DE2363285B2 - Verfahren zur Herstellung von 1-Apfelsäure aus Fumarsäure - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 1-Apfelsäure aus Fumarsäure

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description

Es ist bekannt, daß 1-Apfelsäure gemäß der folgenden Umsetzung
Fumarat + H2O -♦ 1-Malat
erhalten werden kann, wobei die Umsetzung durch das Enzym Fumarase (Fumarathydratase oder 1-Malathydrolyse) katalysiert wird. Die Umsetzung kann in beiden Richtungen verlaufen, so daß es möglich ist, Fumarsäure aus 1-Apfelsäure und I-Apfelsäure aus Fumarsäure herzustellen.
Im allgemeinen wird Fumarase aus Schweineherz extrahiert und aus vielen Mikroorganismen der verschiedenen Arten wie Corynebaceterium, Microbacterium, Proteous, Escherichia, Micrococcus, Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, Candida, Aspergillus, Saccharomyces gewonnen.
I-Apfelsäure, die auf solche Weise erhalten wird, muß dann einem neuen Reinigungsverfahren unterworfen werden, damit man ein Produkt erhält, das den Reinheitsgrad besitzt, der für seine Verwendung erforderlich ist.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, hochreine 1-Apfelsäure herzustellen, ohne daß eine Reinigungsbehandlung erforderlich ist Überraschenderweise wurde gefunden, daß man durch ein Fermentationsverfahren 1-Apfelsäure in hoher Reinheit
s herstellen kann, wenn man als Fumiarase-Quelle den Stamm Paracolobactrum aerogenoides No. 743 (= CBS No. 405.73) verwendet
Die Erfindung betrifft daher den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
ίο Der Stamm Paracolobactrum aerogenoides No. 743 wurde aus gemahlenen landwirtschaftlichen Bodenproben isoliert und besitzt die im folgenden beschriebenen Eigenschaften. Er wurde hinterlegt bei dem Central Bureau Voor Schimmelcultures-Baarn-Holland und mit der Nummer CBS 405.73 versehen.
Mikroskopische Morphologie
Einzelne, kleine Stiele, 0,5 bis 0,8 χ 1,0 bis 2,0 Mikron, ohne Kapseln und Sporen, nicht mobil, gram-negativ.
Makroskopische Morphologie
Kolonien auf Nähragar
dick, weiß, vollständig, feucht, schleimabsondernd.
Kultur auf Nährmedium
trübe, mit Membranenhäutchen und reichliche
Abscheidung.
Schrägplatten auf Nähragar
reichlich, fließend, weiß, feucht, metallischer Glanz bzw. metallisches Leuchten.
jo Infusion in Nährgelatine
dick, weiß, feucht, fließend auf der Oberfläche, ohne Verflüssigung.
Biochemische Eigenschaften: Säure und Gas aus Glucose, Fructose, Galactose, Arabinose, Maltose, !5 Mannit, Stärke. Lactose wird innerhalb von 30 Tagen nicht fermentiert Citrat wird als Kohlenstoffquelle verwendet. Methylrot-Versuch: negativ. Voges-Proskauer-Versuch: positiv. Indol: negativ. H2S: negativ. Nitrite gebildet durch Nitrate. Katalyse: positiv. 4Ci Lackmusmilch: Ansäuerung unter Koagulation, keine Peptonisierung. Wachstumsbedingungen: Sie wachsen gut auf Labormedien, die optimale Temperatur beträgt ungefähr 25° C, aerob (fakultativ anaerob).
Vergleicht man die zuvor erwähnten Eigenschaften mit den Beschreibungen in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Auflage, so gehören der Stamm zu:
Familie: Enterobacteriaceae
Tribus: Escherichieae
Genus: Faracoiobactrum
Species: Paracolobactrum aerogenoides.
Erfindungsgemäß wird 1-Apfelsäure auf fermentativem Weg hergestellt, indem man einen der zuvor erwähnten Bakterienstämme verwendet und indem man als Kulturmedium eine Salzlösung, die Stickstoff- und Kohlenstoffquellen in Anwesenheit des Fumarats enthält, verwendet.
Die Mikroorganismen können unter aeroben Bedin-
w) gungen in Kulturmedien kultiviert werden, die Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalze enthalten, bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 400C, bevorzugt im Bereich von 28 bis 300C, während Zeiten von 18 bis 36 Stunden, bevorzugt 24 Stunden, und bei
β5 pH-Werten von 5,5 bis 8, bevorzugt bei pH 7.
Als Kohlenstoffquelle kann man verwenden Glucose, Stärke, Glycerin und Melasse. Das Substrat (Fumarsäure) wird in Konzentrationen von 1 bis 5% zugegeben,
bevor der pH-Wert mit Natriumhydroxyd eingestellt wird. Als Stickstoffquelle kann man verwenden Pepton, hydrolysierte Derivate von Casein oder Sojabohnen, Ammonium- oder Natriumnitrate, Ammoniumsulfat oder -phosphat, Getreide- oder Maiseinweichwasser (CSL) sog. »corn Steep-liquor«, Mazlextrakt usw.
Die Ausbeute an 1-Apfelsäure wird erhöht, wenn die Belüftung vermindert wird. Wie oben erwähnt, werden die Zellen bei der Fermentation gewonnen und sie werden als solche bei der enzymatischen Reaktion eingesetzt Werden Bakterienzellen bei der enzymatischen Umwandlung von Fumarat in Malat verwendet, so werden sie in Medien, die ähnlich sind wie die des Fermentationsverfahrens kultiviert
Als Kohlenstoffquelle kann man verwenden Glucose, Stärke, Glycerin, Melassen, Fumarat, Tartrat Citrat oder Acetat in Konzentrationen von 1 bis 5%. Sonst kann man ebenfalls die Extrakte dieser Zellen verwenden. In einem solchen Fall werden die Zellen nach einem der bekannten Verfahren gebrochen, und man verwendet den Rohextrakt oder den teilweise gereinigten Extrakt der das Enzym enthält
Die Enzymdosierung kann entsprechend den in den naturwissenschaftlichen Publikationen beschriebenen Verfahren erfolgen. Eine Einheit entspricht der Enzymmenge, die in 1 Minute bei einer Temperatur von 25°C eine O. D.-Änderung von 0,001 ergibt. Die Apfelsäure wird auf spektrometrische Weise entsprechend dem in Modem Food Analysis (Hart-Fisher 1971) beschriebenen Verfahren mit Schwefelsäure und 2,7-Naphthalindiol dosiert bzw. bestimmt (O. D. = optische Dichte).
Die Proteine werden auf spektrophotometrische Weise mit Differentialablesungen bei 224 bis 233 mm gegenüber einer Standardkurve mit bekannter Albuminkonzentration bestimmt Die spezifische Aktivität wird als Einheiten/mg Protein angegeben.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung
Beispiel 1
Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung wird hergestellt:
Fumarsäure 20 g/l
Glucose 20 g/l
Hefeextrakt 1 g/l
NaNO3 5 g/l
K2HPO4 2 g/l
MgSO4 · 7 H2O 0,5 g/l
Poiyoxyäthyiensorbitan-monooieat 1 g/l
Die zuvor erwähnten Produkte werden in entmineralisiertem Wasser gelöst und mit Natriumhydroxyd wird der pH-Wert der Lösung auf 7 eingestellt. Man sterilisiert während 20 Minuten bei 1100C. Das Medium wird in 500-ml-Kolben mit einem breiten Hals gegeben, wobei man 100 ml Medium in jeden Kolben füllt. Die Kolben werden mit einer Suspension des Stammes 743, die man während 24 Stunden bei 30° C auf Schrägplatten mit Nähragar gezüchtet hatte, inokuliert. Die optische Dichte der Bakteriensuspension, die als Inokulierungsmittel verwendet wird, verdünnt auf 1/10, beträgt 0,200 bei 550 nm.
Die Inkubation wird unter orbitalem Rühren bei 3°C wä hrend 88 Stunden durchgeführt.
In dem Fermentationsmedium verbleiben 4,5 g/l Fumarsäure und 17,25 g/l 1-Apfelsäure werden gebildet, was einer Ausbeute von 75% entspricht.
Beispiel 2
Man verwendet eine Laborfermentaüonsvorrichtung mit einer Kapazität von 201, die mit vier im Wasser liegenden Ablenkblechen und einer Turbine mit acht Flügeln ausgerüstet ist und die 171 des folgenden Mediums enthält:
Fumarsäure
Hefeextrakt
NaNO3
K2HPO4
MgSO4 · 7 H2O
20 g/l
lg/1
5 g/l
2 g/l
0,5 g/l
in entmineralisiertem Wasser und deren pH-Wert mit Natriumhydroxyd auf 7 eingestellt ist und die während 20 Minuten bei 110° C sterilisiert wird. Man inokuliert mit 340 ml (=2%) einer Kultttr von 24 Stunden bei 30°C des Stammes 743.
Die optische Dichte der Präkultur, verdünnt auf 1/10, bei 550 nm beträgt 0,200. Die Fermentation wird bei 300C während 23 Stunden mit einer Belüftung von 0,1 Vol/Vol/min durchgeführt Man erhält unter solchen Bedingungen 10 g feuchter Zellen/l Kultur.
15 g der erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,01 m Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,05 Mol Fumarsäure (neutralisiert mit Natriumhydroxyd) enthält suspendiert. Die Mischung wird bei 200C gerührt Nach 5 Stunden werden 1,76 g Fumarsäure und 2,6 g 1-Apfelsäure festgestellt was einer Ausbeute von 39% entspricht.
Beispiel 3
15 g der nach Beispiel 2 erhaltenen Zellen werden in 50 ml 0,01 m Phosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert. 250 ml kaltes Aceton werden zu der Suspension zugegeben. Der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und im Vakuum (15 mm Hg, Zimmertemperatur, 18 Stunden) getrocknet 15 g feuchte Zellen ergeben 2,5 g trockene Zellen. 2,5 g der trockenen Zellen werden in 100 ml 0,01m Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,05 Mol Fumarsäure (neutralisiert mit Natriumhydroxyd) enthält, suspendiert. Die Reaktionsmischung wird bei 20°C gerührt. Nach 4 Stunden verbleiben 1,58 g Fumarsäure und 4,9 g 1-Apfelsäure wurden gebildet, was einer Ausbeute von 73,2% entspricht.
Die Zellen werden aus der Reaktionsmischung durch Zentrifugieren abgetrennt und erneut in 100 ml Puffer zusammen mit Fumarsäure, wie oben boschrieben, suspendiert. Nach 6 Stunden bei 2O0C verbleiben 1,58 g Fumarsäure und 4,9 g 1-Apfelsäure sind gebildet, was einer Ausbeute von 73,2% entspricht.
Beispiel 4
1,5 g Zellen, erhalten gemäß Beispiel 2, werden in 2 ml Phosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert und Ultraschallwellen während 7 Minuten (MSE, 7 Mikron) ausgesetzt. 2 ml des überfließenden Materials werden nach der Zentrifugation abgetrennt, sie enthalten 92 mg Proteine.
Diese 2 ml werden zu 100 ml Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,05 Mol Fumarsäure (neutralisiert mit Natriumhydroxyd) enthält, gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 20° C gerührt. Nach 11 Stunden verbleiben 1,38 g Fumarsäure und es haben sich 5,05 g 1-Apfelsäure gebildet, was einer Ausbeute von 76% entspricht.
Beispiel 5
500-ml-Kolben mit breitem Hals, die 100 ml der Grundkultur und zugefügt verschiedene Kohlenstoffquellen (Glucose, Natriumfumarat, Tartrat, Citrat und
Acetat) in 10 g/l-Konzentrationen enthalten, werden mit 1 ml einer Suspension des Stammes 743 inokuliert und während 24 Stunden bei 30° C unter orbitalem Rühren inkubiert Die Zellen werden dann Ultraschallwellen bei einer Temperatur, die niedriger ist als 10° C während 7 Minuten ausgesetzt
Die Bestimmungen der enzymatischen Aktivität wurden mit dein Rohextrakt (überfließendes Material des zuvor erhaltenen Produktes) bei 20° C durchgeführt
Das Naßgewicht der Kulturen, die gebildeten ■j Eniymeinheiten und die spezifischen Aktivitäten sind in der folgenden Tabelle aufgeführt
KohlenstofTquelle Naßgewicht/100 ml Einheit/100 ml Spez. Aktivität
Kulturmedium Kulturmedium Einheit/mg Protein
(g)
Glucose 1,2 13 000 300
Natriumfumarat 1,2 32 000 445
Natriumtartrat 1,0 25 000 405
Natriumeitrat 0,65 10 000 228
Natriumacetat 0,35 12 000 382

Claims (7)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von I-Apfelsäure aus Fumarsäure durch Fermentation unter Verwendung des Stammes Paracolobactrum aerogenoides No. 743 (= CBS Nor. 405.73).
2. Verfahren zur Herstellung von 1-Apfelsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem Kulturmedium durchführt, welches eine Salzlösung enthält, die Stickstoff- und Kohlenstoffquellen in Anwesenheit von Fumarat enthält
3. Verfahren zur Herstellung von 1-Apfelsäure nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle Glucose, Stärke, Glycerin oder/und Melassen verwendet
4. Verfahren zur Herstellung von 1-Apfelsäure nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stickstoffquelle Pepton, hydrolysierte Derivate von Casein und Sojabohnen, Ammonium- oder Natriumnitrate, Ammoniumsulfat oder -phosphat, Mais- oder Getreideeinweichflüssigkeit oder/und Malzextrakt verwendet
5. Verfahren zur Herstellung von 1-Apfelsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation während einer Zeit von 18 bis 36 Stunden und bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8 durchgeführt wird.
6. Verfahren zur Herstellung von 1-Apfelsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 400C in einem Kulturmedium durchgeführt wird, das Glucose als Hauptkohlenstoffquelle und 1 bis 10% Fumarsäure enthält.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Fermentation durch Abtrennung der Bakterienzellen aus dem Fermentationsmedium, das Fumaraseenzym gewinnt und anschließend mit der Fumarsäure umsetzt.
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