引濾過した。濾液をフラッシュエバポレータ（ＴＯＫＹＯＲＩＫＡ Ｔｈｉｎ Ｆｉｌｍ Ｆｌａｓｈ Ｅｖｅｒｐｏｒａｔｅｒ ＭＦ−５）を用いておよそ１０倍に濃縮した。
【００４６】
濃縮液を、セロファンチューブ３０／３２（和光純薬工業株式会社）に入れ、流水に対して１２時間透析した後、更に脱イオン水と蒸留水に対して各々１２時間の透析を行った。透析液をイソプロパノールと１：２（Ｖ／Ｖ）の割合で混合し、Ｃａ２＋を０．０００６ｍｏｌ／Ｌとなるように添加して氷で冷却した後、３０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離し、沈澱を集めた。
【００４７】
沈殿を少量の蒸留水に溶解し、ナス型フラスコに分注し、約４０時間凍結乾燥機（ＹＡＭＡＴＯ ＦｒｅｅｚｅＤｒｙｅｒ Ｍ−ＤＣ３ ５）で凍結乾燥を行った。こうして分離、精製された菌体外多糖の収量は、１０．５ｇであった。
【００４８】
（２）菌体外多糖の分析
上記のようにして精製された多糖類を蒸留水に溶解して５０ｍＬとした後、この溶液と培養液のＫ＋、Ｍｇ２＋及びＮＨ３−Ｎの濃度を測定し、精製の程度を調べた。Ｋ＋及びＭｇ２＋の濃度の測定は、原子吸光・炎光分光光度計を用いて行った。ＮＨ３−Ｎの濃度の測定は、市販のキット（Ａｍｍｏｎｉａ−Ｔｅｓｔ（藤井・奥田法変法）キット：和光純薬株式会社製）を用いて行った。結果を表４に示す。さらに、精製された多糖類を濃硫酸で加水分解し、Ｓｅｍｉｍｉｃｒｏ Ｋｊｅｌｄａｈｌ法（「京都大学農学部農芸化学科農芸化学実験書」（１９６７）１３１〜１３５頁（産業図書））でタンパク質の含量を調べた結果、０．３％であった。
【００４９】
【表４】
この結果に示されるように、上記の分離、精製処理において、培養液へのセライトの添加と遠心分離により、培養液中の不溶物が除かれ、さらに透析することによって培地中の塩類、低分子の糖、アミノ酸、色素等を除くことができた。また、イソプロピルアルコールを用いた沈殿法により、残存する可溶性物質及び脂質を除去することができた。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、菌体外多糖を高効率で生産するリポマイセス属酵母が得られる。また、本発明により得られる菌体外多糖高生産株を用いることにより、土壌改良剤等として有用な多糖を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】継代的単胞子分離の概念図。
【図２】リポマイセス スタルキー ＣＢＳ １８０７株及びＩＦＯ １０３８１株の継代的単胞子分離における子嚢形成率の変化を示す図。
Claims (6)
- リポマイセス属に属する微生物から子嚢形成率の低い株を選択することを特徴とするリポマイセス属菌体外多糖高生産株の育種法。
- 請求項１において、
（ａ）リポマイセス属に属する微生物の子嚢から単胞子を分離し、
（ｂ）分離した単胞子を発芽生育させて子嚢を形成させ、
（ｃ）子嚢形成率の低い株を選択してその株から単胞子を分離し、
上記（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことによって子嚢形成率の低い株を選択することを特徴とする菌体外多糖高生産株の育種法。 - リポマイセス属に属する微生物が、リポマイセス スタルキーであることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
- 実質的に子嚢を形成しないリポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２７６）株。
- リポマイセス属に属する微生物を培養し、培養液中に菌体外多糖を生成蓄積させ、この培養液から多糖を回収することによってリポマイセス属に属する微生物の産生する菌体外多糖類を製造する方法において、
前記リポマイセスに属する微生物は、請求項１〜３記載の方法により選択された菌体外多糖高生産株であることを特徴とする方法。 - 前記菌体外多糖高生産株が、リポマイセス スタルキー ＡＪ１４６９５（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２７６）株であることを特徴とする請求項５記載の方法。
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